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BIOQUÍMICA.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: CATECOLASA o


POLIENOLOXIDASA.

Karen J .Sarmiento1, Lina M. Unriza 2

Resultados y análisis.

a) Verificación de la actividad enzimática

Muestra Lo observado
(Cloración).
Extracto+Catecol Coloración rojiza (+++)
Extracto+agua destilada Muestra turbia con ligera coloración.
Catecol+agua destilada Incoloro

Figura1 muestra 1 extracto con catecol, muestra 2 extracto con agua destilada, muestra 3 catecol con
agua destilada

La actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que transforma a


sustrato por segundo, es decir la enzima se unió con el sustrato formando un complejo
enzima sustrato.
La reacción del extracto con catecol dio una coloración rojiza ya que el sustrato hace
contacto con el sitio activo de las enzimas presentes en el extracto de papa.

b) Efecto de la temperatura.

Muestra. Coloración.
o Coloración amarilla
Tubo 1 a 0 C (en hielo)

Tubo 2 a 37oC (en baño de agua) Coloración marrón

Tubo 3 a 60oC (en baño de agua) Coloración rosa

Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo) No hay reacción (-)

Tubo 1 a 37oC (en baño de hielo) Coloración naranja(++)

Tubo 3 a 37oC (en baño de agua) Coloración rosa.

La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, al igual que la mayoría de las
reacciones químicas, aumenta con la temperatura, esto se debo principalmente al efecto sobre
las constantes de velocidad de las diversas reacciones parciales que componen la reacción
total y la afinidad de la enzima por los cofactores, activadores, etc. Los valores de pk de los
grupos ionizables involucrados en la reacción son también afectados por la temperatura. Con
los resultados obtenidos en el laboratorio de puede deducir que a elevada temperatura en este
caso dejar la muestra a 92°, la proteína de la enzima se desnaturalizo por eso vemos la muestra
con un tono más claro que las demás en esta última fase, al tener desnaturalizada la proteína
tenemos como resultado una pérdida de actividad. Lo que significa que la velocidad inicial
de la reacción aumento con la temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de
medir debido a una inactivación casi inmediata. Y con lo consultado en la teoría las enzimas
son completamente inactivadas a una temperatura por enzima de 70°c.

Figura temperatura óptima (T) de una enzima

La temperatura óptima es el resultado de un balance entre el incremento en la actividad y la


velocidad de destrucción de la enzima.

Las modificaciones de la temperatura afectan al grado de ionización y por lo tanto a la


proporción de enzima y sustrato en forma de especie iónica activa

c) efecto de la temperatura 2

MUESTRA LO OBSERVADO
Tubo 1 extracto que estaba 0°c en hielo Coloración amarilla intensa
Tubo 3 extracto a 60°c ( en baño de agua) Se mantiene la coloración inicial

1 2
Figura 4 resultados de las muestras llevadas a 37°c

Al dejar la muestra 3 en el primer tiempo a una temperatura de 60°c no se vio la


desnaturalización de la enzima pero luego de dejarla en un segundo tiempo en baño de maría
a 37°c alcanzo una temperatura óptima lo cual permitió parte de la desnaturalización de la
enzima.

Mientras que la del tubo uno que inicialmente estuvo en hielo y en el segundo tiempo se llevó
a temperaturas de 37°C no hubo una desnaturalización en la muestra porque la temperatura
no era alta para que afectara la velocidad de la reacción de la enzima, para que hubiera
logrado la desnaturalización.

c) Especificidad por el sustrato.

Muestras a comparar. Cloración.


1y2 Tubo 1 presenta coloración (+++)
Tubo2 incoloro
3y4 Tubo 3 coloración leve (+)
Tubo 4 incoloro
5y6 Tubo 5 coloración leve (++)
Tubo 6 incoloro
7y8 Tubo 7 y 8 (-) incoloros

2 3 4
1

Comparacion de muestras es en siguiente orden .


1. tubo 1: muestra con extracto enzimatico, catecol y agua
tubo 2: muestra con catecol y agua
2. tubo 3: muestra con extracto enzimatico,fenol y agua
tubo 4: muestra con fenol mas agua
3. tubo 5 : muestras con extracto enzimatico ,hidroquinona y agua
tubo 6 : muestra con hidroquinona y agua
4. tubo 7 : muestra con resorcinol y 1 ml agua
tubo 8: muestra con resorcinol y 2 ml de agua

la especificidad por el sustrato reside en una region que se encuentra en la superficie de la enzima,
denominada centro de fijacion del sustrato o centro activo. La estructura terciaria de la enzima esta
plegada de tal manera que se origina una region con las dimensiones moleculares idoneas para
acomodar un sustrato especifico.algunas enzimas muestran especificidad absoluta por un
determinado sustrato hay que aclarar que este tipo de comportamiento no es de todas las enzimas.

Las muestras de igual forma se llevaron a ebullicion para que el sustrato se active y se lleve a cabo
la reaccion, no se puede dejar a una mayor temperatura ya que podria dañar la celulas presentes
en las muestras.

Se puede ver que la especificidad del sustrato catecol con el extracto enzimatico no es alto ya que
no hubo la formacio

La muestra de catecol,fenol, hidroquinona y resorcinol al diluirlas en agua presento solubilidad,


esto se debe a que se pudo asociar las moleculas de cada solvente por puentes de hidrogeno.

d) Naturaleza química de las enzimas

Muestra Observaciones
Extracto enzimático + Tripsina +catecol ++ se observa coloración

Extracto enzimático+ CCl3COOH (-)


+catechol
Extracto enzimático+Feniltiourea (-)
+catecol

Extracto enzimático+ Agua +catecol (++) se observa coloración

La enzima tripsina manifiesta una especificidad notable en las reacciones que


cataliza, de modo que las proteínas se puede romper en diferentes puntos, la enzima
tripsina ataca los puntos del carboxilo de los aminoácidos que tienen un grupo
funcional básico en el grupo R (es decir cerca de la arginina, lisina, y en ocasiones la
histidina)

La feniltiourea funciona como un inhibidor la cual es añadida en pequeñas


concentraciones que provoca el descenso de la velocidad es decir el residuo del amino
terminal se etiqueta y se separa del péptido sin afectar a los enlaces pepetidicos.

Figura. Degradación de edman ruptura selectiva de los aminoácidos terminales.

e) Efecto del pH sobre la actividad de la catecolasa.

Muestra Observaciones
Extracto enzimático+ Buffer pH=3+catecol (-)

Extracto enzimático+ Buffer pH=5 (-)


+catecol

Extracto enzimático + Buffer pH=7 (-)


+catecol

Extracto enzimático+ Buffer pH=9 (-)


+catecol

En esta prueba se obtuvo resultados negativos donde no se observó coloraciones.


Debido a una falla durante el proceso, no se adiciono el sustrato catecol y no se obtuvo
los resultados deseados para evaluar el pH óptimo de actividad para el extracto
implementado.
A continuación se presenta lo que se deseaba obtener basándonos en resultados
obtenidos y consultados en la web.
Fig.5. Resultados encontrado en la web de pH y actividad enzimática donde se observa que la
catecol oxidasa tiene un pH óptimo de 7.

Se representa a continuación como se comportaría la gráfica de pH óptimo de la


catecolasa donde se observa en el eje y la cantidad de producto elaborado y en x el
pH al que se ha sometido la enzima, donde se observa en el vértice las condiciones
de pH optimas de actividad catalítica.

Grafica1. Representacion aproximada del pH optimo de actividad catalitica para el extracto de papa
sabanera la cuao presenta en su tejido la enzima catecolasa.

Se observa que a pH ácidos no se lleva acabo actividad o esta es muy mínima ya que
no se observa gran cantidad de producto obtenido por la coloración, los pH alrededor
de 7 muestran una mayor concentración de color lo que indica una mayor actividad
catalítica en estas condiciones.
Muchas enzimas presentan su actividad máxima en estrechos intervalos de pH, la exposición
a valores de pH por fuera del intervalo, puede conducir a la pérdida irreversible de actividad;
lo que podemos interpretar de la gráfica que en pH muy ácidos y básicos la actividad catalítica
es mínima o nula.

Fig.6. La desnaturalización de una enzima cuando se expone a condiciones ácidas. Tenga en cuenta que
debido a la alta [H +] tanto básica (azul) y cadenas laterales (rojo) ácidas están unidos a H + cuando se
expone a un pH bajo. Como resultado, los enlaces iónicos que normalmente mantienen la forma del sitio
activo en su confirmación adecuada a pH neutro (a la izquierda) no se puede formar a pH bajo (derecha). Por
tanto, la enzima es incapaz de unirse sustrato y llevar a cabo su actividad catalítica.

f) Efecto de la concentración de catecol sobre la reacción

Muestra Observaciones
1. Agua+ Extracto enzimático (-)

2. catecol + agua+ Extracto (++)


enzimático

3. catecol + agua+ Extracto (+++)


enzimático

4. catecol + agua+ Extracto (+++)


enzimático

5. catecol + agua+ Extracto (+++)


enzimático

6. catecol + agua+ Extracto (+++)


enzimático

Fig.7. De izquierda a derecha se observa la coloración respectiva dependiendo de la variación de la cantidad


de sustrato (catecol), adicionando después la misma cantidad de extracto enzimático en cada tubo, obteniendo
una prueba negativa incolora donde no hay presencia de sustrato y posteriormente se ve la variación en la
concentración de coloración al aumentar la cantidad de sustrato.

En este ensayo se toman 6 tubos a los cuales se les adiciono diferentes cantidades de catecol
en orden decreciente y un tubo de ensayo en ausencia de este. Después se procedió a adicionar
una misma cantidad a cada uno de extracto enzimático. Observamos coloraciones leves en
los tubos 2 y 3 y mayor coloración en los tubos 4,5 y 6.
Se observa que la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de
sustrato. En altas concentraciones todos los sitios activos de la enzima están completamente
ocupados. Esto significa que la enzima es más activa cuando las concentraciones de sustrato
están en un nivel alto. Pero hasta cierto nivel, cuando las concentraciones de sustrato son lo
suficientemente altas la velocidad de reacción se hace constante a medida que todos los sitios
activos están totalmente ocupados. Como se representa en la Gráfica.2. Se puede decir que
en los tubos 2 y 3 hay poca cantidad de catecol (sustrato) que pueda interactuar con los
diferentes sitios activos de la enzimas presentes en la muestra, por lo que no se observa una
alta coloración como en los tubos 4,5 y 6 que nos indica que hay mayor cantidad de catecol
disponible ocupando los sitios activos de las enzimas (catecolasa) obteniendo mayor
actividad enzimática.

Grafica2. Si la cantidad de enzima se mantiene constante pero la cantidad de sustrato es aumentada


gradualmente, entonces la tasa de velocidad a la cual la enzima trabaja (convierte sustrato a producto) se
incrementará hasta alcanzar un máximo.

g) Efecto de la cantidad de la polifenoloxidasa sobre la reacción

Muestra Observaciones
1. Agua+ Catecol Sin coloración (-)

2. catecol + agua+ Extracto (+) coloración naranja ladrillo


enzimático

3. catecol + agua+ Extracto (++)


enzimático

4. catecol + agua+ Extracto (++)


enzimático

5. catecol + agua+ Extracto (+++)


enzimático
6. catecol + agua+ Extracto (+++)
enzimático

Fig.8. Coloraciones obtenidas usando diferentes cantidades de extracto enzimático proveniente de la papa
sabanera. Consiguiendo un resultado negativo en ausencia del extracto enzimático y desde el tubo 2 de izquierda
a derecha se observa coloración que va aumentando al aumentar la cantidad de extracto enzimático debido a
que entre mayor cantidad de enzimas se podrá disponer del sustrato que se encuentra presente.

Cuando un sustrato se fija en el sitio activo de una enzima, se forma un complejo enzima-
sustrato. La enzima lleva a cabo una reacción y a continuación la formación de un producto.
Se considera la reacción directamente proporcional a la concentración de enzima. La reacción
se incrementará en proporción al incremento en la concentración de la enzima sólo si el
sustrato está presente en exceso de tal forma que la reacción no esté limitada por la
disponibilidad del mismo.

Una molécula de enzima se une a su sustrato (s), cataliza una reacción, y libera el producto
(s).cada molécula de enzima requiere x cantidad de tiempo para producir una unidad de
producto. Las moléculas de enzima que están disponibles, generan cierta cantidad de
productos en x tiempo, por ejemplo, dos moléculas de enzima producirían dos unidades en
ese período de tiempo, tres moléculas de enzima producirán tres unidades de producto, etc.
Así, entre más enzimas se encuentren disponibles, el sustrato más rápidamente se puede
convertir en producto. Entonces, suponiendo que todos los demás factores son constantes a
medida que aumenta la concentración de enzima, hay un incremento proporcional en la
velocidad de reacción Grafica3.
Grafica3. Incremento proporcional en la velocidad de reacción a medida que hay un incremento en la
concentración de las enzimas.

A continuación se presenta una imagen encontrada en la literatura que representa el efecto


de la concentración enzimática con una determinada cantidad de sustrato.

Img.1.Un ejemplo del efecto de la concentración de la enzima. Se observa en la parte superior, cuatro
moléculas de enzimas que son capaces de convertir tres moléculas de sustrato en producto en x tiempo,
mientras que en la parte inferior doce moléculas de enzimas son capaces de producir 15 moléculas del
producto en la misma cantidad de tiempo

Lo anterior se puede observar en la practica desde el tubo 2 y 3 los cuales presenta una
coloración leve lo que quiere decir que en nuestra muestra se debe encontrar un nivel bajo de
enzimas para reaccionar con el sustrato disponible en el medio. Pero desde el tubo 4,5 y 6 se
va observando un grado de coloración mayor a medida que se va incrementando la cantidad
de extracto enzimático, ya que hay mayor cantidad de moléculas enzimáticas que tiene sus
sitios activos ocupados llevando a cabo la reacción y produciendo mayor cantidad de
productos que en los primeros tubos.

h) Efecto del ácido cítrico sobre la actividad de la catecolasa

Muestra Lo esperado Observaciones


1. trozo de papa+ Se observara una coloración Coloración café al transcurrir el
agua +catecol café. tiempo.
2. trozo de papa + No se observaran cambio en No hay cambios de coloración en
ácido cítrico+ la coloración de la papa. el tiempo.
catecol

Fig. 9. Se observa de izquierda a derecha sobre un vidrio de reloj, el resultado obtenido al colocar un trozo de
papa con su superficie raspada cubierta con ácido cítrico y la segunda con agua destilada, ambas muestras
contienen el sustrato catecol. En la primera muestra no se observa reacción al pasar el tiempo en la segunda se
observa la reacción de pardemaiento enzimático.

Para esta prueba se implementó como fuente de extracto enzimático a la papa sabanera, donde
se tomó dos trozos regulares de esta y se procedió a raspar la superficie. Un primer trozo se
cubrió con ácido cítrico y el segundo se cubrió con agua destilada y posteriormente se
adiciono como sustrato catecol. A los 3min aproximadamente se observaba una reacción en
el segundo trozo mostrando una coloración café como resultado, el cual nos indicaba que se
estaba llevando a cabo actividad enzimática en el tejido de la papa como se observa en la
Fig.9

Cuando las frutas o verduras se pelan o se cortan, las enzimas contenidas en las células
vegetales son liberadas. En presencia de oxígeno del aire, la catecolasa enzima que cataliza
en un paso compuestos fenólicos vegetales forma pigmentos marrones conocidos como
melaninas.

Esta reacción, denominada pardeamiento enzimático, se produce fácilmente a temperaturas


cálidas cuando el pH está entre 5,0 y 7,0

Una vez cortado o magullado, el tejido vegetal de los alimentos estos presentan una
coloración marrón que se forma muy rápidamente cuando se expone al aire, se observa que
esta reacción de puede reducir e incluso prevenir mediante la aspersión de jugo de limón por
encima de ellos. La reacción que tiene lugar es una oxidación, la conversión de los
compuestos fenólicos en quinonas (Esquema 1).
Esquema1. Oxidación por la polifenol oxidasa (PPO)

Se consultó sobre el uso de ácido cítrico y la prevención del pardemainto enzimático. El pH


óptimo para la polifenol oxidasa se ha reportado a partir de ácido a neutro en la mayoría de
frutas y verduras, y la actividad óptima se observa a pH 6 a 7, y se detecta actividad mínima
por debajo de pH 4,5. Esta es la razón detrás del uso de productos químicos que reducen los
productos de pH o acidulantes para ayudar a controlar el pardeamiento enzimático.
Acidulantes, tales como ácidos cítrico, málico y fosfórico, son capaces de disminuir el pH de
un sistema, reduciendo así la actividad de la polifenol oxidasa.

El ácido cítrico baja el pH del tejido de la fruta para retardar la acción de la polifenol oxidasa.
Si el pH se reduce por debajo de 3,0, se inactivó la polifenol oxidasa.

El ácido cítrico también actúa como un agente quelante, atando los iones de cobre que son
cofactores necesarios en la reacción.

A continuación se presenta la reacción que permite que al agregar, en este caso ácido
ascórbico no se lleve a cabo la reacción de pardeamiento enzimático. (Esquema.2)

Esquema2.Por la oxidación del ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico, las quinonas se reducen de nuevo a
fenoles y / o el oxígeno se retira del entorno inmediato
Fig9.Tejido cuando se expone al aire. La mitad izquierda ha sido tratada con ácido cítrico, que previene el
pardeamiento, mientras que la mitad derecha se le ha permitido cambiar con el tiempo. Las moléculas que se
muestran son un fenol (izquierda), que se convierte en una benzoquinona, un bloque de construcción de los
polímeros de melanina para dar una coloración marrón.

Conclusiones.

1. Se comprende la acción del ácido cítrico en el impedimento del pardeamiento


enzimático actuando como un antioxidante, el ácido puede mejorar el color y la
apariencia de muchos tipos de productos alimenticios. Al eliminar el oxígeno de sus
alrededores, el ácido en su forma reducida se convierte en la forma oxidada. Esta
acción oxidante reduce el oxígeno disponible en el entorno del tejido de inmediato.
2. Se reconoció el funcionamiento de la enzima presente en el extracto de papa que se
utilizó en la práctica, la catecol oxidasa, que se encuentra en los tejidos vegetales.
Como su nombre implica, catecol oxidasa oxida (elimina hidrógeno a partir de) el
catecol que es el sustrato, también se encuentra en las plantas, y se convierte en
benzoquinona, dando un color marrón característico. Esta reacción explica el
oscurecimiento de frutas y hortalizas al sufrir algún golpe, corte o magulladura. La
catecol oxidasa se libera cuando una célula vegetal está dañada, y reacciona con
catecol para formar benzoquinona en presencia de aire.
3. Se encuentra que hay una cierta temperatura en que se lleva a cabo la actividad
catalítica de una enzima se observó que esta temperatura óptima es generalmente
alrededor de 60ºC (lo observado en la práctica) obteniendo una coloración intensa
debido a la alta cantidad de productos presentes. Por encima de esta temperatura se
trabajó a 90ºC sin obtener reacción con lo que se demuestra que la estructura de la
enzima comienza a descomponerse (desnaturalizarse).
4. Se concluye que a temperaturas inferiores de la temperatura óptima de actividad la
muestra no lleva a cabo actividad catalítica enzimática, pero si esta muestra
posteriormente se somete a la temperatura de actividad al poco tiempo se genera
productos observando un cambio en la coloración.
5. No se logró llevar a cabo el ensayo para determinar un pH óptimo para la actividad
catalítica de la enzima catecolasa y como el pH afecta su actividad. Se consultó y se
encontró que esta enzima presente en el tejido de papa presenta una actividad óptima
en un pH 7.
6. Se logra interpretar las gráficas de la velocidad de una reacción catalizada por
enzimas que depende de las concentraciones de enzima y sustrato. A medida que la
concentración de cualquiera que se aumenta la velocidad de reacción aumenta.

Bibliografía.
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