UNIVERSIDAD EL BOSQUE

FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Programa de Bioingeniería
Laboratorio De Bioquímica

Glicólisis, producción y reconocimiento de

piruvato, etanal y etanol por fermentación de
glucosa con enzimas de la levadura.
Docentes: Vilma Teresa Pinzón Fajardo
BCTBE

Glicólisis, producción y reconocimiento de piruvato, etanal y etanol por

fermentación de glucosa con enzimas de la levadura

1. Introducción

La primera etapa de la fermentación de glucosa por las enzimas de la levadura es la

producción de piruvato, éste proceso se efectúa mediante una serie de reacciones que
involucran varios intermediarios y se denomina glicólisis anaerobia o anoxigénica (en
ausencia de oxígeno).

La reacción global de la glicólisis se puede esquematizar mediante la transferencia de dos

pares de de hidrogeniones (2H+) y dos pares de (2e-) de la glucosa a dos moles del
nucleótido NAD+ (nicotin-adenosin-dinucleotido) con la posterior producción de dos
moles de piruvato.

Fig 1. Reacción global de la glicólisis.

En condiciones anaerobias el piruvato se convierte en acetaldehído y luego en etanol,

según las reacciones siguientes:

Fig 2. Reacción de conversión de piruvato a etanol.

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 El pH óptimo para la fermentación alcohólica catalizada por las enzimas de las levaduras
está entre 4,5 -5.6.

El piruvato se descarboxila formando acetaldehído (etanal) y CO2 por la acción de la

enzima piruvato descarboxilasa, dependiente del ión magnesio Mg+2 y del pirofosfato de
tiamina (TPP) como cofactores. De otro lado esta enzima se inactiva cuando el pH es
ligeramente alcalino (pH=8) y por lo tanto se induce una acumulación de piruvato,
metabolito que se puede reconocer mediante la reacción con nitroprusiato de sodio o con
2,4-dinitrofenilhidrazina.

En la etapa final de la fermentación etanólica (alcohólica), el acetaldehído por la acción

catalítica de la enzima (alcohol) etanol deshidrogenasa se reduce a etanol, reacción en la
que el NADH+ H+ actúa como agente reductor. El pH óptimo para la acción de la etanol
deshidrogenasa es 5,6; sin embargo, si se modifica hacia un valor ligeramente alcalino
(pH=8) la reacción que se favorece es la de oxidación del etanol, es decir, que se acumula
acetaldehído.

Para atrapar el acetaldehído se añade sulfito de sodio (adición bisulfítica) a la mezcla de

incubación y la presencia de este intermediario se puede demostrar por la reacción de
coloración con nitroprusiato de sodio y piperidina o con 2,4.dinitrofenilhidrazina.

El piruvato y el acetaldehído, normalmente se encuentran presentes en muy bajas

concentraciones, por lo tanto, para comprobar su existencia como intermediarios en la vía
metabólica es necesario impedir que se transformen en otros compuestos, lo cual se logra
bien sea inhibiendo la enzima, que cataliza la conversión de los metabolitos, mediante la
modificación del pH del medio o por la adición de agentes que atrapen el intermediario
formando un compuesto que no se puede metabolizar, como se describió en los párrafos
anteriores.

El producto final de la fermentación de la glucosa por acción de la levadura es el etanol

que se puede reconocer mediante la reacción de oxidación con anhídrido crómico en
medio ácido, conocida como ensayo del ácido nitrocrómico, en la que el color del reactivo
cambia de amarillo a verde o azul o mediante la reacción del xantato.

2. Objetivos

Los estudiantes

2.1. Obtendrán algunos intermediarios metabólicos de la glicólisis.

2.2. Obtendrán piruvato, etanal y etanol por fermentación de la glucosa con las enzimas de la
levadura.
2.3. Reconocerán los intermediarios metabólicos obtenidos en la fermentación por medio de
reacciones de coloración.

3. Tareas de Aprendizaje

3.1. Para el preinforme

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Los estudiantes harán un resumen y lo consignaran en el cuaderno de laboratorio, sobre
los siguientes conceptos o temas.

3.1.1. Secuencia completa de la glicólisis, identificar las reacciones en donde hay

producción de nucleótidos energéticos (ATP y NADH + H+) y escribir las ecuaciones
químicas correspondientes con sus respectivas enzimas.
3.1.2. Clasificación de cada una de las enzimas que participan en la ruta glucolítica en el
grupo al que pertenecen según la reacción que catalizan.
3.1.3. Diferencia entre fosforilación oxidativa y fosforilación a nivel de sustrato.
3.1.4. Reacciones acopladas y reacciones anapleróticas.
3.1.5. Aplicaciones de las levaduras en la industria, biotecnología, farmacología y sector
alimenticio.

3.2. Para el informe

Los estudiantes harán un análisis de los siguientes aspectos:

3.2.1. Escribir las reacciones químicas que se efectuaron en cada procedimiento.

3.2.2. Analizar cada prueba y resultado obtenido.
3.2.3. Escribir un breve resumen sobre una patología generada por alteración de una
enzima de la ruta glucolítica.
3.2.4. Lea y analice el siguiente artículo científico: secuencia glucolítica y metabolismo
respiratorio en Debaryomyces hansenii comparada con Saccharomyces cerevisiaa.

Disponible en: http://www.smb.org.mx/smb-anterior/Memorias_Bioener2005/Orales/P06.pdf

3.2.4.1. Explique la relación entre producción de etanol y consumo de glucosa para los
dos tipos de microorganismos.
3.2.4.2. Explique la relación entre la producción de intermediarios metabólicos,
glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato en los dos tipos de microorganismos.
3.2.4.3. Explique la función de los inhibidores de la respiración en cada organismo y su
relación con NADH+H+.
3.2.4.4. ¿cuál de los dos organismos produjo más etanol y piruvato?, justifique su
respuesta.
3.2.4.5. ¿cuál es la diferencia entre una levadura osmosensible y una osmotolerante?.

3. Materiales por grupo de trabajo

12 Tubos de ensayo – gradilla

2 Vasos de precipitados (250 ml)
1 placa refractaria
1 pinza para tubo de ensayo

4. Reactivos para todos los grupos de trabajo

Para la fermentación: (Primera parte)
Fosfato de sodio dibásico, 0,5 M
Fosfato de monobásico, 0,5 M
Suspensión de levadura, 10 g/dl en (Na2HPO4)
Suspensión de levadura, 10g/dl en (NaH2PO4)
Suspensión de levadura, 10 g/dl (en H2O)

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 Glucosa, 10 g/dl

Para el reconocimiento de metabolitos:

Nitroprusiato de sodio, 5 g/dl (preparar antes de usar)
Hidróxido de amonio concentrado (al 34%)
Sulfato de amonio solido.
Sulfito de sodio solido.
Hidróxido de sodio, 10 g/dl
Clorhidrato de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solución saturada en ácido clorhídrico 2M).
Piperidina, 30 g/l en agua
Piruvato de sodio al 2% en agua
Etanol al 96%
Éter etílico.
Bisulfuro de carbono, en gotero de seguridad
Hidróxido de potasio sólido.
Ácido nítrico 7N, en gotero de seguridad.
Dicromato de potasio K2Cr207 al 5 % en agua, en gotero de seguridad.

5. Procedimiento-Fermentación (Primera parte)

5.1. Formación de piruvato y etanol a partir de glucosa

En dos tubos de ensayo y marcados como A y B, pipetear 3 ml de solución de glucosa

en cada uno, agregar al tubo A 5 ml de suspensión de levadura en solución de Na2HPO4
(medio alcalino, pH alrededor de 8.0) y al tubo B 5 ml de suspensión de levadura en
solución de NaH2PO4 (medio ácido, pH alrededor de 4.5). Mezclar bien ambos tubos,
protegerlos de la luz con papel de aluminio e incubarlos a 37ºC durante ocho días.

Terminado el tiempo de incubación agregar a cada uno de los tubos 2 ml de solución de

ácido tricloroacético, para precipitar totalmente las enzimas, mezclar vigorosamente y
centrifugar durante 10 minutos a 2500 rpm.

Separar los sobrenadantes para el reconocimiento de piruvato y etanol.

5.2. Formación de acetaldehído y etanol a partir de glucosa.

Marcar dos tubos de ensayo como C y D. Adicionar a cada uno de ellos 3 ml de solución
de glucosa y 5 ml de suspensión de levadura en agua, medir el pH de cada uno y
registrarlo en el rotulo.

Al tubo D añadir 0.5 g de sulfito de sodio. Mezclar ambos tubos vigorosamente e incubar a
37ºC durante por lo menos 5 días.

6. Reconocimiento de metabolitos formados en la fermentación (Segunda parte)

Terminado el tiempo de incubación agregar a cada uno de los tubos A, B, C y D, 5 gotas

de ácido tricloroacético, para precipitar totalmente las enzimas, mezclar vigorosamente y
centrifugar durante 2 minutos a 2500 rpm.

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Separar el precipitado transfiriendo el líquido sobrenadante de cada uno de los tubos A, B,
C y D a nuevos tubos de ensayo limpios. Sobre estos sobrenadantes se harán las
siguientes pruebas de reconocimiento de metabolitos

6.1. Reconocimiento de piruvato mediante nitroprusiato de sodio.

Calentar al baño de maría a ebullición 2 mL del sobrenadante del Tubo A y en otro tubo
2 mL del sobrenadante del Tubo B, agregar a cada uno de ellos 0.5 g de sulfato de
amonio sólido y 5 gotas de nitroprusiato de sodio, mezclar fuertemente. Utilizando una
pipeta agregar, por las paredes de cada tubo sin mezclar, amoniaco concentrado
(Hidróxido de amonio al 34 %) hasta que observe la formación de dos capas. Dejar en
reposo y observar la reacción.

La presencia de un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos indica la

presencia de piruvato. Si se forma un anillo rosado transitorio en la interfase indica la
presencia de un grupo tiol.

Repetir el ensayo pero reemplazando los 2 mL de los sobrenadantes A y B por 2 mL de

piruvato de sodio al 2% (solución acuosa).

6.2. Reconocimiento de piruvato con 2,4 dinitrofenilhidracina (2,4.DNFH).

Agregar a 1 mL del sobrenadante del Tubo A y a 1 ml del sobrenadante del tubo B

lentamente por las paredes 10 gotas del reactivo 2,4 dinitrofenilhidracina, agitar
vigorosamente la mezcla. Si se forma la 2,4-dinitrofenilhidrazona, como precipitado,
que puede ser amarillo, anaranjado o rojo es prueba positiva para cetonas (grupo
carbonilo) En algunos casos se forma un aceite que cristaliza en reposo. No agregue
exceso del sobrenadante porque la 2,4-dinitrofenilhidrazona formada es muy soluble
en los aldehídos y cetonas.
Repetir en ensayo pero utilizando 1 mL de solución de piruvato al 2% en lugar de los
sobrenadantes A y B

6.3. Reconocimiento de etanol con ácido nitrocrómico

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de HNO3 7N, agregar por las paredes del tubo con
mucho cuidado 2 gotas de K2Cr207 al 5 %, mezclar suavemente. Añadir
cuidadosamente 5 gotas del sobrenadante B; agitar. La formación de un color azul
antes de cinco minutos es prueba positiva para alcoholes primarios y secundarios.
Repita el ensayo reemplazando las 5 gotas del sobrenadante B por 1 gota del
reactivo etanol como patrón de referencia.

6.4. Reconocimiento de etanol mediante la prueba de xantato

En un tubo de ensayo colocar 2.0 ml del sobrenadante obtenido en el tubo B.
Agregar, una perla de KOH, calentar en baño de agua a ebullición por 1 minuto,
enfriar y agregar 1 mL de éter etílico y luego 20 gotas de disulfuro de carbono.
Agitar constantemente y observar. La formación de una turbidez o precipitado
blanco o amarillo es prueba positiva para alcoholes.

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Repetir el ensayo reemplazando los 2 ml del sobrenadante B por 2 ml del reactivo etanol
como patrón de referencia.

6.5. Reconocimiento de acetaldehído con nitroprusiato de sodio.

En dos tubos de ensayo, añadir al primero 2 ml del sobrenadante del tubo C y al segundo
2 ml del sobrenadante del tubo D, obtenidos anteriormente.

Agregar a cada uno de ellos 0.5 ml de la solución de nitroprusiato de sodio y 2 ml de

piperidina acuosa. Agite cada tubo. La aparición de un color azul indica la presencia de
acetaldehído.

Repetir el procedimiento reemplazando los 2 mL de cada sobrenadante por el reactivo

benzaldehído como patrón.

6.6. Reconocimiento del acetaldehído (grupo carbonilo) con 2,4

dinitrofenilhidracina (2,4.DNFH).

En dos tubos de ensayo, añadir al primero 2 ml del sobrenadante del tubo C y al segundo
2 ml del sobrenadante del tubo D, obtenidos anteriormente.

Agregar lentamente 10 gotas del reactivo 2,4 dinitrofenilhidracina, se agita vigorosamente

la mezcla. Si se forma la 2,4-dinitrofenilhidrazona, como precipitado, que puede ser
amarillo, anaranjado o rojo es prueba positiva para aldehídos (acetaldehído). En algunos
casos se forma un aceite que cristaliza en reposo. No agregue exceso del compuesto
carbonílico porque la 2,4-dinitrofenilhidrazona formada es muy soluble en los aldehídos y
cetonas.

Repetir el procedimiento reemplazando los 2 mL de cada sobrenadante por el reactivo o

benzaldehído como patrón.

6.7. Reconocimiento de etanol con ácido nitrocrómico

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de HNO3 7N, agregar por las paredes del tubo con
mucho cuidado 2 gotas de K2Cr207 al 5 %, mezclar suavemente. Añadir cuidadosamente
5 gotas del sobrenadante C; agitar. La formación de un color azul antes de cinco minutos
es prueba positiva para alcoholes primarios y secundarios.

Repita el ensayo reemplazando las 5 gotas del sobrenadante C por 1 gota del
reactivo etanol como patrón de referencia.

6.8. Reconocimiento de etanol mediante la prueba de xantato

En un tubo de ensayo colocar 2.0 ml del sobrenadante obtenido en el tubo C. Agregar,

una perla de KOH, calentar en baño de agua a ebullición por 1 minuto, enfriar y agregar 1
mL de éter etílico y luego 20 gotas de disulfuro de carbono. Agitar constantemente y

6
observar. La formación de una turbidez o precipitado blanco o amarillo es prueba positiva
para alcoholes.

Repetir el ensayo reemplazando los 2 ml del sobrenadante C por 2 ml del reactivo etanol
como

7. Bibliografía.

7.1. VOET, Donald. Bioquímica. Buenos Aires. Editorial Panamericana. 3ª ed. 2006
7.2. BOYER, Rodney. Conceptos de Bioquímica. México: International Thomson
Editores. 2000.
7.3. DIAZ, Juan C y HICKS, Juan José. Bioquímica. 2 ed. México: Interamericana,
McGraw – Hill, 1995.
7.4. HICKS, Juan José. Bioquímica. McGraw – Hill Interamericana, 1999.
7.5. PARÉS, Ramón y JUÁREZ, Antonio. Bioquímica de los Microorganismos.
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7.6. SANCHÉZ, N.S., CALAHORRA, M., GONZALEZ, J.C., PEÑA, A (2005).
secuencia glucolítica y metabolismo respiratorio en Debaryomyces hansenii
comparada con Saccharomyces cerevisiaa. Departamento de genética molecular.
Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas.