Departamento de Bioanálisis Clínico

Guía de laboratorio # 7

Asignatura: Bioquímica Clínica I

Tema: Determinación de pruebas de laboratorio para evaluación de la función hepática y
capacidad sintética del hígado.
Objetivos:
1. Aplicar los métodos y técnicas para las pruebas de evaluación de función hepática.

2. Interpretar las pruebas de laboratorio relacionadas con el perfil hepático con base a los
valores de referencia y del método utilizado.

3. Establecer la correlación de los resultados de las pruebas de función hepática con otras
pruebas diagnósticas como parte del control de calidad.

4. Sugerir posibles condiciones clínicas relacionadas con los resultados, dados los valores
del paciente para las pruebas que evalúan la función hepática.

I. INTRODUCCIÓN
El hígado es el órgano principal que se encarga del metabolismo de los carbohidratos,
proteínas, lípidos, porfirinas y ácidos biliares. Es capaz de sintetizar la mayoría de las
proteínas del cuerpo (con excepción de las inmunoglobulinas, producidas por el sistema de
las células plasmáticas linfocíticas) y los factores de la coagulación*. El hígado es también
el sitio principal para el almacenamiento del hierro, glucógeno, lípidos y vitaminas. El hígado
juega un papel importante en la desintoxicación de los xenobióticos y la excreción de los
productos metabólicos finales como bilirrubina, amoníaco y urea.

Las enzimas con significado clínico funcionan en forma intracelular. Cuando se produce
algún daño a los tejidos por enfermedades o lesiones, se liberan enzimas a la circulación y su
actividad puede medirse como indicador de dichos daños. Las enzimas que se solicitan para
el diagnóstico de afecciones hepáticas incluyen AST, ALT, GGT y ALP. De ellas la AST y
la ALT se elevan más en afecciones hepatocelulares, mientras que la GGT y la ALP indican,
con mayor frecuencia, afecciones hepatobiliares.

*Según Bishop (Química clínica. Principios, procedimientos y correlaciones. Quinta edición) el factor VIII no se sintetiza en el hígado,
sin embargo, según B. Å. Henriksson (modificado por A. Martínez. 2015) extraído de https://slideplayer.es/slide/3089440/, Malalar
Kazrabar (2016) extraído de http://laser-marking.mobi/factores-de-coagulacion-dependientes-de-vitamina-k-26/ y Servicio de
Hematología y Hemoterapia. Hospital Británico de Bs AS (2017). Endotelio vascular, pag 27, extraído de
http://www.sah.org.ar/revista/numeros/vol21/extra/07-Vol%2021-extra.pdf, el factor VIII es sintetizado en el hígado, las plaquetas y las
células endoteliales (endotelio vascular).

II. DESARROLLO
• ACTIVIDADES
1. Formar grupos de trabajo ya establecidos.
2. Organizar los materiales a utilizar (gradillas, tubos, pipetas).
3. Encender el espectrofotómetro.
4. Llevar a cabo todas las medidas de bioseguridad establecidas para un laboratorio
clínico.

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5. Realizar las determinaciones en orden y con disciplina siguiendo exactamente los
procedimientos para cada una.
6. Al finalizar, dejar el área de trabajo limpia y en orden.

• DETERMINACIONES
➢ Bilirrubina total y directa
La bilirrubina se origina por degradación del grupo hem de la hemoglobina, que a su vez
aparece en el plasma como consecuencia de la destrucción de los glóbulos rojos en el sistema
retículo endotelial. La hemoglobina, una vez liberada en el interior del eritrocito, se combina
con las haptoglobinas, proteínas plasmáticas específicas para su transporte. En una primera
etapa y tras su liberación de la haptoglobina, se forma, por acción de una oxigenasa, un grupo
formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrólico del hem, formándose el compuesto
denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por acción de una reductasa se
transforma en bilirrubina.

Desde un punto de vista analítico y clínico, interesa conocer los niveles de bilirrubina total y
diferenciar cuantitativamente la "bilirrubina libre" o prehepática que aumenta principalmente
en procesos de tipo hemolítico, de la "bilirrubina conjugada" o hepática que está
incrementada en la disfunción hepática y más concretamente en fallos de los mecanismos de
su eliminación, a través del sistema biliar, cuyo primer paso es introducirse del hepatocito a
los canalículos biliares.

Principio del método

Se basa en la diazorreación de Ehrlich, que consiste en la copulación, en medio ácido, de la
bilirrubina con el ácido sulfanílico diazotado (mezcla de ácido sulfanílico y nitrito de sodio).
La bilirrubina directa reacciona precisamente en forma “directa” con el diazorreactivo; la
bilirrubina no conjugada requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite de
manera “indirecta” su reacción. De esta manera, se comprende que para que podamos medir
la bilirrubina total (la suma de ambas), debe agregarse a la reacción el benzoato de cafeína
que, en esta metodología, actúa como el desarrollador acuoso.

La reacción de los componentes de la bilirrubina en la llamada “diazorreacción” se explica

de la siguiente manera:
+ Suero

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 BILIRUBIN T&D- J

Bilirrubina Total y Directa

Jendrassik – Grof. Colorimétrico

Determinación cuantitativa de bilirrubina

IVD CÁLCULOS
Con Calibrador:
Conservar a 2-8ºC ( A ) Muestra ( A )Blanco Muestra x Conc. Calibrador = mg/dL de bilirrubina
( A ) Calibrador ( A )Blanco Calibrador
PRINCIPIO DEL MÉTODO Con Factor:
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido ((A) Muestra – (A) Blanco Muestra) x Factor* = mg/dL bilirrubina en la muestra
sulfanílico diazotado midiéndose fotométricamente. De las dos
fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre Concentrac ión del Calibrador
*Factor: ; Factor teórico = 17,5
ligada a la albúmina, sólo la primera reacciona en medio acuoso ( A ) Calibrador ( A ) Blanco Calibrador
(bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con
cafeína para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación Factor de conversión: mg/dL x 17,1 = mol/L.
de la bilirrubina indirecta se determina también la directa,
correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. CONTROL DE CALIDAD
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados:
1,2,3
bilirrubina presente en la muestra ensayada . SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. 1002120 y 1002210).
Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, revisar el
SIGNIFICADO CLÍNICO instrumento, los reactivos y el calibrador.
La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer
Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis. correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias.
La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en 1
plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia: VALORES DE REFERENCIA
Bilirrubina Total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia Bilirrubina Total Hasta 1,1 mg/dL 18.81 mol/L
neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa Hasta 0,25 mg/dL 4.275 mol/L
Bilirrubina Directa: Colestasis hepática, alteraciones genéticas y Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio
alteraciones hepáticas1,6,7. establezca sus propios valores de referencia.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos
clínicos y de laboratorio. CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Rango de medida: Desde el límite de detección de 0,1 mg/dL hasta el límite de
REACTIVOS linealidad de 20 mg/dL.
Ácido sulfanílico 30 mmol/L Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa
R1 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
Ácido clorhídrico 400 mmol/L
Precisión:
R2 Sodio nitrito 50 mmol/L Bilirrubina D Intraserie (n= 20) Interserie (n= 20)
Media (mg/dL) 0,78 2,28 0,80 2,18
R3 Cafeína 100 mmol/L SD 0,01 0,01 0,01 0,03
BILIRUBIN CAL CV (%) 1,28 0,65 1,63 1,53
Opcional Ref:1002250
Bilirrubina T Intraserie (n= 20) Interserie (n= 20)
PREPARACIÓN Media (mg/dL) 1,16 4,21 1,15 4,27
Todos los reactivos están listos para su uso. SD 0,02 0,04 0,02 0,13
CV (%) 2,03 1,06 1,91 3,10
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Sensibilidad analítica: (T) 1 mg/dL = 0,079 A. (D) 1 mg/dL = 0,087 A.
Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los Exactitud: Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas
viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales (x).
Los resultados obtenidos con 50 muestras fueron los siguientes:
contaminación durante su uso. BILIRRUBINA DIRECTA
No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Coeficiente de correlación (r): 0,99.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Ecuación de la recta de regresión: y= 0,9923x + 0,0048.
- Presencia de partículas y turbidez. BILIRRUBINA TOTAL
- Desarrollo de color en el R 2. Coeficiente de correlación (r): 0,99.
Ecuación de la recta de regresión: y= 0,9832x + 0,0224.
MATERIAL ADICIONAL Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.
- Espectrofotómetro o analizador con cubeta para lecturas a 540 nm.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. INTERFERENCIAS
1,3
- Equipamiento habitual de laboratorio. La presencia de hemólisis disminuye el valor de bilirrubina .
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren con la determinación
4,5
MUESTRAS de la bilirrubina .
1
Suero o plasma libre de hemólisis . Proteger de la luz.
Estabilidad de la muestra: 4 días a 2-8ºC o 2 meses a –20ºC. NOTAS
1. Para la determinación de bilirrubina en neonatos, pipetear 50 L de muestra.
PROCEDIMIENTO Multiplicar el resultado obtenido por 4.
1. Condiciones del ensayo: 2. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm reactivo en distintos analizadores.
Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz BIBLIOGRAFÍA
Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-25ºC 1. Kaplan A et al. Bilirubin. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 1984; 1238-1241, 436 and 650.
3. Pipetear en una cubeta: 2. Malloy H T et al. The determination of bilirubin with the photoelectric colorimeter. J Biol
Chem 1937; 112 (2): 481-491.
B. Total B. Directa Blanco 3. Jendrassik L et al. Biochemische Zeitschrift Band 1938; 297:80-89.
R 1 ( L) 200 200 200 4. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
5. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC 2001.
R 2 (gotas) 1 1 -- 6. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. AACC 1999.
ClNa 9 g/L (mL) -- 2,0 2,0 7. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. AACC 1995.
R 3 (mL) 2,0 -- --
Muestra / Calibrador ( L)(Nota 1) 200 200 200 PRESENTACIÓN
Ref: 1001041 R 1: 1 x 60 mL
4. Mezclar e incubar exactamente 5 minutos a 15-25ºC. Cont. R 2: 1 x 10 mL
5. Leer la absorbancia (A). R 3: 1 x 150 mL

BSIS03-E 27/06/11 SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com
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III. BIBLIOGRAFÍA
− Inserto Bilirrubina T+D. Spinreact.
− Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio en el diagnostico
bioquimico, según norma internacional ISO/FDIS 15189:2000. Lima, Perú.
− Universidad Nacional Autónoma de México. (2009). Manual de prácticas
− Bioquímica clínica. México D.F.

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