INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA

ESCUELA

SEMINARIO 1 TCNICAS INMUNOLGICAS

Inmunologa Mdica
Profesor: SNCHEZ CRUZ DR PEDRO

05/02/2013

Objetivo General Comprender el fundamento y la utilidad para el diagnstico clnico de las principales tcnicas inmunolgicas. Objetivo Particular Conocer y analizar los mtodos de deteccin de antgenos y/o anticuerpos a partir de las tcnicas ms importantes para su estudio y aplicacin clnica. MARCO TEORICO Muchos de los progresos alcanzados durante los ltimos cincuenta aos en biologa y medicina, han sido posibles gracias al desarrollo de nuevos mtodos analticos basados en las reacciones inmunolgicas, conocidos como tcnicas de inmnunoanlisis, que permiten el estudio, el reconocimiento y la cuantificacin de una gran cantidad de molculas. La deteccin del microorganismo causante de una infeccin puede hacerse por examen microscpico y por cultivo, pero tambin detectando antgenos especficos del microorganismo mediante pruebas inmunolgicas. Algunas tcnicas para la deteccin de antgeno se han mostrado muy tiles para el diagnstico, bien como tcnicas rpidas, que despus son confirmadas por otras, o incluso como tcnicas de referencia por su elevada eficacia. Muchas de estas tcnicas son indiscutiblemente ms rpidas, sencillas, econmicas e incluso ms sensibles que el cultivo de algunos microorganismos, como las clamidias o los virus y algunas estn automatizadas. Este tipo de tcnicas, junto con las de amplificacin de cidos nucleicos constituyen los mtodos que vertebran en la actualidad los laboratorios de virologa. (PRATS,G, 2005, pg. 157) Esquemticamente, puede decirse que si en una muestra clnica, como el LCR, una secrecin respiratoria u orina, est presente un determinado microbio, al aadir anticuerpos marcados especficos contra l se fijaran al microbio y se producir el efecto o la seal correspondiente, como aglutinacin, cambio de color de sustrato, fluorescencia o luz, dependiendo del marcador utilizado; si, por el contrario, el microbio buscado no est presente en la muestra, los anticuerpos no podrn unirse a l y no se producir la seal. (PRATS,G, 2005, pg. 160) Su reas de aplicacin admas son el diagnstico clnico, en donde ha permitido una mejora sustancial de diagnstico clnico de multitud de patologas diferentes, como infecciones, enfermedades autoinmunes,etc. Las tcnicas de inmnunoanlisis, ms tiles y prcticas son aquellas que, se basan en la especificidad de la unin de los anticuerpos con antgenos concretos, unin Ac-Ag, de tal manera que si se dispone de un determinado anticuerpo frente a una sustancia definida, por ejemplo una hermana, se puede cuantificar e incluso aislar dicha hormona. Igualmente este principio es aplicado a la medida e incluso separacin de poblaciones celulares basado en la caracterstica diferenciales de sus protenas de superficie que como sabemos difieren de unos tipos celulares a otros. Mtodos de diagnstico inmunolgicos: Cules son y para qu valen ?Manzanares, R. Gonzlez, P. Pea, A. Navas y J. Pea. Publicacin:2007

Adems se pueden analizar clulas de un mismo tipo, pero en diferentes estadios de activacin, maduracin o difere el principio es el mismo, existen muchas modalidades de mtodos que difieren, sobre todo, en la formar de visualizacin de los complejos Ag-AC. Cuando lo que se mide es directamente el precipitado formado por los complejos formados, se habla de reacciones de precipitacin y si lo que se mide es la aglutinacin de clulas, reacciones de aglutinacin. Sin embargo estos procedimientos requieren grandes cantidades de Ag o de Ac para su visualizacin. Por ello actualmente se acude a mtodos que permiten visualizar esos complejos mediante mecanismos indirectos, que son capaces de emitir alguna seal. Entre ellos destacan, el inmunoenzimoensayo, que utilizan sustancias que de cambian de color y el Inmunofluorescencia, por su propiedad de emitir fluorescencia, quimioluminiscencia, cuando se hacen visible por la emisin de luz o radioinmunoensayo cuando se hacen patentes por la emisin de radioactividad. Mtodos de diagnstico inmunolgicos: Cules son y para qu valen ?Manzanares, R. Gonzlez, P. Pea, A. Navas y J. Pea . Publicacin:2007 A veces se trata de tcnicas que utilizan una combinacin de varios procedimientos, como es el caso del Western Blott (inmunoblotting) o la inmunocitometra de flujo, entre otros. Esto hace que estos mtodos de inmnunoanlisis, tengan muchas aplicaciones dependiendo de si lo que se quiere medir son sustancias solubles o fijadas a clulas o a tejidos, etc. Mtodos de diagnstico inmunolgicos: Cules son y para qu valen ?Manzanares, R. Gonzlez, P. Pea, A. Navas y J. Pea. Publicacin:2007

*Tcnicas de inmunoprecipitacin En estas tcnicas las sustancias (antgenas) son analizadas midiendo el precipitado visible de Ac-Ag. Su realizacin requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades, como son la precipitacin en tubo, difusin radial de Ouchterlony, inmunoelectroforesis y difusin radial de Mancini. http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicasinmunologicas.html

*Tcnicas de inmunoaglutinacin Cuando el antgeno se encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte, o se ha unido artificialmente, a la superficie de glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente se utilizan glbulos rojos (hemaglutinacin) o partculas de ltex. Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido.De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de sus distintos grupos.

*Tcnicas de Inmunofluorescencia Cuando se utiliza como marcador fluorescena.Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. La Inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con molculas fluorescentes. * http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta).

*Tcnica de inmunoenzimoensayo Este procedimiento es conocido universalmente conocida como test de ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). La identificacin de complejos Ag-Ac se hace mediante el empleo de enzimas bien unidas al antgeno o bien unidas al anticuerpo. El test ELISA puede ser directo, o no competitivo. El empleo de un antgeno inmovilizado que se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable por el cambio de color que sufre. Este es el procediendo conocido como inmunoenzimoensayo directo. Su realizacin comienza con el tapizar la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar, para despus aadir la muestra con el antgeno. Fiablemente se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que, en presencia de su sustrato, da un producto coloreado soluble

que despus de un tiempo de incubacin es cuantificado mediante el lector de ELISA . Adems del test directo, en ocasiones, se utiliza inmunoenzimoensayo indirecto, que se hace con el fin de reducir los costos y se usa un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. Su realizacin se diferencia del caso anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra. Los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones. * http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html

*Tcnicas de inmunoblotting Esta tcnica se desarrolla en tres fases. En el primero se separaran las sustancias a analizar mediante electroforesis, generalmente de poliacrilamida, En el segado, los componentes ya previamente separados, se transfieren, tambin por electroforesis, a una membrana generalmente de celulosa. Por ltimo los componentes, en la membrana, se visualizan utilizando anticuerpos marcados con colorantes o istopos. De este modo se puede determinar la presencia y cantidad de sustancias a pesar de que originariamente estn mezcladas. Una de estas tcnicas es el Western blot que combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad es el test confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA, mediante la identificacin anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH en el suero o en la saliva, de una persona supuestamente infectada por el virus VIH. Para su realizacin se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y se incuban con el suero problema que se quiere investigar. Si la persona posee anticuerpos frente a protenas del VIH, stos se unirn a todas o a alguna de las bandas desplegadas en el papel de nitrocelulosa. Estos anticuerpos se detectan aadiendo un segundo anticuerpos con actividad anti- IgG humana marcada con una enzima (generalmente peroxidasa) que produce una banda coloreada al aadir un sustrato. * http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html *Tcnicas de quimioluminiscencia Hay otros modos para detectar el complejo Ag-Ac, una vez que ste se ha formado. Uno de ellos es la quimioluminiscencia, la cual est tomando cada vez mayor auge. Cuando se utilizan sustancia productoras de luz al ser estimuladas. Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. * http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html

COMENTARIOS: Las ventajas de stos mtodos inmunolgicos permiten el estudio,reconocimiento y la cuantificacin de una gran cantidad de molculas. Sus reas de aplicacin son el diagnstico clnico, en donde ha permitido una mejora sustancial de diagnstico clnico de multitud de patologas diferentes, como infecciones y enfermedades autoinmunes,entre otras. La desventaja es que algunos de stos mtodos son muy costosos y necesitan de equipo especializado para poder llevarse a cabo. REFERENCIAS: *Articulo: Mtodos de diagnstico inmunolgicos: Cules son y para qu valen ?Manzanares, R. Gonzlez, P. Pea, A. Navas y J. Pea. Publicacin:2007 *PRATS, G (2005) Microbiologa Clnica Madrid: Mdica Panamericana * http://mezzadoz2.blogspot.mx/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html