ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la Producción

Ingeniería en Alimentos
Laboratorio de Inocuidad de Alimentos 101
Tarea #5
Detección de Salmonella spp.

Integrantes:

 Castro Carlo
 Córdova Yairis
 Torres Erika
Profesora: Ing. Denisse Yagual

CONFIRMACIONES BIOQUÍMICAS
1. Prueba de la ureasa
Principio de la prueba:
El fundamento de esta prueba consiste en determinar la capacidad que tiene un
microorganismo para hidrolizar la urea, la cual se produce mediante la enzima ureasa,
que como resultado de la reacción libera dióxido de carbono y 2 moléculas de
amoníaco. El amoniaco reacciona y forma carbonato de amonio, lo que produce la
alcalinización y aumento de pH del medio de cultivo, el mismo que es detectado por un
indicador de pH (Herrera et al., 2003).

Figura 1. Hidrólisis de la Urea mediante la enzima ureasa (Herrera et al., 2003).

Composición del agar/caldo:

Tabla 1. Composición de Agar de Urea de Christensen (Condalab, 2019).
Fórmula ( g/L)
Dextrosa 1.0
Peptona de gelatina 1.0
Cloruro de sodio 5.0
Fosfato monopotásico 2.0
Rojo de fenol 0.012
Agar bacteriológico 15.0
Tabla 2. Composición de Caldo de Urea de Stuart (Condalab, 2019).
Fórmula ( g/L)
Fosfato dipotásico 9.5
Rojo fenol 0.01
Extracto de levadura 0.1
Fosfato monopotásico 9.1
Urea 20.0

Procedimiento:

 Sembrar en estría sobre la superficie de agar urea o caldo urea, inclinados

 Incubar entre 24 y 48 horas a 37°C
 Observar y anotar resultados
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009).
Resultados:
Los resultados son manifestados por un cambio de color del medio. Una coloración
entre rosa fucsia, ya sea en agar o caldo, representa la alcalinización del medio e
hidrólisis de la urea, que es detectado por el indicador de pH (rojo de fenol), siendo
esta una prueba positiva, mientras que el color amarillo pálido representa una
ausencia de reacción, es decir, no hay cambios en el color original y es considerado
una prueba negativa (Fernández et al., 2010).
Para las salmonelas, su presencia arroja una reacción negativa, ya que ellas no tienen
la enzima ureasa (INEN,2009).

Figura 2. Resultados positivo (izq.) y negativo (der.), prueba ureasa (Condalab, 2019).

2. Beta galactosidasa
Principio de la prueba:
La prueba β-galactosidasa consiste en demostrar la ausencia o presencia de la enzima
βgalactosidasa mediante la añadidura de un compuesto orgánico O-nitrofenilβ-D-
galactopiranósido (ONPG) el cual es, de manera estructural, similar a la lactosa. En el
test, la enzima βgalactosidasa hidroliza el ONPG y da como resultado dos productos:
galactosa y o-nitrofenol. Éste último posee color amarillo mientras que el ONPG es
incoloro, siendo el cambio de coloración del medio una evidencia de la hidrólisis
(Tankeshwar, 2021).
Figura 3. Hidrólisis de ONPG mediante enzima βgalactosidasa (Tankeshwar, 2021).

Composición de medio de incubación:

a) Uso de suspensión:
Tabla 3. Composición de suspensión bacteriana (INEN, 2009).
Fórmula (cm3)
O-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG), 0,0133 M 0.25
Solución salina estéril 0.5
Tolueno 1 gota

b) Uso de discos impregnados de ONPG.

Procedimiento:
Para uso de suspensión:

 En un tubo estéril agregar la solución salina estéril, una gota de tolueno y

agitar.
 Incubar el tubo en baño de agua a 37°C por 10 minutos.
 Añadir la solución tamponada de ONPG, agitar e incubar en baño de agua a
37°C por 24 horas.
Para uso de discos impregnados de ONPG:

 Añadir los discos impregnados de ONPG a la suspensión bacteriana

 Agitar el tubo cuidadosamente
 Incubar a 35°C de 4 a 6 horasFuente:
 NTE INEN 1529-15 (2009).
Resultados:
Tal como se observa en la figura 4, un cambio de coloración de incoloro a amarillo,
representa la hidrólisis debido a la formación de o-nitrofenol que se dio como resultado
de la actividad enzimática. El color amarillo se considera una prueba positiva mientras
que la ausencia de cambio de color se considera prueba negativa (Tankeshwar, 2021).
Para las salmonelas, su presencia arroja una reacción negativa, ya que ellas no tienen
la enzima βgalactosidasa (INEN,2009).
 Figura 4. Resultados de prueba Beta galactosidasa (Tankeshwar, 2021)

3. Lisina-descarboxilasa
Principio de la prueba:
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir
una enzima que descarboxila el aminoácido lisina

Figura 5. Descarboxilasión de aminoácido Lisina por enzima descarboxilasa

(Condalab, 2019).

Composición del caldo:

Tabla 4. Composición de Caldo Lisina Descarboxilasa (Condalab, 2019).
Fórmula (en g/L)
Púrpura de bromocresol 0.02
Peptona de gelatina 5.0
Extracto de levadura 3.0
Dextrosa 1.0
L-Lisina 5.0

Procedimiento:

 Inocular en el fondo de la superficie líquida del caldo lisina-descarboxilasa y

vedar con vaselina líquida estéril.
 Incubar a 37°C por 24 horas
En caso de no notar cambios de coloración:
 Agregar 1 o 2 gotas de solución al 0.2% de púrpura de bromocresol.
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009).
Resultados:
Esta prueba se fundamenta en la capacidad que tiene el microorganismo de fermentar
la glucosa además de la producción de cadaverina tras la acción de la enzima beta
descarboxilasa y el aminoácido lisina. La producción de la cadaverina es la que hace
que el medio se neutralice y el pH no cambie tras la producción de glucosa. La
Sallmonella spp da positivo ante esta prueba.

Figura 6. Resultados de prueba Lisina Descarboxilasa (Tankeshwar, 2021).

4. Voges-Proskauer
El principio de esta prueba es determinar si un microorganismo problema utiliza
la glucosa por la vía butilén-glicólica (Tankeshwar, 2021).
Principio de la prueba:

Figura 7. Reaccion de test positivo (Tankeshwar, 2021).

Composición del caldo:

Tabla 5. Composición de Caldo Glucosa Fosfato (MR-VP) (Condalab, 2019).
Fórmula (en g/L)
Dextrosa 5.0
Fosfato potásico 5.0
Mezcla de peptona 7.0

Procedimiento:

 Sembrar el cultivo en un tubo de caldo MR-VP, incubar entre 24 a 48 horas a

37°C.
 Añadir 3 gotas de solución alcohólica de alfa-naftol al 6% y agitar.
 Añadir 2 gotas de KOH al 40% y agitar.
  Añadir 2 gotas de creatina al 0.5% (paso opcional).
 Leer los resultados después de 4 horas.
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009).

Resultados:
Salmonella spp da como resultado una prueba negativa, esto producto de que esta
familia no puede producir acetoína que es el producto del metabolismo del ácido
pirúvico presente en el medio.
La ausencia de cambio de coloración representa un resultado negativo, mientras que
el cambio de coloración representa un cambio positivo.

Figura 8. Resultados de prueba Voges-Proskauer (Tankeshwar, 2021).

5. Indol
Principio de la prueba:
Esta prueba se fundamenta principalmente en la obtención de piruvato, indol y
amoniaco. Estas moléculas se diferencian mediante la adición de dos reactivos;
Kovács y Ehrlich. El medio está enriquecido para que los microorganismos hidrolicen
el aminoácido triptófano mediante la acción de enzimas triptofanasa, esto lo hace
sucesivamente hasta obtener las tres moléculas ya mencionadas (Tankeshwar, 2021).
Reacción:

Figura 9. Reacción de prueba indol (Tankeshwar, 2021).

Composición:
Tabla 6. Ingredientes prueba indol (Fleischer, 2019).

Ingredientes Cantidad (g/L)

Triptona 15,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agua destilada 1000,0 mL

Procedimiento:

 Colocar en un tubo de ensayo 15,0 g de Triptona.

 Agregar un inóculo y de la muestra a realizar
 Incubar por 24h a 37°C
 Agregar, luego de la incubación, 0.3 ml de reactivo Kovács
 Observar y anotar
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009)
Resultados:
Cuando existe la presencia de indol en la muestra, se combina con el benzaldehído
del reactivo para producir una coloración que varía entre rosa-rojo-violeta. En caso de
haber una coloración que varía de azul a verde indica que se combino con el
cinamaldehído. Si no existe ninguna coloración o un amarillo en el tubo de ensayo se
concluye que la prueba es negativa. Los resultados de esta prueba para identificación
de Salmonella spp deben de ser negativa (Salazar et al., 2015).

Figura 10. Resultados de prueba Indol (Tankeshwar, 2021).

6. Fenilalanina-desaminas
Principio de la prueba:
Esta prueba se fundamenta en la desaminación del aminoácido fenilalanina y el ácido
fenilpirúciso por parte del microorganismo y una enzima inmersa en el mismo
denominada desaminasa, dejando un medio ácido como resultado (Anonimo, n.d.).
Reacción:
 Figura 11. Reacción prueba fenilalanina-desaminasa (Anonimo, n.d.).
Composición:
Tabla 7. Composición agar fenilalanina (Anonimo, n.d.).

Ingredientes Cantidades (g/L)

Extracto de levadura 3 g/L
Fosfato dipotásico 1 g/L
D-L-Fenilalanina 2 g/L
Cloruro de sodio 5 g/L
Agar 12 g/L

Procedimiento:

 Rotular por duplicado los tubos de ensayo

 Ubicar el agar Fenilalanina-desaminasa de forma inclinada
 Esperar a que se solidifique
 Sembrar por estrías un inóculo de la muestra a analizar
 Incubar a 37°C por 24 h
 Añadir gotas de cloruro férrico a 0.5M
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009)
Resultados:
Cuando el medio se tiñe de un color verde azulado u oscuro indica la presencia de
ácido fenilpirúciso dando a conocer que la prueba es positiva según la normativa
ecuatoriana NTE INEN 1529 (2009). En el caso de Salmonella spp el resultado de esta
prueba debe de ser negativo, es decir que el tubo de ensayo se mantiene del color del
agar.

Figura 12. Resultados de la prueba Fenilalanina-desaminasa (Anonimo, n.d.).

7. Citrato
Principio de la prueba:
Esta prueba es conocida por la efectividad de reconocer a las familias de
Enterobacteriaceae y es la última de las pruebas IMViC. Se fundamenta
principalmente en el uso de citrato de sodio como principal fuente de carbono mientras
que el nitrógeno es extraído únicamente del compuesto dehidrogenafosfato
(NH4H2PO4) aumentando el pH hasta alcanzar un medio alcalino (Tankeshwar, 2016).
Reacción:

Figura 13. Reacción prueba de Citrato (Tankeshwar, 2016).

Composición:
Tabla 8. Composición agar citrato Simmons (Tankeshwar, 2016).

Ingredientes Cantidades
Dehidrogenafosfato de amonio 1g
Fosfato dipotásico 1g
Cloruro de sodio 5g
Citrato de Sodio 2g
Sulfato de magnesio 0.20 g
Agar 15 g
Azul de bromotimol 0.08 g
Agua destilada 1L
pH final 6,9

Procedimiento:

 Rotular los tubos de ensayo a utilizar

 Agregar el agar en inclinarlo
 Esperar a que se solidifique
 Obtener un inóculo de la muestra para proceder a realizar una siembra por
estrías
 Incubar a 37°C por 24h
 Observar y anotar
Fuente: NTE INEN 1529-15 (2009)
Resultados:
si existe la formación de productos alcalinos como carbonatos y bicarbonatos tras el
metabolismo de los microorganismos, el tubo se va a teñir de un azul intenso debido al
elevamiento del pH del medio. Para Salmonella spp el resultado de esta prueba es
negativo lo que indica que el agar no se teñirá y se quedará de su verde característico
(Tankeshwar, 2016).

Figura 14. Resultados prueba de Citrato (Tankeshwar, 2016).

ESTRUCTURA ANTÍGENA
La Salmonella en su estructura antígeno está compuesta potencialmente por proteína
y polisacáridos específicos. Los antígenos que predominan en la estructura antígeno
de la Salmonella son los antígenos somáticos o antígenos O, antígenos capsulares Vi
y los antígenos flagelares o antígeno H. Las especies de Salmonella están
determinadas por la estructura antígeno que están constituidos ya sean antígenos
somáticos, antígenos flagelares y antígenos capsulares Vi. El antígeno somático O son
los polisacáridos y fosfolípidos que se encuentran en la pared de la bacteria, esta es
estable al calor y son resistentes al alcohol. El antígeno Capsular o de superficie, es
un antígeno que se encuentra sobre los antígenos O en las superficies de las células,
este antígeno se observa con mayor frecuencia en bacterias enterobacteria o
Salmonella dado que uno de sus componentes es Vi se puede ver camuflado a través
de los antígenos somáticos. Los antígenos flagelares se componen por proteínas,
estos son termolábiles lo que hace que estos se destruyan fácilmente en presencia de
calor.

CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA
1. Determinación del antígeno O
Para la determinación del antígeno O primero se debe de realizar la suspensión del
microorganismo que se desea analizar, esto consiste en la suspensión del medio de
cultivo agar nutritivo inclinado en una solución fisiológica de aproximadamente de 1
cm3, esta suspensión debe de quedar los más uniforme posible. En una lámina de
vidrio o en una caja Petri se debe colocar 0.05 cm3 de la suspensión bacteriana, luego
con ayuda de un asa estéril se debe de colocar una gota de solución salina (cloruro de
sodio al 0,85% estéril) y se procede a mezclar, recordando que esto lo debemos hacer
cerca de un mechero para que de esta manera se mantenga un ambiente estéril para
el cultivo. La solución salina sirve como medio de control de los antisueros dado que si
este no presenta aglutinaciones significa que la reacción es negativa, caso contrario se
debe desechar el cultivo. Nuevamente se procede a colocar 0.05cm3 de la suspensión
bacteriana en una lámina de vidrio o caja Petri y se procede a iniciar con la prueba de
antígenos O. Una vez comprobados que los antisueros no presentan aglutinaciones se
coloca una gota del antisuero Salmonella O poly A sobre la suspensión bacteriana
previamente colocada y se mezcla bien, se hace el mismo procedimiento con el
antisuero Salmonella O poly B. Se mueve la lámina de vidrio o la caja Petri en forma
oscilatoria por 1 o 2 minutos, luego con ayuda de una lupa y un fondo oscuro se
procede a observar los resultados de las reacciones, siendo positiva si la aglutinación
ocurre rápidamente y negativa en caso de ser tardía (SAG,2002 and INEN, 2009).

Cultivo en agar Suspensión

inclinado semsólido bacteriana

Figura 15. Reacciones del antígeno O

2. Determinación del antígeno Vi

Para el análisis del antígeno Vi, hay que tener en consideración que, si se obtuvo por
lo menos un resultado negativo de la prueba de antígeno O ya sea con el antígeno
poly A o B, se procede a realizar automáticamente la prueba del antígeno Vi. Los
cultivos obtenidos previo a las pruebas bioquímicas en agar inclinado, se procede a
colocar una gota del antisuero Salmonella Vi, en caso de observar aglutinamiento se
debe de llevar a calentamiento a la suspensión en agua hirviendo durante 10 minutos.
Una vez que se ha enfriado, se vuelve a colocar una gota de la suspensión bacteriana
en una lámina de vidrio o caja Petri y del antisuero Vi y los antisueros O del grupo D1 y
C1. Se mueve de manera oscilatoria para que se homogenice el medio durante 1 a 2
minutos. Finalmente se procede a observar si existen o no aglutinaciones, en el caso
de que el cultivo reaccione con el antígeno O puede que se esté tratando de un cultivo
de Salmonella typhi o Salmonella parathi C, sin embargo, si el cultivo reacciona solo
con el antígeno Vi lo más probable es que no se trate de Salmonella y para confirmar
esto se requiere de realizar nuevas pruebas bioquímicas para poder determinar si
existe algún tipo de especie de Salmonella o alguna otra especie bacteriana
(SAG,2002 and INEN, 2009).

Cultivo en agar Suspensión

inclinado semsólido bacteriana

Figura 16. Reacciones del antígeno Vi

3. Determinación del antígeno H

Para el análisis de antígeno flagelar se emplean medios de cultivo de agar inclinado
nutritivo semisólido, y además se cultiva en caldo TSB a una temperatura de 37°C
durante 24 horas. Uno de los tubos será empleado para control mientras que a el otro
tubo se le agrega 0.05 cm3 del antisuero H polivalentes o del grupo. Luego estos
pasan a ser calentados en baño maría a una temperatura aproximada de 48- 50 °C
durante 1 hora. Una vez que hemos obtenido la muestra en una lámina de vidrio o en
una caja Petri se debe colocar 0.05 cm3 de la suspensión bacteriana, luego con ayuda
de un asa estéril se debe de colocar una gota de solución salina (cloruro de sodio al
0,85% estéril) y se procede a mezclar, recordando que esto lo debemos hacer cerca
de un mechero para que de esta manera se mantenga un ambiente estéril para el
cultivo. La solución salina sirve como medio de control de los antisueros dado que si
este no presenta aglutinaciones significa que la reacción es negativa, caso contrario se
debe desechar el cultivo. Nuevamente se procede a colocar 0.05cm3 de la suspensión
bacteriana en una lámina de vidrio o caja Petri y se procede a iniciar con la prueba de
antígenos H. Se mueve la lámina de vidrio o la caja Petri en forma oscilatoria por 1 o 2
minutos, luego con ayuda de una lupa y un fondo oscuro se procede a observa la
reacción tomando en consideración primero el tubo de control, ya que si este tiene
aglutinamiento el tubo de la muestra con el antígeno será negativo. Por ello, esta
prueba será positiva en caso de presentar aglutinaciones en presencia del antisuero,
caso contrario de no presentar aglutinaciones en presencia del antígeno la prueba
será negativa (SAG,2002 and INEN, 2009).
 Agar
nutritivo
semisolido
TSB
Figura 17. Reacciones del antígeno H

Finalmente, como se muestra en la figura xx la suspensión bacteriológica al reaccionar

con una gota del antígeno O muestra aglutinaciones siendo esta reacción positiva. Y
para la suspensión bacteriológica más una gota del antígeno H se observa según la
imagen que tiene aglutinaciones, teniendo así un resultado positivo (INEN, 2009).

Figura 18. Reacciones serológicas de antígenos O y H

BIBLIOGRAFÍA
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