6.

- Pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer:

Las pruebas Rojo de Metilo (RM) y Voges Proskauer (VP) son reacciones complementarias que ayudan a
diferenciar géneros de la familia Enterobacteriaceae. Están basadas en el metabolismo de la glucosa y demuestran las
vías de utilización de la misma. La prueba RM mide cualitativamente la producción de ácido y variación leve de pH
dentro de la acidez producida por la fermentación de glucosa, la cual evidencia si ésta fue hidrolizada por la vía de los
ácidos mixtos (pH final menor de 4,5), o por la vía del butilenglicol (pH final superior a 4,5). El Rojo de Metilo de pH
de 4,4 a 6; a un pH de 4,4 ó menos, se mantiene rojo, mientras que a pH mayores de 5 varía de amarillo a naranja. La
reacción VP se fundamenta en la determinación del acetilmetil carbinol (acetoína), producto final derivado del
metabolismo de la glucosa. La acetoína se forma por descarboxilación de 2 moléculas de piruvato, según la reacción:

2 piruvato -------- Acetoína + 2CO2 Acetoína -------- 2,3 butanodiol + 2CO2 + H2

En presencia de oxígeno atmosférico y álcalis, los productos finales neutros, acetoína y 2,3 butanodiol, son
oxidados en diacetilos, que es el reactante para el color producido en la reacción VP.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con caldo glucosado (Medio RM/VP).

Procedimiento:

Inocular 2 tubos con caldo glucosado.

Incubar a 37 ºC por 24 horas en ambiente de aerobiosis.

Añadir reactivos en uno de los tubos para RM y en otro para VP.

Interpretar de acuerdo a lo descrito anteriormente.

Interpretación de la reacción RM:

Reacción positiva = Anillo rojo al agregar el reactivo

Reacción negativa = Anillo amarillo a naranja al agregar el reactivo

Interpretación de la reacción VP:

El resultado se evidencia al utilizar los reactivos -Naftol y KOH ó NaOH al 40%.

-Naftol actúa como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción sin pérdida de la
especificidad. KOH ó NaOH al 40% contribuye a la absorción del CO 2 y reacciona con la peptona dando un color
rosado salmón.

Es necesario agitar los tubos para aumentar el oxígeno que oxida la acetoína, luego dejar reposar unos 15 minutos e
interpretar la reacción del color.

7.- Utilización De Manitol, Sorbitol E Inositol:

El manitol es un alcohol polihídrico producto de la reducción de monosacáridos. Su fermentación es una de las

pruebas útiles para la identificación de enterobacterias frecuentes en el área de microbiología clínica. Sorbitol e inositol
también son alcoholes polihídricos; la formación de ácido a partir de estos compuestos sirven para la identificación
bacteriana. El inositol ayuda a diferenciar los géneros Aeromonas (-), Plesiomonas (+) y Vibrio (-). El sorbitol e
inositol, igual que el manitol, son pruebas sugeridas para la diferenciación de géneros y especies de la familia
Enterobacteriaceae y otros Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

 Tubos con caldos inositol, sorbitol y manitol.

Procedimiento:

Inocular los tubos y las placas.

Incubar a 37 ºC por 24 horas en ambiente de aerobiosis e interpretar.

Interpretación:

Reacción positiva = Amarillo Reacción negativa = Rosado

8.- Utilización del citrato:

Esta reacción se efectúa en un medio que contiene sales de amonio, como única fuente de nitrógeno y, citrato
como única fuente de carbono. El citrato se metaboliza rápidamente a través del ciclo de Krebs. Un microorganismo
capaz de utilizar el citrato utiliza así mismo las sales de amonio, las cuales se desdoblan en amoníaco produciendo
alcalinización del medio y por lo tanto viraje del indicador Azul de Bromotimol. El medio no inoculado es verde, se
torna azul a pH 7,6.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con medio citrato

Procedimiento:

Inocular el medio con las cepas asignadas.

Incubar a 37 ºC de 24 a 72 horas en ambiente de aerobiosis e interpretar.

Observar el crecimiento y cambio de coloración.

Interpretación:

Reacción positiva = Hay crecimiento bacteriano y/o cambio de color del indicador (AZUL)

Reacción negativa = No hay crecimiento bacteriano ni viraje del indicador (VERDE)

9.- Utilización del malonato:

El malonato es estructuralmente similar al succinato e interfiere en la oxidación del succinato a fumarato,

inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato-deshidrogenasa por un proceso denominado inhibición
competitiva. El succinato y el fumarato son metabolitos intermediarios del ciclo de Krebs, por lo tanto si no llegan a
formarse el ciclo se ve interrumpido y, en consecuencia, se produce inhibición del desarrollo microbiano, a menos que
el microorganismo sea capaz de utilizar el malonato como única fuente de carbono. Cuando el microorganismo utiliza
el malonato de sodio, utiliza también el sulfato de amonio presente en el medio como fuente de nitrógeno, formándose
hidróxido de sodio que alcaliniza el medio y produce un viraje del indicador Azul de Bromotimol.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con caldo malonato de sodio

Procedimiento:

Inocular un tubo con caldo malonato de sodio con la cepa asignada.

Incubar a 37 ºC por 24 horas en ambiente de aerobiosis

 Observar la reacción después de la incubación.

Interpretación:

Reacción positiva = Hay crecimiento bacteriano y/o cambio de color del indicador (AZUL)

Reacción negativa = No hay crecimiento bacteriano ni viraje del indicador (VERDE)

Metabolismo De Proteínas Y Aminoácidos.

10.-Descarboxilación de Aminoácidos:

La descarboxilación es un proceso irreversible y no oxidativo, mediante el cual, la bacteria que posee las
enzimas descarboxilasas específicas es capaz de metabolizar aminoácidos hasta aminas. Estas enzimas son inducidas
por acidificación del medio, por lo tanto, el medio de cultivo debe contener un carbohidrato que la bacteria pueda
degradar hasta ácido para inducir la producción de enzimas descarboxilasas. En el medio de cultivo que contenga lisina,
ornitina o arginina y un indicador de pH (Púrpura de Bromocresol), se puede observar que, si la bacteria inoculada no
sintetiza las enzimas descarboxilasas, el indicador vira a color amarillo debido a la acidez causada por la fermentación
de la glucosa que contiene el medio. Si el microorganismo produce las enzimas descarboxilasas, la acidez producida
por la utilización de la glucosa induce su síntesis, con la consiguiente descarboxilación del aminoácido hasta aminas,
las cuales a su vez elevan el pH y hacen virar al indicador a su color original. El Púrpura de Bromocresol es morado en
medio alcalino y amarillo en medio ácido.

El aminoácido lisina descarboxila hasta cadaverina; la ornitina hasta putrescina y la arginina a agmatina que es
luego hidrolizada a putrescina y urea. La descarboxilación de estos aminoácidos se puede evidenciar en caldo
descarboxilasa; además, la lisina se puede evaluar en medio agar lisina hierro (LIA), y la ornitina en medio motilidad
indol ornitina (MIO).

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con aminoácidos.

Tubos control

Vaselina o parafina líquida.

Procedimiento:

Inocular los tubos que contengan los aminoácidos.

Tapar con parafina líquida para hacer anaerobiosis.

Incubar a 37 ºC por 24- 48 horas en ambiente de aerobiosis.

Interpretar de acuerdo a lo descrito.

11.- Reacción en Medio Motilidad Indol Ornitina (MIO):

El medio MIO permite evidenciar la motilidad bacteriana, producción de la enzima ornitina descarboxilasa y la
producción de indol a partir de la hidrólisis del aminoácido triptófano, por acción de la enzima triptofanasa. Para
revelar la presencia del indol liberado, se agrega al tubo de prueba el Reactivo de Kovac, así, el indol reacciona con el
aldehído, para formar un compuesto de color rojo. Una reacción positiva se manifiesta por la aparición de anillo rojo en
la superficie del medio inmediato a la adición del revelador, un anillo amarillo significa que la prueba es negativa. El
Púrpura de Bromocresol es el indicador de pH del medio.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Medio MIO.
 Revelador (Reactivo de Kovac)

Procedimiento:

Inocular los tubos por punción.

Incubar de 24- 48 horas a 37 ºC en ambiente de aerobiosis.

Observar si hay crecimiento y/o turbidez en el medio y añadir el reactivo revelador.

Observar el color del anillo formado.

Interpretación:

Resultado Observación

Presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de

Positiva
siembra.
Motilidad
Negativa Crecimiento solo en la línea de siembra

Positiva Color púrpura

Ornitina Decarboxilasa
Negativa Color amarillo

Positiva Anillo rojo en superficie del tubo

Producción de Indol
Negativa Color del reactivo revelador incoloro-amarillento

12.- Reacción en Medio Fenilalanina Desaminasa (FAD):

La desaminación es producida por enzimas inducidas por el cambio de pH del medio. La formación de
enzimas desaminasas está condicionada por la alcalinidad del medio en el cual se encuentran las bacterias. El
aminoácido fenilalanina puede ser desaminado oxidativamente por algunas bacterias, produciéndose ácido
fenilpirúvico, el cual es un –cetoácido que se puede evidenciar por su propiedad de dar una coloración verdosa
cuando se le agrega cloruro férrico (en los casos positivos).

Materiales:

Cepa de E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con medio FAD

Revelador (Cloruro Férrico)

Procedimiento:

Inocular los tubos de FAD con las cepas indicadas.

Incubar a 37 ºC por 24- 48 horas en ambiente de aerobiosis.

Observar si hay crecimiento y añadir el reactivo revelador Cloruro Férrico

Interpretar de acuerdo a lo descrito en el fundamento.

13.- Desaminación y descarboxilación de la lisina en Agar Lisina Hierro (LIA)

 El Agar Lisina Hierro y es un medio utilizado para la diferenciación de microorganismos entéricos en base a
su capacidad para desaminar o descarboxilar la lisina y de producir sulfuro de hidrógeno. En este medio el hidrocloruro
de L-lisina es el sustrato donde actúan las enzimas descarboxilasa o desaminasa, mientras que el citrato férrico de
amonio y el tiosulfato de sodio actúan como indicadores de la producción de H 2S. El Púrpura de Bromocresol se utiliza
como indicador de pH.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos con medio LIA.

Procedimiento:

Inocular los tubos por punción y estrías.

Incubar de 24- 48 horas a 37 ºC en ambiente de aerobiosis.

Examinar los tubos para observar cambios de color y ennegrecimiento

Interpretar los resultados observados.

Interpretación:

Prueba Reacción positiva Reacción negativa

Descarboxilación de la
Fondo y superficie del medio de color Fondo amarillo (ácido), superficie
Lisina púrpura (alcalino) púrpura (alcalina)

Desaminación de la Lisina Superficie roja Superficie púrpura

Formación de un precipitado negro en la No hay formación de precipitado

Producción de H2S superficie negro

14.- Producción en la enzima Ureasa:

Prueba que permite determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos moléculas de
amoníaco, por acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad. En el caldo de urea el extracto de levadura es la
única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo
bacteriano. Se utiliza como indicador de pH Rojo de Fenol y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas
bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando
amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo
fenol del amarillo al rojo.

Materiales:

Cepas: E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. marcescens, P. aeruginosa.

Tubos caldo de urea.

Procedimiento:

Inocular los tubos con caldo de urea.

Incubar de 24- 48 horas a 37 ºC en ambiente de aerobiosis.

Examinar los tubos para observar cambios de color del indicador de pH.

Interpretación:
 Resultado positivo Cambio de color del indicador a rosa-rojo intenso

Resultado negativo No hay viraje del indicador (amarillo-naranja).

BIBLIOGRAFÍA

Forbes, B. A. 2009. Diagnóstico Microbiológico. 12ava Edición. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires. 160 pp.

Koneman, E. W. y Allen, S. D. 2008. Koneman Diagnóstico Microbiológico: texto y atlas en color. 6a Edición.
Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires. 1691 pp.

Mac Faddin, J. F. 2003. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.
Editorial. Médica Panamericana, Buenos Aires. 850 pp.

Murray, P. R. y Pfaller, M. A. 2006. Microbiología Médica. 5a Edición. Editorial Elsevier España. 976 pp.

Romero Cabello, R. 2007. Microbiología y Parasitología Humana. 3a Edición. Editorial Médica Panamericana, Buenos
Aires. 1802 pp.
 PRÁCTICA 9

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS.

Objetivos Específicos

Poner en práctica la prueba de susceptibilidad de algunas especies de bacterias frente a antibióticos, siguiendo el
método de difusión en agar.

Generalidades

Es importante que las pruebas de susceptibilidad se realicen de un modo estandarizado, ya que los resultados
pueden variar mucho en función de las condiciones de trabajo (inóculo, medio de cultivo, pH). De ahí que se
recomiende seguir las pautas indicadas por la National Comite for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).

Los métodos de laboratorio para estudiar susceptibilidad antibacteriana son:

Difusión (Antibiograma): la difusión en agar sigue siendo el método más utilizado en microbiología, pues se
obtienen resultados exactos y precisos mediante un método sencillo. Para ello se requiere que todos los detalles del
procedimiento estén cuidadosamente controlados y sean uniformes.

Pueden utilizarse como métodos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, que es lo más frecuente,
informando los resultados de un antibiograma en tres categorías: Resistente (R); Intermedio (I) y Sensible (S), según
los diámetros (mm) de los halos de inhibición obtenidos.

El procedimiento descrito por Kirby y Bauer (1966) se basa en que, al añadir el antibiótico contenido en un
disco, va a difundir en el medio, produciendo un gradiente de concentración. Según nos alejamos del lugar donde se
sitúa el disco, la concentración irá descendiendo. La distancia en la que se inhibe el microorganismo inoculado en el
medio, alrededor del disco de antimicrobiano se denomina halo de inhibición.

Dilución: Dan resultados cuantitativos destacando dos de ellos:

2.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI); que es la mínima concentración de antibiótico capaz de inhibir
el crecimiento del microorganismo.

Concentración Mínima Bactericida (CMB); que es la concentración del antibiótico capaz de matar el microorganismo.

Las diluciones se pueden realizar en agar o en caldo, éste último puede realizarse en tubos o por microdilución.
Para cualquiera de ellos se utilizan medios de cultivos con concentraciones crecientes del antibiótico. El método de las
diluciones es laborioso, ya que requiere la preparación de distintos medios en placas o tubos para cada antimicrobiano
de prueba.

TRABAJO PRÁCTICO

Material para el Antibiograma:

Discos de antibiótico

Solución Salina fisiológica al 0.89% estéril

Pinzas estéril

Hisopos palo madera

Placas con agar Mueller- Hinton

Cepas bacterianas en cultivos joven0

Procedimiento:

Inóculo y medio:
Se toman de 4 a 5 colonias aisladas a partir de un cultivo puro desarrollado en fase logarítmica. La densidad de la
suspensión se ajusta a alrededor de 10 8 unidades formadores de colonias (UFC) por mililitro, comparando su
turbidez con el estándar 0,5 de McFarland. El grado de turbidez del medio líquido se compara con el
estándar, ambos se observan contra un fondo blanco con líneas negras.

Se toma un hisopo estéril y se impregna del inóculo preparado, se elimina el exceso de líquido exprimiendo el
exceso rotando el algodón contra las paredes internas del tubo.

Se siembra la superficie entera del agar Muller- Hinton por estrías, en tres direcciones diferentes, rotando la placa en
ángulo de 60º.

Se cierra la placa y se deja reposar entre 3 a 5 minutos.

Colocación de los discos con antibióticos:

Se aplican los discos sobre la superficie del agar empleando el dispensador y/o manualmente usando cada magazine
con discos.

Se presionan suavemente los discos contra la superficie del medio, empleando pinzas estériles y previamente
flameadas y enfriadas en cada disco.

Los discos llevan una determinada concentración de cada antibiótico y deben estar separados unos de otro, al menos,
15 mm de distancia entre ellos y el borde de las placas para evitar la superposición de los halos o zonas de
inhibición.

Pasados unos 20 min. de la aplicación de los discos se incuban las placas de 18 a 24 horas a 37 ºC en ambiente de
aerobiosis.

Lectura:

Suele realizarse tras la incubación en aerobiosis por 18 a 24 horas. Se mide el diámetro (mm) de los halos de
inhibición.

Se interpretan en función del antibiótico y el microorganismo.

 PRÁCTICA 10

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE LAS BACTERIA

OBJETIVO:

Comprobar en el laboratorio la acción de agentes físicos y químicos sobre las bacterias.

GENERALIDADES:

Los microorganismos igual que el resto de los organismos vivos están inmersos en un medio ambiente, donde
su fisiología y desarrollo va a depender de su sistema enzimático y de los factores ambientales en que se encuentren.
Esas condiciones pueden modificar en mayor o menor grado el crecimiento de las bacterias provocando la inhibición y
muerte de las mismas de acuerdo a su mecanismo de acción. Los agentes que actúan sobre los microorganismos pueden
ser de naturaleza química o física.

Agentes Físicos:

Efecto de la temperatura:

Las bacterias de acuerdo a sus requerimientos de temperatura, se clasifican en psicrófilas, mesófilas y termófilas,
teniendo cada una de ellas una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. La destrucción de las bacterias
por calor depende de la temperatura a la que se coloque y de la sensibilidad del microorganismo; lo cual varía mucho
de una especie a otra.

Efecto de la presión osmótica:

El agua es un elemento fundamental en el desarrollo de las bacterias y esta en íntima relación con la concentración de
solutos. Algunas bacterias pueden soportar una elevada presión osmótica y son los llamados osmófilos; cuando esta
presión es ejercida por el cloruro de sodio se denomina halófila.

Efecto del oxigeno:

Las bacterias de acuerdo a los requerimientos de oxigeno se clasifican en anaerobios obligados, anaerobios
facultativos, aerobios estrictos, microaerofilos, anaerobios aerotolerantes.

Efecto de las radiaciones ultravioleta:

La luz ultravioleta actúa sobre el ADN bacteriano produciendo alteración en la secuencia de nucleótidos, caracterizados
por la formación de dímeros de timina o produciendo peróxidos los cuales inhiben el desarrollo bacteriano.

Efectos de agentes mecánicos:

De éstos el más utilizado es el proceso de filtración, que consiste en hacer pasar líquido a través de una membrana
porosa, que tiene poros más pequeños que las bacterias, e incluso virus, con lo que las sustancias quedan libres de
microorganismos. También se encuentran en este grupo, las vibraciones ultrasónicas.

Agentes químicos:

Efectos del pH:

Las bacterias de acuerdo a sus requerimientos de pH se clasifican en acidofilas, basofilas y neutrofilas. Si se cultiva una
bacteria neutrofila en un medio con pH ácido o alcalino, éste inhibe su desarrollo.

Acción de los colorantes:

Los colorantes actúan inhibiendo selectivamente el crecimiento de las bacterias Gram positivas debido al carácter ácido
de las nucleoproteínas, un ejemplo de ello es el cristal violeta, verde brillante, etc.

Acción de los desinfectantes:

 Los desinfectantes son compuestos químicos que tienen acción bactericida o bacteriostática dependiendo de su
concentración. Un desinfectante es más eficaz cuando es capaz de actuar en el tiempo más corto y en concentración
más baja.

Acción de los antisépticos:

Los antisépticos son sustancias que se oponen a la sepsis o a la putrefacción, ya sea por acción letal sobre los
microorganismos o impidiendo su desarrollo. Se aplican de forma tópica sobre tejidos vivos, interfiriendo en el
desarrollo de gérmenes sobre la piel o mucosas, heridas o abrasiones.

TRABAJO PRÁCTICO

Acción de agentes físicos

Efectos de la temperatura:

Material necesario:

- placas con agar nutritivo

- Asa de platino

- Cepa de E. coli

- Cepa de Bacillus cereus

- Cepa de S. aureus

- Cepa de P. aeruginosa

Procedimiento:

Inocular con asa bacteriológica 3 placas de agar nutritivo con cada una de las cepas indicadas e incubar a temperatura
de 10 ºC, 55 ºC y a la temperatura del laboratorio por 24 horas. Observar e interpretar resultados.

Efectos de la presión osmótica:

Material necesario:

- 3 placas de agar nutritivo con 0.1, 1 y 6.5% de cloruro de sodio añadido.

- Asa de platino

- Cepa de E. coli

- Cepa de S. aureus

- Cepa de Enterococcus

- Cepa de K. pneumoniae

Procedimiento:

Inocular con asa bacteriológica las placas de agar nutritivo que contienen las diferentes concentraciones de cloruro de
sodio. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Observar e interpretar resultados.

Acción de agentes químicos:

Efectos de los colorantes, antisépticos y desinfectantes:

Material necesario:

- Placas de agar nutritivo o agar BHI.

- Hisopos de palo de madera estéril

- Cepas bacterianas

- Soluciones colorantes, antisépticas y desinfectantes.

Procedimiento:

1. Sembrar por diseminación con hisopo sobre una placa de agar la cepa en estudio, cubriendo toda la superficie de la
misma.

2. Dividir la placa y rotular cada sector con las iniciales del antiséptico, del desinfectante o del colorante a colocar.

3. Con la ayuda de una pinza colocar los discos previamente impregnados con la sustancia en el lugar correspondiente a
cada una de ellas.

4. Incubar por 24 horas a 37 ºC.

5. Interpretar el efecto, considerando la medida de los halos e inhibición producidos por la acción de cada antiséptico,
desinfectante o colorante probado.