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Prueba de la Oxidasa El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Procedimiento: Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra. Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli Prueba de la Catalasa El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2). Prodecimiento: Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta. La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp. Prueba de la Coagulasa La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus. Procedimiento: Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidroflico y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeos cogulos no oganizados 2: pequeos cogulos oganizados 3: gran cogulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus ( - ) Staphylococcus epidermis. Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine Motilidad-Indol-Ornitina) Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Interpretacin y Resultados

Reaccin Enturbiamiento del Agar. Agar transparente de-

Interpretacin Hay movilidad

No hay movilidad sarrollo solo en picada Azul (alcalino) Coloracin Amarilla (cido) Rojo (anillos) Amarillo (anillos) Descarboxila ornitina No descarboxila Indol (+) Indol ( - )

Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro) El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados:

Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp. Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Prueba LIA (Lysine Iron Agar Agar Lisina Hierro) Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Interpretacin y Resultados: Reaccin Azul (alcalino) Rojo Engrecimiento Ruptura del Agar Fondo Amarillo y Tendido prpura Pruebas Bioqumicas IMViC: Agar Citrato La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Interpretacin Hay movilidad No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila Descarboxilacin de lisina

Resultados: (+)Klebsiella spp. ( - ) Escherichia Coli Indol El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Klebsiella pneumoniae Rojo Metilo Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es

positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes Vogues Proskauer En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojofucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva. Resultados: (+) Enterobacter aerogenes (-)Escherichia coli Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioqumicas MICROORGANISMO FAMILIA TINCION FORMA MOVILIDAD BACILOS POSEE CORTOS, FLAGELOS CURVADOS O POLARES RECTOS BACILOS FLAGELOS CORTOS PERTRICOS BASTONCILLOS NO TIENE BACILOS FLAGELOS CORTOS NO PERTRICOS ESPORULADOS COCACEA NO TIENE

PSEUDOMONA SPP. ENTEROBACTER GRAM -

SALMONELLA SHIGUELLA SPP.

ENTEROBACTER GRAM ENTEROBACTER GRAM -

ESCHERICHIA COLI ENTEROBACTER GRAM STAPHYLOCOCCUS MICROCACEAE GRAM +

AUREUS Resultados Experimentales Grupo 1: Sebastin Leyton - Carlos Vera Grupo 2: Yuri Glvez - David Fuica Grupo 3: Graciela Quintero - Carolina Grupo 4: Carolina Iribarra - Jessica Pizarro Oxidasa MICROORGANISMO PSEUDOMONA SPP. SALMONELLA SHIGUELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 + + + + + + + + + Catalasa MICROORGANISMO PSEUDOMONA SPP. SALMONELLA SHIGUELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 + + + + + + + + + + + + Coagulasa MICROORGANISMO STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 + Indol MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 + + + Agar Citrato GRUPO 4 + + + GRUPO 4 + + GRUPO 4 + + + + + GRUPO 4 + + + -

MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 Vogues-Proskauer

GRUPO 4 -

MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 Rojo Metilo

GRUPO 4 -

MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 + + + LIA

GRUPO 4 +

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 DETECTADO(S) SALMONELLA SHIGUELLA SPP. GRUPO 2 GRUPO 3

DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DE ORNITINA DE ORNITINA DE ORNITINA DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DE LISINA DE LISINA DE LISINA MIO

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 DETECTADO(S) PSEUDOMONA SPP. ST. AUREUS ORNITINA TSI MICROORGANISM O(S) DETECTADO(S) SALMONELLA ORNITINA ORNITINA GRUPO 2 GRUPO 3

DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DE ORNITINA DE ORNITINA DE ORNITINA NO DESCARBOXILA NO DESCARBOXILA NO DESCARBOXILA

GRUPO 1 GLUCOSA

GRUPO 2 GLUCOSA

GRUPO 3 GLUCOSA

GRUPO 4 GLUCOSA

FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD FERMENTADA

A LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADA S PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO

LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI SACAROSA SACAROSA SACAROSA

FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD AS AS AS PRODUCCION PRODUCCION PRODUCCION DE ACIDO DE ACIDO DE ACIDO

SULFHIDRIC SULFHIDRIC SULFHIDRIC O O O GLUCOSA GLUCOSA GLUCOSA

GLUCOSA

FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD FERMENTADA A A A SHIGUELLA SPP. LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI SACAROSA SACAROSA SACAROSA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADA S

FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD AS AS AS