EXPERIMENTO No.

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ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CITOCROMO OXIDASA EN TEJIDOS
OBJETIVOS:
1.Demostrar la actividad de la a citocromo oxidasa pr sente en el corazón de rata.
2. Demostrar la inhibición de la enzima citocromo oxidasa de corazón de rata por
efecto de cianuro de potasio (CN).
3. Valorar a través del análisis del experimento, la importancia del citocromo oxidasa
en la cadena respiratoria
INTRODUCCIÓN
La energía de la oxidación completa de los combustibles es transducida a enlaces
fosfato
de alta energía del trifosfato de adenosina (ATP) por el proceso de fosforilación
oxidativa.
La mayor parte de la energía de la oxidación de combustibles en el ciclo del ácido
tricarboxilico o ciclo de Krebs y otras vías es conservada en la forma de coenzimas
reducidas NADH y FADH2. La cadena transportadora de electrones oxida al NADH y
FADH2 y dona los electrones al oxígeno, el cual es reducido a H20. La energía
liberada en la reducción del oxígeno es usada para la fosforilación del ADP a ATP por
la ATP sintasa.
El último complejo citocromo de la cadena transportadora de electrones es el del
citocromo oxidasa existe en todos los tejidos del cuerpo, excepto en células donde no
hay mitocondrias y se encuentra en más altas concentraciones en el músculo cardiaco.
Por este complejo pasan los electrones del citocromo c al O₂. La citocromo oxidasa
contiene los citocromos a y a3, así como el sitio de unión al oxígeno. Una sola
molécula de O₂ debe aceptar cuatro electrones para ser reducida a 2H2O. La unión a
los iones cobre (Cu +2 en el complejo citocromo oxidasa facilita la captación de los
cuatro electrones y la reducción del O₂ A través de estudios efectuados con
inhibidores, como monóxido de carbono, se ha concluido que el citocromo oxidasa es
una proteína que contiene hierro que se encuentra en el anillo de porfirina. La actividad
de la enzima y su inhibición por CN puede ser demostrada en una preparación por la
oxidación secundaria de sustancias tales como el indicador de óxido-reducción
llamado p-Fenilendiamina, el cual se o púrpura al oxidarse. En la célula, el cianuro se
une al Fe3+ en el hemo del citocromo aa3, componente de la citocromo oxidasa,
impidiendo el transporte de electrones al O₂. La respiración mitocondrial y producción
de energía cesa y la muerte celular ocurre rápidamente.
La p-fenilendiamina reducida compite con el citocromo e reducido en su papel de
donador de electrones para la citocromo oxidasa; ambos son sustratos capaces de ser
oxidados por la citocromo oxidasa, pero la oxidación de la p-fenilendiamina, al
provocar una coloración roja, nos sirve de indicador de la actividad del citocromo a +
a3 (complejo citocromo oxidasa)
En este experimento, se deduce-la inhibición de la enzima por KCN al acoplarse con el
hierro oxidado del citocromo a+a3 y por consiguiente la oxidación de la p-
fenilendiamina no ocurre permaneciendo incolora.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
1 estuche de disección I Mortero y pistilo
1 Tubo de centrifuga 1 Espátula
1 Pipeta de 5 mL
1 Pipeta scrológica de 10 mL
4 Pipetas serológicas de 1 mL
5 Tubos de ensayo
1 Gradilla para tubos
Arena
Hielo
REACTIVOS EQUIPO

Fosfato disódico 1/5 M (Na2HPO4) 1 Campana de vidrio

Cianuro de potasio 0.01% (KCN) 1Centrifuga

p-Fenilendiamina al 0.2%
PROCEDIMIENTO
Se prepara un extracto de citocromo oxidasa a partir de tejido cardiaco de rata, pero
debido a que las enzimas pierden actividad rápidamente después de la muerte del
animal, el corazón deberá ser extraído de inmediato deberá prepararse el extracto
enzimático lo más pronto posible.
Cada lado de la mesa deberá disponer de una rata (grande o mediana) que
anestesiaran colocándola en una campana de vidrio que contiene cloroformo hasta
que observen que la rata está completamente dormida. Además, deberán traer un
estuche de disección y guantes para efectuar la disección.
1 Abra el tórax y abdomen del animal.
2. Extraiga el corazón y córtelo en pequeñas porciones con una tijera y colóquelas en
un mortero.
3. Agregue aproximadamente una cantidad igual de arena y 4 mL. de Na2Hpo4
(fosfato disódico) 1/5 M
4. Triture la mezcla hasta obtener una pasta fina y agregue 8 mL más de Na2HPO4
1/5M. traslade el contenido a un tubo de centrifuga y deje reposar durante 20-30min en
baño de hielo, agitando ocasionalmente
5.Centrifugue por 10 minutos y separe el sobrenadante colocándolo en un tubo que
rotula: “Preparación de citocromo oxidasa”.
NOTA: Mientras no se utilice los tejidos o sus extractos, deberán mantenerse en baño
de hielo.
6.Prepare tres tubos de la manera siguiente:

Agite los tubos frecuentemente y note cualquier cambio de color.

-PRECAUCION. Por ser una sustancia venenosa la solución de KCN nunca se
pipetea. Sino que deberá extraerse por capilaridad con pipeta serológica de 5 mL los
resultados de la reacción se observa entre 15 y 45 minutos.
PREGUNTAS
1 ¿Cuál es la razón por la que se utiliza tejido cardiaco en este experimento?
2 ¿Por qué se debe procesar rápidamente este tejido?
3 ¿Observa alguna diferencia de color en uno de los tubos? Si su respuesta es sí,
explique cuál es esa diferencia.
4 ¿En cuál de los tubos se evidencia la actividad de la enzima estudiada y por qué?
5 ¿Cuál fue el resultado en el tubo 2 y 3? Explíquelo.
6 escriba la lista de los reactivos y la función que realizan en este experimento cada
uno de ellos.
7 Esquematice la cadena transportadora de electrones y señale la ubicación de
complejo de la citocromo oxidasa.
8 Defina el proceso de fosforilación oxidativa.