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ESTEFANIA ROJAS RAYO

NORMA ISABEL MURILLO ACEVEDO
VALERIA VICTORIA SANCLEMENTE

Universidad Icesi
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Bioquímica
Laboratorio de Biocatálisis
Santiago de Cali, Colombia
(10 de septiembre de 2021)
estefaniarojasrayo@hotmail.com- Valeritavictoria04@gmail.com

1. Introducción Molecular (UIBBM.) las proteasas reciben el

Para realizar estudios de proteínas existen
diferentes métodos de cuantificación que
pueden ser usados, uno de ellos es el método
de Bradford, el cual permite la estimación
rápida de la concentración de proteínas totales
en muestras biológicas de experimentación.
Este método se basa en una reacción
colorimétrica de proteínas con un tinte,
Coomassie Azul Brillante G-250. Las
proteínas se unen al tinte en un ambiente ácido
mediante fuerzas de van der waals e
interacciones electrostáticas, induciendo un
cambio espectral del color marrón al azul. El
aumento de absorbancia en este espectro es
directamente proporcional al número de
uniones entre el colorante y las proteínas, así
que se puede estimar cuánta proteína hay por
mililitro de medio líquido. [1]
La calibración puede realizarse en principio
con cualquier preparado de proteínas
homogéneo y lo más puro posible. Como
sustancia de referencia se utilizó la albúmina
de suero bovino (BSA), está en comparación
con la mayoría de las otras proteínas, conduce
a una intensidad de color aproximadamente el
doble en el ensayo estándar. [2]
Para el desarrollo del estudio de proteínas en
muestras comerciales se utilizó la enzima
proteasa, de acuerdo con la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología
código EC 3.4, por ser hidrolasas que catalizan
la ruptura de los enlaces peptídicos [3]. Las
proteasas son herramientas de uso común en la
investigación proteómica y adecuadas para digerir
proteínas en pequeños fragmentos peptídicos .
Debido a su amplia variedad de características
fisiológicas, como la hidrólisis a pH extremos
o a temperaturas elevadas, son ideales para
utilizar en los sectores farmacéutico con
aplicación en diagnóstico, industria textil y de
alimentos sólidos y líquidos. [4]
Las bacterias tienen mayor producción de
proteasas en comparación como otros
organismos como los hongos, debido a su fácil
manipulación a nivel genético y crecimiento
rápido en espacios limitados. En este aspecto,
especies del género Bacillus son las
principales productoras de proteasas
extracelulares. [5] El precio de la proteasa a
nivel comercial de acuerdo con el laboratorio
Merck de proteasa de Bacillus sp. Liquida, 16
>U/g por 50 ml es de $125.00 USD. [6]
Por otro lado, se evalúa también la
cuantificación total de proteínas en extracto de
levadura, este se compone aproximadamente
de 60% de una mezcla de proteínas y
aminoácidos, su producción consiste en la
acción de las enzimas de la célula de levadura,
que rompen por sí mismas el contenido de las
células, eliminando así la pared de la célula de
levadura. Este extracto aporta notas
específicas y/o sabores como el umami en
aplicaciones alimentarias por lo que permite
responder a las numerosas necesidades de
formulación de los fabricantes de productos
alimentarios. [7]. Así mismo el precio por 1,10
Lb de extracto de levadura es de 129,43 US de
la marca MilliporeSigma para uso
microbiano. [8]
Con relación a esto existen diferentes métodos
de seguimiento de ensayos enzimáticos. Uno
de los más empleados es El método DNS
(ácido dinitrosalicílico) esta es una técnica
colorimétrica que emplea un procedimiento
que se basa en una reacción redox que ocurre
entre el DNS y los azucares reductores
presentes en la muestra. Esta técnica sirve para
cuantificar los azucares reductores producidos
durante una fermentación o para cuantificar
los productos de una reacción enzimática.
El objetivo de la presente práctica es emplear
la metodología de Bradford para cuantificar la
proteína total de muestras de enzimas
comerciales y extracto de levadura; además,
utilizar el método del DNS para evaluar el
cambio en la concentración de azúcares
reductores.
2. Materiales y metodología
Concent
ración
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
de BSA
(mg/mL)
Volumen
solución
0 200 400 600 800 1000
BSA
(µL)
Volumen
de agua
1000 800 600 400 200 0
destilada
(µL)
Volumen
total 1000 1000 1000 1000 1000 1000
(µL)
Tabla 1 materiales e instrumentas requeridos
MATERIALES
Eppendorf de 1.5ml (15)
Tubos de 20ml (7)
Micropipeta de 20-200 μL
Micropipeta de 100-1000 μL
Pipeteador (x1)
Beaker de 20 mL (2)
Gradilla tubos de 20ml (1)
Cronómetro
Pipeta de 5 mL (1)
Tabla 2 Reactivos requeridos
REACTIVOS
Extracto de levadura (0,2gr)
Albumina (BSA, 5 mL): 1 mg/mL
Proteasa comercial (0.2 gr)
Reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico)
(5 mL)
Reactivo azul de Coomasie: 20 mL
Solución de glucosa a 2mg/ml (5ml)
Para llevar a cabo la práctica, se prepararon 6
soluciones de albúmina (BSA) como estándar, con
diferentes concentraciones (0.0mg/mL hasta
1mg/mL) a partir de la solución de 1 mg/mL
de BSA para obtener una solución con
volumen final de 1000uL cada una. Para
determinar los volúmenes adecuados de
solvente (agua destilada) se utilizó la ecuación
1, los resultados se describieron en la tabla 3.
El procedimiento posterior se encuentra
descrito se encuentra detallado en la gráfica 1
Gráfico 1 Metodología soluciones BSA
Tabla 3 concentraciones de solución de albumina bovina
(BSA)
G
Después de realizar la calibración con la
solución de albumina como sustancia
referencia, se procede a realizar la medición
de proteínas en la muestra problema.
G
 Por lo tanto, si quisiéramos hallar el volumen
Gráfico 2 Metodología medición proteínas de muestra problema para la concentración de: 0,2 mg/mL el
procedimiento sería el siguiente:
Finalmente, para la elaboración de la curva de
1 mg/ml∗V 1=0,2 mg /mL∗1000uL
calibración de glucosa para el método DNS se
utilizó la ecuación 1 para la preparación de mg
0,2 ∗1000 ul
siete soluciones con concentraciones entre a mL
V 1=
partir de una solución stock de glucosa de 2 1mg /mL
mg/mL, los resultados se muestran en la tabla 4.
Posteriormente se realizó lo descrito en el V 1=200 uL
grafico 3

Como resultado tenemos el volumen de

Tabla 4 Solución BSA y al realizar la diferencia con el
volumen total, se obtiene que debemos añadir
Tabla 5
200 uL de agua destilada para alcanzar la
concentración y el volumen final.

Método de Bradford en solución BSA

G
Tabla
Gráfico 4 concentraciones
3 Metodología pruebadeDNS
solución de glucosa Los resultados obtenidos al medir la
Tabla 6 concentraciones de solución glucosa Concent
ración de
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.4
glucosa
(mg/mL)
Notas: Volumen
stock de
0 50 100 150 200 250 350
glucosa
(µL)
Volumen
de agua 500 450 400 350 300 250 150
(µL)
Volumen
500 500 500 500 500 500 500
total (µL)
absorbancia de las soluciones estándar de
albúmina (BSA) se muestran en la gráfica 4.
3. Análisis de resultados Los datos al linealizarlos se encuentran con
una función con la que se pueden predecir las
De acuerdo con lo expuesto en la metodología, concentraciones desconocidas.
la ecuación utilizada para determinar los
Cabe mencionar que, al realizar la curva de
volúmenes necesarios para determinadas
calibración, esta no presentaba una
concentraciones de las soluciones BSA fue la
intersección con el eje y esto puede deberse a
siguiente
errores experimentales como lo serían errores
C 1∗V 1=C 2∗V 2 (ec 1.) instrumentales o de manejo.

Donde C 2=0,2 mg/ mL y V 2=1000 uL


Gráfico 4: Absorbancia vs concentración de albúmina por
método Bradford
Se modificó la ecuación de la recta con el fin
de que esta pasara por el punto (0,0) como se
muestra en el gráfico 5, representado por la
línea roja, obteniendo una ecuación de la recta
diferente que no presenta inconvenientes al
hallar la concentración matemáticamente. Esto
se hizo bajo la justificación que de acuerdo
con la ley de Beer (ec.2) el término
correspondiente a b en la ecuación de la recta
( y=mx+b) teóricamente debe ser igual 0.
Debido a que al relacionar la ecuación
linealizada con la ley de Beer, podemos
darnos cuenta de que tiene la misma estructura
siendo 𝛼 ∗ 𝑙 la pendiente de la recta, y la
absorbancia y X la concentración
ley de beer
𝐴 = 𝛼 ∗ 𝑙 ∗ 𝐶 (ec. 2)
𝐴 = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝛼 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 extinción molar
𝑙 = 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎 = 1𝑐𝑚
𝐶 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ón
𝐴=𝛼∗𝑙∗𝐶
Y=m *𝐶
Además, se analiza que a medida que la
concentración es de mayor valor, así mismo,
incrementa la absorbancia obtenida. Lo
anterior se ve reflejado en la ley de Beer, que
estipula que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración, lo que
podemos ver reflejado en la gráfica 4
Gráfico 5: Absorbancia vs concentración de albúmina a) línea
de tendencia azul representa la recta resultada de los valores
experimentales b) línea de tendencia roja presenta ajuste
para pasar por punto (0,0)
Con estos valores de la gráfica se obtuvo la
siguiente ecuación de la recta.
y = 1,2537x
𝐴 = 1,2537[c] (ec.3)
A= Absorbancia
[c]= Concentración molar de la proteína
El coeficiente R dio un valor de 0,9773, este
posee un valor cercano a 1 indicando una
correlación fuerte y directa, un alto grado de
asociación lineal entre los datos graficados,
por lo tanto, si una variable aumenta la otra lo
hará también, por lo tanto, la absorbancia
aumenta a medida que la concentración lo
hace.
Posterior a la calibración por medio de
albúmina se midió la absorbancia (ver tabla 3)
de la proteasa y el extracto de levadura por
medio del método Bradford.
Ext.
Proteasa
Levadura
 Absorbancia #1 0,012 0,405 De acuerdo con lo anterior los resultados de la
concentración son los reportados en la tabla 6.
Absorbancia #2 0,021 0,507 Estos resultados de concentración son
Tabla 5 Absorbancia de proteasa y extracto de levadura por experimentales y pueden estar sujetos a error
método Bradford experimentales.
Con la ecuación (3) se puede encontrar la
Ext.
concentración de enzima de las dos muestras Proteasa
Levadura
problemas gracias a la absorbancia obtenida
por el método de Bradford. Concentració
0,00957 0,323
n #1 [M]
Extracto de levadura (muestra 1)
Concentració
y=1,2537 x 0.0167 0,404
n #2 [M]
1,2537 nm Tabla 6: concentración de proteasa y extracto de levadura
0,012 nm= x resultado de tratamiento de resultados tabla 3 con ecuación
mg 2
mL
mg
0,0095716 =x
mL Ahora bien, con estos valores se procedió a
cuantificar la exactitud por medio del error
Extracto de levadura (muestra 2) relativo, 𝐸𝑟 (ec. 3) y la precisión de los datos por
1,2537 nm medio de la desviación estándar (ec. 4).
0,021 nm= x
mg Para estos cálculos se tuvo en cuenta los valores
mL reales de proteína en la enzima proteasa: 0.2-0.5
mg mg/ml y en el extracto de levadura: 0.005-0.010
0,0167 =x mg/ml.
mL
Los cálculos para la determinación del error
relativo fueron los siguientes
Muestra de proteasa (muestra 1)
1,2537 nm Ea
0,405 nm= x Er= ∗100(ec.4)
mg μ
mL
Donde μ=valor real y Ea=
mg valor promedio de los datos experimentales−−valor real
0,323 =x
mL
Ea
Er .levadura= ∗100
μ
Muestra de proteasa (muestra 1) 0,01316−0,010
Er .levadura= ∗100
1,2537 nm 0,010
0,507 nm= x
mg Er .levadura=31%
mL
mg
0,404 =x 0,3635−0,35
mL Er . proteasa= ∗100
0,35
Er . proteasa=14 %

Analizando los resultados podemos decir que
los datos experimentales obtenidos de la
proteasa están más cercanos con un error
relativo de 14%, considerándolo menor al que
se obtuvo con el extracto de levadura con 31%
mostrando así una menor exactitud hacia los
valores reales
Mientras que la desviación estándar tuvo un
valor de
sd . levadura=
√ ∑ ( x−x )2 (ec.5)
n−1
variación (ec.6). Y se calculó el error
experimental por medio del error relativo
(ec.4). De acuerdo con los valores reportados
de desviación estándar los valores
experimentales encontrados para la levadura
son más precisos que los encontrados con la
proteasa. Teniendo en cuenta la anterior,
aunque la levadura cuenta con datos más
precisos son más inexactos. También se puede
tener en cuenta el coeficiente de variación que
genera valores entre 0-1, por ende, para ambos
grupos de datos hay una alta consistencia ya
que ambos coeficientes de variación son
menores a 0.5. Este resultado se puede generar
por diferentes factores. Primero error

√
2 2
( 0,00957−0,01316 ) + ( 0,0167−0,01316 ) experimental, por mala preparación de las
sd=
1 diluciones. Segundo, error instrumental, por
sd=0,00504 instrumentos mal calibrados. Por último, y el
más correlacionado, sería el error generado

√
2
( 0,323−0,3635 ) + ( 0,404−0,3635 )
2 por el ajuste que se realizó a la ecuación de la
sd . proteasa= recta para que cumpliera con la ley de beer,
1
procedimiento ilustrado en la gráfica 5.
sd=0,057
Construcción curva de calibración para
También se calculó el coeficiente de variación DNS
por medio de la siguiente ecuación.
Adicionalmente durante la práctica se realiza
sd una curva de calibración DNS para glucosa.
cv = (ec.6)
X Para esto se prepararon diferentes diluciones.
Las diluciones se prepararon a
concentraciones deseadas, reportadas en la
0,00504 tabla 3, que se encontraron empleando la
cv . levadura=
0.01316 ecuación 1.
cv . levadura=0.383 Para cada una de las disoluciones generadas se
tomaron las respectivas absorbancias (Tabla
7) para poder generar la curva de calibración.
0,057
cv . proteasa= Concentración Absorbancia
0,3635
(mg/mL) obtenida
cv . proteasa=0.157 0,2 0,11
0,4 0,249
0,6 0,413
Dado lo anterior se procedió a hacer un 0,8 0,562
análisis estadístico de los datos reportados. 1 0,695
Esto con el propósito de encontrar la 1,4 0,951
correlación de los datos por medio de
desviación estándar (ec.5) y coeficiente de
Tabla 6: Resultados absorbancia obtenida de ensayos de Tras el ajuste de la linea de tendencia se llego
glucosa a concentraciones específicas. a la siguiente curva de calibración con el
Por medio de los datos reportados en la tabla 7 método DNS para la cuantificación de
se procedió a generar una gráfica y ecuación azucares reductores.
de la recta para conseguir una curva de 𝐴 = 0.684[c] (ec.7)
calibración.
A= Absorbancia

Curva de calibración para DNS [c]= Concentración molar del azúcar reductor
con glucosa 4. Conclusiones
1 - Se logró encontrar una concentración para
f(x) = 0.697315573770492 x − 0.0125983606557378
0.8
R² = 0.998025381156384 la proteasa y levadura por medio del
Absorbancia

0.6 método Bradford. Los valores reportados

para la levadura fueron más precisos, pero
0.4
los de la proteasa fueron más exactos
0.2
comparándolos con los valores teóricos.
0 - Se genero un curva de calibración de DNS
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
con glucosa, la cual tiene un valor de R2
Concentración (mg/mL)
de 0.991 es decir que los datos están
altamente correlacionados.
Gráfico 6: Absorbancia vs concentración de glucosa por - Es necesario explorar técnicas de
método DNS. laboratorio que puedan reducir los factores
de errores para poder generar valores
Debido a que el término “b” de la ecuación de la
experimentales con mayor exactitud y
recta (grafica 6) no es igual a 0, se ajustó para
precisión.
generar corte en 0 y cumplir con los parámetros
de la ley de beer. Produciendo la siguiente recta.
5. Preguntas guía de laboratori0

La mayoría de los detergentes comerciales

Curva de calibración para DNS con presentan en su composición enzimas para la
glucosa degradación de proteínas, carbohidratos y grasas
1 de la ropa durante la etapa de lavado. ¿Si es
0.9 f(x) = 0.683990384615385 x solicitada la medición de proteínas en una muestra
0.8 R² = 0.99912021950605 de detergente ARIEL, que método de
0.7 cuantificación utilizaría? Justifique su respuesta.
Absorbancia

0.6
0.5 R/ El método de cualificación de proteínas que se
0.4 debe usar para una muestra del detergente ARIEL
0.3
debe de tener una sensibilidad deseada y una gran
0.2
interferencia, como es el método BCA (Acido
0.1
0
bicincininico) ya que es este bastante afín a los
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 detergentes iónicos y no iónicos. Además, este
Concentración (mg/mL) método es sencillo, rápido, sensible y muestras
tolerancia a compuestos que afectan a otros
métodos de cuantificación de proteínas. En
Gráfico 7: Absorbancia vs concentración de glucosa por contraste el método de biuret que no es
método DNS a) línea de tendencia azul representa la recta recomendado usarcé debido a que la sensibilidad
resultado de los valores experimentales b) línea de tendencia
roja presenta ajuste para pasar por punto (0,0)
de este método es muy baja y se recomienda
usarcé, para cuantificación de soluciones muy
concertadas, como son los sueros. Al igual que el [7] Biospringer, Descubre el extracto de
método de Bedford, no se debería utilizar, a pesar levadura, Lesaffre. (2022).
de su bajo costo debido a que esta técnica de
cuantificación de proteínas presenta interferencia [8] Merck, Yeast extract, (n.d.).
con detergentes y soluciones básicas.

Usted tiene una solución de maltosa con sacarosa,

y desea cuantificar la concentración total de
azúcares presentes en la muestra. Un amigo le
sugiere utilizar el método del DNS, ¿seguiría la
recomendación dada por su amigo?

R/ Si se seguiría la recomendación del amigo, de

utilizar el método de DNS para cuantificar la
concentración de azucares presentes en la muestra,
ya que la sacarosa y la maldosa son dineros que
están compuestos por dos moléculas de azucares
reductores, la sacarosa está compuesta de una
molécula de glucosa y otra de fructuosa (azucares
reductores) y la maltosa está compuesta por dos
moléculas de glucosa (Azucares reductores), por lo
que este método sería muy factible para la
cuantificación de estos azucares, pero solo si
previo a la cuantificación, se hace un hidrolisis y
se separan los dímeros en monómeros, ya que la
sacarosa a diferencia de la maltosa, como dímero,
no es un azúcar reductor y al no hacer la hidrolisis
el método DNS no detectaría la concentración de
este azúcar.

6. Referencias

[1] Samuel Antonio Sánchez Amador, Método

de Bradford: qué es y cómo funciona,
(2021).

[2] Supelco Inc, Proteínas (según el método de

Bradford). , (2022).

[3] BRENDA, Information on EC 3.4.21.112 -

site-1 protease, (2022).

[4] Merck, Proteasas, (2022).

[5] L. Alejando-Paredes, C.N. Flores-

Fernández, A.I. Zavaleta, OPTIMIZACIÓN
DEL MEDIO PARA LA PRODUCCIÓN DE
PROTEASAS EXTRACELULARES POR
Pseudomonas sp. M211 EN
FERMENTACIÓN SUMERGIDA, 2017.

[6] Merck, Protease from Bacillus sp., (n.d.).

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