EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS DEL ADN HUMANO

ANGIE LORENA LOPEZ CARO 1007191465

DUVAN SANABRIA BAUTISTA 1121934070
ESTEFANIA MORALES CARDONA 1116263675
ANDERSON FABIAN SANCHEZ PEÑA 1115724263
CARLOS FARID FLOREZ DIAZ 1103117226

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ZOOTECNIA
2019
 RESUMEN

Previamente a la práctica, se realizó una extracción de ADN y se almaceno en un vacutainer

de 4ml con anticoagulante con el fin de preservar la muestra de sangre. Durante la práctica
se siguió el protocolo establecido por el profesor el cual consistió en la separación (con la
ayuda de la centrifuga) de los componentes de la sangre tales como plasma, eritrocitos y
leucocitos; siendo estos últimos los de interés para la extracción del ADN molecular.
Posterior a la extracción de la fase intermedia perteneciente a los leucocitos, se agregaron
una serie de soluciones salinas con el fin de desproteinizar las células y también se agregó
detergente el cual rompió la membrana nuclear y de esta forma obtener el ADN de estas
células. Al finalizar se incubo durante 8 días y se realizó la electroforesis, al revisar los
resultados no se observó ADN, concluyendo que múltiples factores de error durante el
procedimiento influyeron negativamente en el resultado.
 INTRODUCCIÓN

El ADN es el que contiene el mensaje genético para toda la función y organización celular.
Es, en definitiva, la molécula que controla todos los procesos vitales para los seres vivos,
además de ser el principal constituyente de los cromosomas celulares. (MAZPARROTE,
1998)
Constituye el material genético de todos los organismos celulares y casi todos los virus. El
ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación. Se
llama síntesis de proteínas a la producción de las proteínas que necesita la célula o el virus
para realizar sus actividades y desarrollarse. La replicación es el conjunto de reacciones por
medio de las cuales el ADN se copia a sí mismo cada vez que una célula o un virus se
reproducen y transmite a la descendencia la información que contiene. En casi todos los
organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleo
de la célula. (Luque, 2001)
Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un elevado
número de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una especie de
escalera retorcida que se llama doble hélice. Cada nucleótido está formado por tres unidades:
una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles
compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A), guanina (G), timina
(T) y citosina (C). La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está
flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez
unido a la desoxirribosa del nucleótido adyacente de la cadena. Estas subunidades enlazadas
desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas,
mirando hacia el interior, y forman los travesaños. (Soberón, 2000)
 METODOLOGIA

 PROCEDIMIENTO EXTRACCION DE ADN

1. Tomar una muestra de sangre de 5 mL. Una muestra por grupo. Utilizar anticoagulante.
2. Centrifugar la muestra de sangre al 90 % de la velocidad máxima en una centrífuga
serológica, durante 10 minutos.
3. Descartar la fase superior, tomar la fase intermedia (capa blanca delgada) y agregar 4 mL
de una solución (A): 10 mM de Tris-HCl pH 7.5, 5 mM de Mg Cl2 y 10 mM de NaCl.
Mezclar bien.
4. Centrifugar 10 minutos al 90 % de la velocidad máxima de una centrífuga serológica.
5. Remover el sobrenadante y agregar 2 mL de solución A. Mezclar bien.
6. Centrifugar 10 minutos al 90 % de la velocidad máxima de una centrífuga serológica.
7. Remover el sobrenadante y agregar 1 mL de solución A. Agregar SDS hasta una
concentración final de 0.5 %. Mezclar bien hasta que haya desintegración de las células.
8. Pasar 1 mL de la solución a un tubo eppendorf de 2 mL.
9. Agregar 1 mL de una solución 1:1 de fenol: cloroformo. Mezclar bien.
10. Centrifugar 5 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga para eppendorf.
11. Tomar el sobrenadante (0.4 mL aproximadamente) y agregar 1/10 de volumen de acetato
de sodio 3 M pH 5.2 (40 μL) y 1.2 mL de etanol absoluto (pre-enfriado a – 20 °C).
12. Centrifugar a 13.000 rpm en centrífuga eppendorf refrigerada (4 °C), descartar el
sobrenadante.
13. Lavar el precipitado agregando 50 μL de Etanol al 70 % pre-enfriado. Centrifugar 5
minutos a 13.000 rpm en centrífuga eppendorf refrigerada (4 °C), descartar el sobrenadante.
14. Secar el pellet colocando el tubo en un horno a 45 o C durante 10 minutos. Agregar al
tubo 50 μL de TE o agua desionizada.
15. Si se dispone de espectrofotómetro ultravioleta hacer cuantificación del DNA a 260 nm
y compararlo con la cuantificación del método de dots.
16. Hacer electroforesis de DNA en gel de agarosa al 1 %.
 PROCEDIMIENTO ELECTROFORESIS ADN

1. Se prepara la agarosa al 0.9% calentándolo hasta que se disuelva bien. Se le agregan

50 μL ya de AZ Visión y se agita suavemente. Se coloca sobre la base que se
encuentran en la caja de electroforesis previamente sellada con cinta adhesiva y se
vierte la agarosa. Se deja que se solidifique.
2. Ya solido se coloca dentro de la caja y se le agrega buffer TBE 1x hasta cubrir el gel
1cm por arriba.
3. Se descongelan las muestras de ADN y el buffer de carga.
4. Para hacer la mezcla, se colocan sobre un papel aluminio pequeño de 10 ul de buffer
de carga para cada muestra, separando las gotas.
5. Se ajusta una micropipeta a 10 ul y se toma una muestra de ADN, con la muestra en
la punta se ajusta con cuidado y se tendrá un volumen final de 20 ul. Se presiona el
botón hasta que el líquido casi se derrame de la punta para sacar el aire y se toma la
muestra de buffer de carga. En este momento se mezclan sobre el papel con cuidado
y se tendrá un volumen final de 20 ul.
6. Con cuidado se elimina cualquier burbuja de aire y se carga el primer pozo de gel
deslizando el botón despacio y se observa como la muestra se va acomodando, en el
fondo del pozo.
7. Ya cargados los pozos se tapa la caja y se conectan los cables correctamente y se
encienden la fuente de poder a 120 v o máximo voltaje por 30 min.
8. Se realiza el corrimiento hasta que la marca de azul de bromofenol llega ¼ del
inicio del gel.
 RESULTADOS

Fig. 1. Centrifugado de los 6ml de la muestra de fig. 2 separación de los componentes de la sangre
sangre

Fig. 3. Extracción de leucocitos. Fig. 4. Leucocitos empleados para la extracción de ADN.

Fig5. Adición de la solución A fig6. Centrifugado de los leucocitos con la solución A
Fig7. Producto obtenido del centrifugado con la solución A. Fig.8 Centrifugado con el eppendorf.

Fig. 9. Muestra centrifugada con fenol-cloroformo. Fig.10. se cargó la muestra en el pozo de gel.

Fig. 11. Muestra de ADN corriendo de un polo + a --. Fig. 12. Observación bajo la luz ultravioleta.
 ANALISIS DE RESULTADOS

Inicialmente la muestra fue centrifugada durante 10min al 90% de la velocidad máxima; esto
se hizo para poder aislar los leucocitos de los eritrocitos y el plasma sanguíneo, ya que son
estos primeros, los de interés, debido a que poseen núcleo y es allí donde reside el DNA de
los organismos eucariotas.
Se usó un vacutainer con solución anticoagulante para evitar que se inicie el proceso de tapón
plaquetario efectuado por las plaquetas haciendo que se formen coágulos y se pierda la
muestra de sangre pues de esta manera no sería posible la centrifugación para la separación
de los componentes sanguíneos y la posterior extracción de los glóbulos blancos para la
extracción del DNA.
Para la preparación de la disolución A (10 mM de Tris-HCl pH 7.5, 5 mM de Mg Cl2 y 10
mM de NaCl) a partir de una solución más concentrada se realizó el siguiente procedimiento.

 Para 10 mM de Tris-HCl
Formula: C1xV1=C2xV2
V1?, V2=40ml, C1=1M, C2= 10mM
1Mx1000= 1000mM
𝐶2𝑥𝑉2 10𝑥40
𝑉1 = = 𝑉1 = = 0,4ml
𝐶1 1000

0,4mlx1000= 400µL de Tris-HCl

 Para 5 mM de Mg Cl 2
Formula: C1xV1=C2xV2
V1?, V2=40ml, C1=0,2M, C2= 5mM
0,2Mx1000= 200mM
𝐶2𝑥𝑉2 5𝑥40
𝑉1 = = 𝑉1 = = 1ml
𝐶1 200

1mlx1000= 1000µL de Mg Cl 2

 Para 10 mM de NaCl
Formula: C1xV1=C2xV2
V1?, V2=40ml, C1=4M, C2= 10mM
4Mx1000= 4000mM
𝐶2𝑥𝑉2 10𝑥40
𝑉1 = = 𝑉1 = = 0,1ml
𝐶1 4000
0,1mlx1000=100 µL de NaCl
Por último, se suman los volúmenes calculados anteriormente dando como resultado:
400+1000+100= 1500 µL = 1.5ml - 40ml = 38.5 ml
Entonces para preparar 40ml de la solución A, se necesitaron 38.5 ml de agua y 1.5 ml de las
soluciones anteriormente mencionadas.
Luego de adicionar la solución A y centrifugar se observó en pequeño precipitado y un
sobrenadante. Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación
del ADN; es por eso que en la fig7 se observó un pequeño precipitado de color rojo. Además,
estas soluciones salinas disminuyen la solubilidad de las proteínas permitiendo que se
separen más fácilmente del ADN con el fin de obtener este con mayor pureza, esto explica
la acción de eliminar el sobrenadante, pues es el precipitado el que nos interesa. Por otra
parte, la acción del buffer Tris- HCl evita que el DNA se dañe por efectos del pH.
Al agregar el detergente SDS, se solubilizaron las proteínas, tejidos y membranas evitado
que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los residuos o restos celulares, otra
acción de este detergente fue la de destruir las membranas celulares y nucleares al disolver
los lípidos que conforman la estructura de las mismas con el fin de permitir la salida del
ADN.
Luego de agregar el fenol: cloroformo y centrifugar, se observaron dos fases como se puede
apreciar en la fig9. Gracias al fenol: cloroformo, las proteínas aun presentes en la muestra se
precipitaron permitiendo una purificación del ADN; por consiguiente, en la fase acuosa
superior se encontraban los ácidos nucleicos y en la fase orgánica se encontraban las
proteínas disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo. Por esta razón, se
extrajeron 0.4ml del sobrenadante.
Posterior a tomar el sobrenadante y agregar el acetato de sodio junto con el etanol absoluto,
este último precipito el DNA de la fase acuosa debido a que es soluble en esta solución. Por
último se lavó con etanol al 70% con el fin de eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas
que podrían estar aún presentes en la muestra.
Durante la electroforesis, se agregó buffer TBE y buffer de carga, este último da peso a la
muestra para que el ADN se precipite al fondo de los pozos de siembra y los colorantes. Su
función es ayudar a conducir la corriente y controlar el pH. El ADN es una molécula con
carga negativa, al suministrarle la corriente adecuada, este migro hacia el polo positivo,
siendo más lento que la muestra blanco debido a que se trataba de una molécula más grande.
En el momento de la lectura con luz ultra violeta se pudo constatar que no había DNA en el
pozo sembrado, a pesar de seguir paso a paso el protocolo establecido para la extracción y
electroforesis del DNA hubo un factor de error al momento de manipular las soluciones y
elementos que desencadenaron una pérdida de la molécula del ADN.
 CONCLUSIÓN

A través del protocolo empleado para la extracción del DNA, se pudo conocer el uso o
función de cada sustancia empleada para la obtención del DNA, reconociendo así, la acción
de cada solución como en el caso de las soluciones salinas y detergente que rompieron las
membranas celulares con el fin de extraer el ADN del núcleo, también el uso del fenol
cloroformo para purificación del DNA y el etanol para su precipitación.
Gracias a la utilización de las técnicas electroforéticas, que pretendía demostrar la presencia
del DNA, se pudo observar que en la muestra obtenida no se encontró DNA, deduciendo
que múltiples factores de error asociados con la correcta manipulación de los materiales
pudieron inferir en el resultado final de la electroforesis.
 BIBLIOGRAFÍA

Hames, B. (1998). Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach. IRL Press.

Luque, J. y. (2001). Texto ilustrado de Biología. Harcourt.

MAZPARROTE, S. (1998). Biología 9no grado Educación Básica. En S. MAZPARROTE, ADN Y ARN (pág.
192). Biosfera.

Nelson DL, C. M. (2001). Principios de Bioquímica. Barcelona, España: Reverté.

Ramirez, S. P. (5 de 6 de 2014). scribd. Obtenido de scribd:

https://es.scribd.com/document/257078627/Electroforesis-de-ADN-en-Gel-de-Agarosa

Soberón, M. (2000). La Ingeniería Genética y la Nueva Biotecnología. México.

Stryer L, B. J. (2003). Bioquímica. Barcelona, España: Omega .

 ANEXOS

1. Menciona que otros procedimientos se utilizan para separar moléculas sujetas a

campos eléctricos.
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la
fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo estrecho
contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la
cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios
de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por
capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos,
cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica,
la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente.
Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse a cabo en columna o sobre
superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están
restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna
contienen la fase móvil. (Stryer L, 2003)
La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su
sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para
la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de
primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo a este
método de separación:
Los métodos cromatográficos
La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:
 C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad
 C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción
 C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular
 C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica
Electroforesis de frente móvil o libre: El campo eléctrico se aplica a disoluciones o
suspensiones. Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos.
Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla. Las
diferentes proteínas se desplazan a velocidades diferentes según sus cargas y coeficientes de
fricción respectivos, formándose nubes que se van desplazando en la disolución tampón y
que puede seguirse con diversos sistemas ópticos, poniéndose de manifiesto las sustancias
que se van separando tiene poco poder de resolución.
Electroforesis capilar: Constituye una alternativa electroforética de creciente implantación
en los laboratorios clínicos.
Ventajas: Técnica automatizada, ofreciendo resultados reproducibles y precisos, Separa
cualquier tipo de tamaño: moléculas de alto y bajo PM (al contrario que la convencional, que
solo separa moléculas grandes), Utiliza volúmenes muy pequeños de muestra (0.1-10 nL),
mientras que la convencional, utiliza del orden de µL, No requiere el uso de colorantes, ya
que las proteínas se detectan directamente por espectrofotometría, Resolución muy elevada
,La velocidad de separación es mucho mayor que en la convencional. (Nelson DL, 2001)

2. ¿además de la agarosa, que otros sustratos se utilizan en el corrimiento

electroforético?

 Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja
tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.
 Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
 Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar).
Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta
porosidad.
 Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.
 Agarosa poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.
 Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo:
laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las proteínas,
desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS.
Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional
a su longitud en aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS
que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular. (Hames,
1998)
3. Que ventajas y desventajas presenta el uso de otros sustratos diferentes de la
agarosa.

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El soporte consiste
en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que
se evita la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas.
Otras ventajas son:
 La separación es muy rápida
 Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas
 Las tiras pueden hacerse transparentes
 La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
 Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos
Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y son más susceptibles a la evaporación
que el papel. Son también más susceptibles al flujo electro-endosmótico.
GEL DE ALMIDÓN
Ventajas
 Más barata, rápida.
 El poro del gel se puede determinar según la concentración de almidón.
Desventajas:
 Preparación engorrosa.
 Debe cubrirse con cera para evitar la evaporación del tampón.
 Baja precisión, (no restrictivo).
GEL DE POLIACRILAMIDA
Ventajas:
 Separación rápida de proteínas
 Se puede estimar el peso molecular de las proteínas.
 Resiste a agentes desnaturalizantes-
 Químicamente Inerte frente a moléculas biológicas
 Rápido
 Más poroso (elástico).
 Insoluble en agua.
 Transparente.
Desventajas:
En las condiciones de desarrollo de los enlaces estables (desnaturalización de proteínas), por
lo tanto no son funcionales. Puede haber un movimiento típico de algunas proteínas por no
tener una completa redacción de puentes (Ramirez, 2014)