INMUNOFLUORESCENCIA

Conjunto de técnicas diagnósticas empleadas para la detección de un antígeno o un

anticuerpo en células o tejidos, mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas
fluorocromos. Se emplean, de manera habitual, en el diagnóstico de enfermedades
autoinmunes.

Fluorocromo: Sustancia que se emplea para marcar anticuerpos u otras moléculas, por
su propiedad de emitir luz de una determinada longitud de onda, cuando se le estimula
con un láser o con luz ultravioleta

FUNDAMENTO

Se basa en la explotación del fenómeno biológico de la reacción de interacción entre un

anticuerpo y un antígeno. Tiene que ver concretamente con la visualización o detección
de esta reacción al excitar las moléculas fluorescentes a una longitud de onda específica.

Un anticuerpo es una proteína inmunoglobulina secretada a partir de células B activas, y

que es generado específicamente contra un antígeno, al cual puede unirse con gran
afinidad y especificidad. La inmunofluorescencia hace uso de las inmunoglobulinas IgG,
que se encuentran de forma soluble en el suero sanguíneo.

Los anticuerpos son moléculas de hasta 950 kDa compuestas por dos cadenas peptídicas
cortas (ligeras) y dos largas en forma de “Y” (pesadas). Tanto las cadenas ligeras como
las pesadas se dividen en dos dominios: uno variable, capaz de reconocer el antígeno, y
otro constante o conservado, característico de cada especie.

Los antígenos se definen funcionalmente como las moléculas que pueden ser
reconocidas por un anticuerpo y son, en su mayoría, proteínas. Cuando un animal es
expuesto a un antígeno, los linfocitos del sistema inmune se activan, produciendo
anticuerpos específicos contra este y que funcionan como sistema de defensa.

Un antígeno, como una proteína, por ejemplo, puede tener más de un epítope o lugar de
reconocimiento por un anticuerpo, por lo que el suero del animal expuesto a un antígeno
puede tener anticuerpos policlonales contra diferentes regiones de la misma proteína.

La inmunofluorescencia, entonces, explota la capacidad de un animal para producir

anticuerpos policlonales contra un antígeno específico en aras de purificarlo y emplearlo
posteriormente para la detección del mismo antígeno en otros contextos.

Entre los tintes o moléculas fluorescentes más empleados para algunas técnicas de
inmunofluorescencia están el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el isotiocianato de
tetrametilrodamina-5 y 6 (TRITC), muchas cianinas como Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y tintes
denominados Alexa Fluor®, como el Alexa Fluor®448

PASOS DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

Preparación

De las muestras

La preparación de las muestras dependerá de su naturaleza y del tipo de experiencia a

realizar. Las células en suspensión, es decir, en un medio de cultivo líquido, deben
primero separarse de este por centrifugación y luego deben ser lavadas con una solución
tampón o “buffer” isosmótico, que preserve su integridad.

Normalmente se emplea un tampón fosfato-salino conocido como PBS, en el que se

resuspenden las células y esta mezcla vuelve a centrifugarse para obtener las células
libres del medio de cultivo, que puede tener sustancias interferentes.

De las láminas

Las láminas empleadas para la observación microscópica, donde posteriormente serán

fijadas las células para los tratamientos correspondientes aguas abajo, también deben ser
preparadas cuidadosamente.

Estas son cubiertas o “sensibilizadas” con una solución de poli-lisina, un polímero sintético
que hará las veces de “pegamento molecular” entre las células y el soporte sólido, gracias
a la interacción electrostática entre las cargas positivas de sus grupos amino y las cargas
negativas de las proteínas que recubren a las células.

Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material biológico a

analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Existen
distintos métodos de fijación de material biológico. Esto dependerá de distintos factores
como: el tipo de microscopia a utilizar, la estructura subcelular que se quiera detectar,
entre otras.
Permeabilización: Existen distintos métodos de permeabilización que son más “suaves”
o mas “fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar.
Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso de los anticuerpos
a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula.

Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la

membrana produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por
ejemplo Tritón X‐ 100, NP40).

Bloqueo: Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el

material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.

En general se utilizan soluciones protéicas concentradas (Generalmente Albúmina bovina

sérica o gelatina de pescado).

El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse a su epitope
y así detectar la estructura de interés. Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por
epitopes no específicos.

Inmunodetección: Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer

específicamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas (antígenos).

La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno
tiene al menos un epitope o región reconocida por un anticuerpo.
Inmunotinción o inmunomarcaje

El procedimiento de inmunotinción o inmunomarcaje dependerá principalmente si se trata

de una inmunofluorescencia directa o indirecta

Si se trata de una inmunofluorescencia primaria o directa, las muestras se incubarán con

los anticuerpos deseados, que deberán están acoplados a los tintes fluorescentes. El
procedimiento de incubación consiste en hacer una dilución del anticuerpo en una
solución que también contendrá BSA pero en una menor proporción.

Cuando el caso es el de una inmunofluorescencia secundaria o indirecta deben realizarse

dos incubaciones consecutivas. Primero con los anticuerpos deseados y luego con los
anticuerpos que son capaces de detectar las regiones constantes de las inmunoglobulinas
primarias. Son estos anticuerpos secundarios los que están unidos covalentemente a los
fluoróforos.

La técnica resulta muy versátil, permitiendo hacer marcajes simultáneos de más de un

antígeno por muestra, siempre y cuando se tengan anticuerpos primarios acoplados a
diferentes fluoróforos, en el caso de la inmunofluorescencia directa.

Para los marcajes simultáneos en la inmunofluorescencia indirecta es necesario

asegurarse de que cada anticuerpo primario sea producido en un animal diferente, así
como también de que cada anticuerpo secundario esté acoplado a un fluoróforo distinto.

Al igual que el bloqueo, la incubación con los anticuerpos da mejores resultados mientras
mayor sea el tiempo de esta. Después de cada paso es necesario lavar el exceso de
anticuerpos que no se unieron a las muestras y en la inmunofluorescencia secundaria es
necesario bloquear antes de añadir el anticuerpo secundario.

Ciertas técnicas emplean otros tintes que no tienen que ver con inmunomarcaje, como por
ejemplo la tinción del ADN nuclear con el fluoróforo DAPI.

TIPOS

Inmunofluorescencia directa o primaria

Tiene que ver con la detección de antígenos mediante el uso de anticuerpos

fluorescentes. La ventaja principal del empleo de esta técnica es su rapidez, sin embargo,
muchos casos de unión inespecífica pueden darse en el proceso, particularmente al
estudiar sueros humanos, pues son ricos en anticuerpos muy heterogéneos
El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción. La muestra clínica que
presuntamente contiene antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en contacto
con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho microorganismo conjugado con
fluoresceína. Si el antígeno esperado está presente se formar á un complejo antígeno -
anticuerpo. La reacción positiva en forma de fluorescencia verde manzana puede verse
con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

Inmunofluorescencia indirecta o secundaria

Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente
sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti -
inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.

La técnica se realiza en dos etapas:

Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato
conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se
coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la
reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno -anticuerpo no visible ya que
el anticuerpo no estaba marcado

Segunda etapa: se agrega una anti -inmunoglobulina humana marcada, que reaccionar á
con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.

Equipo

Fluorimetro: Un fluorímetro es un dispositivo de laboratorio utilizado para medir los

parámetros de la fluorescencia: su intensidad y la distribución de longitudes de
onda del espectro de emisión después de la excitación por un cierto espectro de luz.1
Estos parámetros se utilizan para identificar la presencia y la cantidad de
ciertas moléculas específicas en un medio.

Aplicabilidad

la inmunofluorescencia es una técnica sumamente versátil, a la cual se han dado

multiplicidad de usos en el ámbito científico y clínico. Puede ser utilizada para responder
preguntas ecológicas, genéticas y fisiológicas respecto a muchos organismos.

Entre las aplicaciones clínicas se emplea para el diagnóstico directo de algunas

enfermedades dermatológicas, bien sea empleando inmunofluorescencia directa o
indirecta sobre tejido epitelial de los pacientes estudiados.

Se ha dispuesto de las técnicas de inmunofluorescencia en organismos unicelulares como

las levaduras para visualizar los microtúbulos intranucleares y citoplasmáticos, actina y
proteínas asociadas, los filamentos de 10nm y otros constituyentes del citoplasma, de la
membrana y las paredes celulares.