Laboratorio de biologa molecular de la clula II Practica nmero 7 actividad fotosinttica de cloroplastos aislados de spinacea oleraceae La mayora de los seres

vivos dependen de las clulas fotosintticas para fabricar las molculas orgnicas complejas que requieren una fuente de energa. Las clulas fotosintticas son muy diversas e incluyen clulas que se encuentran en las plantas verdes, el fitoplancton y las cianobacterias. Durante el proceso de la fotosntesis, las clulas utilizan el dixido de carbono y la energa del sol para formar molculas de azcar y oxgeno. Estas molculas de azcar son la base de molculas ms complejas de las clulas fotosintticas, tales como la glucosa. Luego, a travs de los procesos de respiracin, las clulas utilizan el oxgeno y glucosa para sintetizar molculas ricas en energa portador, como el ATP, y el dixido de carbono se produce como un producto de desecho. Por lo tanto, la sntesis de glucosa y su desglose por clulas se oponen a los procesos Las clulas fotosintticas contienen pigmentos especiales que absorben la energa de la luz. Diferentes pigmentos responden a diferentes longitudes de onda de la luz visible. La clorofila, el pigmento primario utilizado en la fotosntesis, refleja la luz verde y absorbe la luz roja y azul con ms fuerza. En las plantas, la fotosntesis se lleva a cabo en los cloroplastos, que contienen la clorofila. Los cloroplastos estn rodeados por una doble membrana y contienen una tercera membrana interna, denominada membrana de los tilacoides, que forma pliegues en el orgnulo. En micrografas electrnicas, las membranas tilacoides parecen pilas de monedas, a pesar de los compartimentos que forman estn conectados como un laberinto de cmaras. El pigmento verde llamado clorofila se encuentra dentro de la membrana del tilacoide, y el espacio entre los tilacoides y las membranas del cloroplasto se denomina estroma Imagen 1: detalle de la fase luminosa o foto dependiente La fotosntesis consiste en dos reacciones dependientes de la luz y reacciones independientes de la luz. En las plantas, los llamados "light" las reacciones se producen en los tilacoides del cloroplasto, donde los pigmentos de clorofila citada residencia. Cuando la energa de la luz llega a las molculas de pigmento, que da energa a los electrones dentro de ellos, y estos electrones se desvan a una cadena de transporte de electrones en la membrana del tilacoide. Cada paso en la cadena de transporte de electrones se hace cada electrn a un estado energtico ms bajo y aprovecha su energa mediante la produccin de ATP y NADPH. Mientras tanto, cada molcula de clorofila sustituye a su electrn

perdido con un electrn de agua, este proceso bsicamente divide las molculas de agua para producir oxgeno Una vez que las reacciones luminosas se han producido, los independientes de la luz u "oscuro" las reacciones tienen lugar en el estroma de los cloroplastos. Durante este proceso, tambin conocida como la fijacin de carbono, la energa de la ATP y NADPH molculas generadas por las reacciones luminosas unidades de una va qumica que utiliza el carbono en dixido de carbono (de la atmsfera) para construir un azcar de tres carbonos llamada gliceraldehdo-3-fosfato (G3P). A continuacin, utilizar clulas G3P para construir una amplia variedad de otros azcares Imagen 2: detalle de la fase oscura o cclica tambin llamada (como la glucosa) y las molculas ciclo de Calvin (en honor al investigador que la descubri) orgnicas. Muchas de estas interconversiones se producen fuera del cloroplasto, el transporte del G3P del estroma. Los productos de estas reacciones son transportadas a otras partes de la clula, incluyendo la mitocondria, donde se dividen para hacer ms molculas portadoras de energa para satisfacer las demandas metablicas de la clula. En las plantas, algunas molculas de azcar se almacenan como sacarosa, almidn o fcula. Objetivo Determinar mediante la absorbancia la actividad fotosinttica de los cloroplastos aislados de la espinaca. Observar y comparar la actividad entre dos muestras de cloroplastos (uno puesto en la oscuridad y otro expuesto a la luz)

Hiptesis En base a la informacin que se sabe acerca de la actividad fotosinttica, se piensa que si un concentrado de extracto de cloroplastos aislados, est expuesto a un haz de luz y otro permanece en completa oscuridad, cuando se mida la absorbancia de cada uno de los extractos el que est expuesto al haz de luz deber de presentar una mayor absorbancia en comparacin con el que est en total oscuridad.

Material Matraz de 250 ml 2 vasos de precipitado de 50 ml 6 tubos de centrfuga 7 tubos de ensaye 6 tubos de espectrofotmetro 1 probeta de 100 ml 1 probeta de 50 ml 1 embudo 2 pipetas graduadas de 10 ml 2 pipetas graduadas de 5 ml 2 pipetas graduadas de 1 ml recipiente metlico para hervir Soporte, anillo, mechero y tela de asbesto *Material que debe traer el alumno. Reactivos: Medio de aislamiento de cloroplastos. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH Medio de reaccin. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH. Medio de reaccin con DCPIP. Tomar 400 ml de medio de transporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una solucin 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones. 10 ml de acetona al 80% Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM Agitadores de vidrio Pipeta Pasteur Agua destilada y desionizada *Cubreobjetos y portaobjetos *1 lmpara de luz incandescente de 150 watts 1 mortero o una licuadora *1 reloj (cronmetro) 1 charola grande *Papel aluminio *Toallas de papel *Parafilm *Gasa *Papel filtro *Hojas frescas de espinaca

Procedimiento Obtencin de cloroplastos: Seleccionar aprox. 40 g de hojas frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave, procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas. Cortar el tallo, la nervadura principal y el pice de cada hoja y desecharlos Colocar las hojas en un mortero, y machacarlos hasta obtener una mezcla uniforme al momento de colocar las hojas en el mortero aadir 20 ml del medio de aislamiento de cloroplastos.

Filtrar la suspensin usando 8 capas de gasa, recoger el filtrado en dos tubos de centrfuga de 15 ml cada uno, previamente enfriados en hielo, repartir equitativamente el filtrado y balancear los tubos. Centrifugar por 5 min. a 4000 rpm, decantar el sobrenadante y desecharlo. El sedimento se resuspende con 2.0 ml de medio de aislamiento de cloroplastos. Durante toda la prctica se mantienen los cloroplastos en bao de hielo.

Cuantificacin de clorofila: [Chl en g] = [8.05 (Abs663) + 20.29 (Abs645)]5 Determinacin de la reduccin del DCPIP Para determinar la reduccin del DCPIP preparar 5 tubos de espectrofotmetro como se indica en la tabla siguiente: Para determinar la concentracin de clorofila, colocar en dos tubos de centrifuga 5 ml de acetona al 80% y 20 l de la suspensin de cloroplastos Agitar los tubos bien e incubar el tubo en la obscuridad por 5 minutos. Centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y colocar el sobrenadante en tubos de espectrofotmetro. Leer su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80% (Esto se hace por duplicado)

Tubos de espectrofotmetro Medio de reaccin con DCPIP (300 M) Medio de reaccin sin DCPIP Herbicida comercial Suspensin de cloroplastos ml

1 0

2 3

3 3

4 3

5 3

ml 3 0 0 0 0 ml 0 0 0 50 l ml 60 g 0 g 60 g 60 g 60 g

Colocar los tubos en una gradilla de unicel Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido invirtindolo suavemente. Evitar la formacin de burbujas Tapar el tubo 4 con papel aluminio Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda de 660 nm de. Ajustar acero con el tubo 1. Anotar los resultados tiempo cero. Colocar todos los tubos frente a una lmpara de 150 watts a 10 cm de distancia durante 1 minuto y tomar nuevamente lectura en el espectrofotmetro.

Resultados Se obtuvieron los siguientes resultados: Para la cuantificacin de clorofila 645nm 663nm Acetona 0 0 Luz .127 .246 Sin luz .143 .263 Para la reduccin de DCPIP nos permiti tener las siguientes absorbancias Tubo 1 2 3 4 5 660nm -.100 0 .463 .680 .405 660nm 1 min 0 .311 .563 .073 660nm 2 min 0 .343 .546 0.046

Anlisis de datos Para cuantificar la cantidad de clorofila se sigui la siguiente ecuacin Con luz: [8.05 (0.246) + 20.29 (0.127)]5= 22.78565 g de clorofila Sin luz: [8.05 (0.263) + 20.29 (0.143)]5= 25.0931 g de clorofila Para la reduccin de DCPIP Graficando cada una de las absorbancias contra su tiempo. Donde el tubo dos es el blanco, mientras que el cinco contiene herbicida; esto es lo que nos queda.
0.8 0.7 0.6 Absorbancia 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 Tiempo (mins) 1.5 2 2.5

En la tabla se pueden identificar: La lnea verde corresponde al tubo cinco (herbicida), la lnea roja al tubo 4 (incubado en oscuridad), y el patrn azul es correspondiente al tubo 3 (expuesto a la luz), el tubo uno se produjo un error al tomar las medidas de absorbancia, por lo cual no se tom en cuenta, mientras que el tubo dos por ser el blanco tampoco se tom en cuenta para graficarlo. Lo que podemos notar es una cierta correspondencia con los datos, y su tubo; ya que en el caso del tubo cinco que es donde se puso el herbicida, este impedira que la planta pudiese realizar fotosntesis, y en la grfica la absorbancia del tubo conforme el tiempo fue bajando, otro dato que tambin coincide fue el del tubo aislado, ya que aunque su absorbancia fue la mayor, conforme el tiempo fue decreciendo esta; en tanto el tubo tres tubo un desarrollo distinto, pus se esperaba que cuando fuese expuesto al haz de luz aumentara de manera progresiva conforme al tiempo su absorbancia cosa que no sucedi pues al primer minuto bajo la absorbancia, y al siguiente aumento de manera muy leve.

Conclusin Esta prctica se pudieron cumplir los objetivos, ya que analizamos y comparamos la actividad fotosinttica en distintas formas, obtuvimos resultados convincentes en los casos que nos interesaban comparar, por lo cual puedo decir que el desarrollo de la prctica fue bueno, fue muy interesante ver como las absorbancias cambiaban segn fuese el escenario, y como al graficar que das cuenta (y te ejemplifica muy bien) como se lleva a cabo la fotosntesis. Bibliografa Introduccin http://www.nature.com/scitable/topicpage/photosynthetic-cells-14025371

Consulta y resultados David L. Nelson; Michael M. Cox. Lehninger. Principios de bioqumica. Ediciones omega, primera edicion, estados unidos, 2002.