Laboratorio 5

Cadena Transportadora de Electrones (CTE)

en levaduras y cloroplastos
 CTE
La cadena de transporte de electrones es una serie de transportadores
(complejos proteicos) de electrones que mediante reacciones bioquímicas
crean un gradiente electroquímico que se utiliza para la síntesis de trifosfato
de adenosina (ATP), que es el compuesto energético que utilizan los seres
vivos.
Este gradiente se consigue mediante el flujo de electrones entre diversos
transportadores de esta cadena que favorecen en último caso la translocación
de protones que generan el gradiente anteriormente mencionado

Célula CTE
animal +
Fosforilación
oxidativa

Célula
vegetal Fotofosforilación
Célula animal
Fosforilación!!

ATP
sintasa
La fosforilación oxidativa es el proceso en dos etapas:

• En la primera etapa, la energía libre generada mediante reacciones químicas

redox en varios complejos multiproteicos (conocidos en su conjunto como cadena
de transporte de electrones) se emplea para producir un gradiente
electroquímico de protones a través de una membrana. La cadena
respiratoria está formada por tres complejos de proteínas principales (complejo
I, III, IV, que son ATPasas), y varios complejos «auxiliares», utilizando una variedad
de donantes y aceptores de electrones.
• En la segunda etapa, la energía potencial de ese gradiente, llamada fuerza protón-
motriz, se libera cuando se translocan los protones a través de un canal pasivo,
la enzima ATP sintasa, y se utiliza en la adición de un grupo fosfato a una molécula
de ADP para almacenar parte de esa energía potencial en los enlaces «de alta
energía» de la molécula de ATP a medida que fluyen los protones a través de ella
de la enzima.
AGENTES QUE AFECTAN LA FOSFORILACION
OXIDATIVA

Inhibidores del transporte de electrones (Azida)

Inhibidores de la ATP sintasa (Oligomicina)
Desacoplantes de la fosforilación oxidativa (DNP)
 DNP
AZIDA

2,4-Dinitrofenol (DNP): es un agente
desacoplante, es decir, desacopla la
cadena de transporte de electrones de
la fosforilación oxidativa. El
desacoplamiento se produce ya que el
2,4-dinitrofenol hace permeable a los
protones de la membrana interna. El
efecto de este compuesto por tanto es
la inhibición de la producción de ATP al
no generarse el gradiente de pH pero si
permite que la cadena de transporte de
electrones continúe funcionando.
Azida: inhibe la cadena de transporte de
electrones y la fosforilación oxidativa
bloqueando el paso de electrones del
citocromo a3 al oxígeno en el complejo IV.
Esto bloquea la cadena de transporte de
electrones, lo que conlleva que no se
genere el gradiente de protones y por
tanto no se produzca la obtención de ATP
con la consiguiente acumulación de NADH
y FADH2.
Oligomicina: un antibiótico que inhibe el
transporte de H+ a través de la ATPsintasa
inhibe por lo tanto la síntesis de ATP y
como consecuencia de no eliminar el
gradiente de protones se inhibe también
a la cadena de transporte de electrones,
por lo tanto disminuirá el consumo de
O2 y se acumulará NADH y FADH2.
Célula vegetal
La fotofosforilación o fotosíntesis

• Es un proceso de síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato llevado a cabo por

las ATP-sintasas de la membrana del tilacoide, en los cloroplastos de las células
vegetales. En el proceso se utiliza la energía liberada en el transporte
de electrones para bombear protones desde el estroma al interior del tilacoide
con el fin de crear un gradiente electroquímico, el cual, al disiparse por la salida
de protones del tilacoide al estroma a través de las ATP-sintasas, acopla esta
energía protón-motriz a la fosforilación del ADP para formar ATP. La energía
necesaria la proporciona la luz que es captada por los pigmentos fotosintéticos.

El balance final es: por cada molécula de agua (y por cada cuatro fotones) se forman
media molécula de oxígeno, 1,3 moléculas de ATP, y un NADPH + H+.
AGENTES QUE AFECTAN LA FOTOSINTESIS

…. Inhibidores de… (Herbicidas como el Diurón)

Luz
 Qué harán en el laboratorio ….
OBJETIVO:

1. Evaluar la cadena transportadora de electrones en mitocondria de

levaduras a través de cambios en el pH.

2. Evaluar la cadena transportadora de electrones en cloroplastos de

espinaca en presencia de inhibidor y el la importancia de la luz en el
flujo de electrones.
 1. CTE en levaduras: medición de pH en
presencia de inhibidores y desacoplantes
 1. CTE en levaduras: medición de pH en
presencia de inhibidores y desacoplantes
Glucosa Glucosa Glucosa

Control DNP Azida

Levadura Levadura Levadura

+ DNP + Azida

Medir pH basales

Medir pH cada 5min

Control
1. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
2. Medir el pH 3 veces en con intervalos de 3 minutos (pH basal)
3. Adicionar 5 mL glucosa 10%, agitar y medir pH (tiempo 0)
4. Determinar el pH cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces
más.

DNP (2,4 dinitrofenol)

1. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
2. Añadir por decantación (sin agitar) 0.2 mL de DPN 40 mM. Medir el pH 3
veces en con intervalos de 3 minutos (pH basal)
3. Esperar 5 minutos y repetir paso 3 y 4 del control.

Azida
1. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
2. Añadir por decantación (sin agitar) 0.2 mL de Azida 400 mM. Medir el pH 3
veces con intervalos de 3 minutos (pH basal)
3. Esperar 5 minutos y repetir paso 3 y 4 del control.
 Análisis
1. Registrar los datos en la tabla
2. Hacer una gráfica de cada experimento pH v/s tiempo

pH
Tiempo (min)
CONTROL DNP AZIDA
0 5.19 5.43 5.80
5 4.84 4.75 5.90
10 4.37 4.40 5.82
15 4.34 4.51 5.75
20 4.23 4.52 5.73
30 4.16 4.19 5.69
40 4.12 4.17 5.63
PARA DISCUTIR EN EL INFORME:
Explicar el significado de los cambios de pH en cuanto a la CTE.
Analice qué pasa con la síntesis de ATP y el consumo de oxigeno en
presencia del DNP y la azida respecto del control con glucosa
 2. CTE en cloroplastos: efecto de
inhibidores del transporte de e- y la luz.
Aislamiento de los Cloroplastos
a. Muela en un mortero 5 g de hojas con
30 mL de sacarosa 0.5 M.
b. Filtre con la gasa para quitar los restos
más grandes.
c. Centrifugue la solución a 2500 rpm
durante 10 minutos y deseche el
sobrenadante (los cloroplastos están en
el fondo).
d. Resuspenda el precipitado o residuo
con los cloroplastos con 10 mL de
buffer fosfato frío. Coloque los tubos
con los cloroplastos en hielo hasta que
los use en el siguiente paso. (Si tiene 2
tubos más de cloroplastos reúna todo
en uno solo).
 2. CTE en cloroplastos: efecto de
inhibidores del transporte de e- y la luz.
Cloroplastos Cloroplastos
DCPIP Cloroplastos DCPIP
Proteger de DCPIP Diurón
la luz

Colocarlos en
un vaso con
agua que los
cubra

Exponerlos a
una fuente de
luz

Tubo 2 Tubo 3
Tubo 1
Cloroplastos
DCPIP Cloroplastos
Proteger de Cloroplastos DCPIP
la luz DCPIP Diurón

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

PARA DISCUTIR EN EL INFORME:

Analizar y explicar el significado de los cambios de coloración en cuanto
a la cadena transportadora de electrones y el efecto de la luz y el
inhibidor

Tips: El DCPIP es un indicador de si hay o no flujo de electrones. Cambia a verde cuando este
recibe electrones en su estructura.