UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

BIOQUÍMICA
PRÁCTICA Nº9 TRANSPORTE DE
ELECTRONES: ESTUDIO DE LA
ACCIÓN ENZIMATICA DE LA
SUCCINATO DESHIDROGENASA

GRUPO: C2
ALUMNO: HILACCAMA MAYTA
AIMAR EDSON

DOCENTE: MG. GEORGINA

SUCASACA MONZÓN

FECHA DE ENTREGA: 18 de
noviembre de 2020
 PRACTICA 9

TRANSPORTE DE ELECTRONES: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE LA

SUCCINATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO
• Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo
intermediario y la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de
un aceptor de electrones como el azul de metileno.

• Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre el succinato deshidrogenasa y

del cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

MATERIAL
• Sucrosa 0.25 M
• Succinato de sodio 0.1 M
• Malonato de sodio 0.5 M
• Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
• Azul de metileno 0.05%
• Aceite mineral
• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Morteros
• Centrífuga

METODO DE TRABAJO
A) Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego
pesar
10.0 g. de hígado, corazón y músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el
mortero. Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y
luego filtrar con gasa. El filtrado es guardado en frío hasta su uso (Figura 1).
 Figura 1. Preparación del extracto enzimático. Fotos cortesía de Kevin Cervantes
Tuero.

B) Prepare el siguiente sistema de tubos para cada caso:

Tubo N° 1 2 3 4
Succinato de sodio 0.1 - 0.5 0.5 0.5
Buffer fosfato pH 7.4 2.0 2.0 2.0 2.0
Malonato de sodio - - 0.5 -
Cianuro de potasio 0.1 M - - - 0.5
Agua destilada 1.5 1.0 0.5 0.5
Azul de metileno 0.05% 0.5 0.5 0.5 0.5
Extracto enzimático 0.5 0.5 0.5 0.5
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0

El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de

agregar el aceite mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno.
Llevar a baño maría a 37°C durante 10 minutos y observar el decoloramiento del
azul de metileno (Figura 2).

Figura 2. Preparación de los sistemas de estudio. Fotos cortesía de Kevin Cervantes Tuero.
RESULTADOS

Figura 3. Efecto de la Succinato Deshidrogenasa frente a inhibidor competitivo

(Malonato) y cianuro. Los tubos se leen de derecha a izquierda para describir los
resultados. Fotos cortesía de Kevin Cervantes Tuero.
Musculo
• Para el tubo 1 (control) se observa un color azul claro
• Para el tubo 2 se observa un color claro indicando que la prueba es positiva
• Para el tubo 3 se observa un color azul claro indicando que la prueba es
negativa
• Para el tubo 4 se observa un color azul claro indicando que la prueba es
negativa
Corazón
• Para el tubo 1 (control) se observa un color azul oscuro
• Para el tubo 2 se observa un color claro indicando que la prueba es positiva
• Para el tubo 3 se observa un color azul oscuro indicando que la prueba es
negativa
• Para el tubo 4 se observa un color azul oscuro indicando que la prueba es
negativa
Hígado
• Para el tubo 1 (control) se observa un color azul claro en la parte superior y
rosada en la inferior
• Para el tubo 2 se observa un color rosado indicando que la prueba es positiva
• Para el tubo 3 se observa un color azul en la parte superior y rosada en la
inferior indicando que la prueba es parcialmente negativa
• Para el tubo 4 se observa un color rosado indicando que la prueba es positiva

DISCUSIÓN
Musculo
• Se puede denotar una clara diferencia entre el tubo 2 y tubo 3 respectivamente
y esto se debe a la presencia de un inhibidor que actúa sobre el succinato.
También se logra apreciar un azul en el tubo 4 debido a la acción del cianuro
que impide la acción del citocromo y bloquea la respiración impidiendo el
transporte de electrones.
Corazón
• Se puede denotar una clara diferencia entre el tubo 2 y tubo 3 respectivamente
y esto se debe a la presencia de un inhibidor que actúa sobre el succinato.
También se logra apreciar un azul oscuro en el tubo 4 debido a la acción del
cianuro que impide la acción del citocromo y bloquea la respiración impidiendo
en transporte de electrones
Hígado
• El hígado posee una alta cantidad de enzimas y succinato que poseen su
propio sustrato, la inhibición se ve de manera parcial en el tubo 3 debido a la
 presencia de estas el malonato no puede inhibir en su totalidad al succinato. En
cuanto a la acción del cianuro también se ve afectado por las altas
concentraciones de eznimas no puede inhibir a los citocromos permitiendo en
tranporte de electrones

CONCLUSIÓN (es)
• Se logro Poner de manifiesto describir y observar una de las etapas del
metabolismo intermediario y la acción de las enzimas de oxido-reducción,
siendo en las muestras de musculo y corazón las más notables en estos
precesos.

• Se logro verificar la acción inhibitoria del malonato de sodio y el cianuro de

potasio sobre el succinato de sodio, en la muestra de hígado se comprobó que
un alto número de mitocondrias pueden llegar a contrarrestar esta acción
inhibidora dando resultados parcialmente negativos.

CUESTIONARIO
1. Haga un esquema de la oxidación del succinato por acción del succinato
deshidrogenasa, además acople la cadena respiratoria para indicar el destino
final del hidrógeno y de los electrones del succinato.

El FADH2 del succinato deshidrogenasa, al no poder desprenderse del enzima,

debe oxidarse nuevamente in situ. El FADH2 cede sus dos hidrógenos a la
ubiquinona (coenzima Q) que se reduce a ubiquinol (QH2) y abandona el
enzima, difundiendo en la bicapa lipídica hasta alcanzar el siguiente complejo
enzimático de la cadena respiratoria.
La molécula de FAD del enzima es el aceptor de electrones de la reacción. En
general la función bioquímica del FAD es oxidar los alcanos a alquenos,
mientras que el NAD+ oxida los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es debido
a que la oxidación de un alcano (como el succinato) a un alqueno (como el
fumarato) es suficientemente exergónica como para reducir el FAD a FADH2,
pero no para reducir el NAD+ a NADH. Es poco usual hallar una unión covalente
entre el FAD y una proteína; en la mayoría de los casos, el FAD se encuentra
asociado a los enzimas de forma no covalente.
El succinato deshidrogenasa actúa separando dos átomos de hidrógeno que
entre sí se hallan en posición trans de los átomos de carbono metilénicos del
succinato.
Este enzima posee algunas características de una enzima alostérica: es
activada por el succinato, el fosfato, el ATP y la coenzima Q reducido, y es
inhibido por el malonato, un análogo estructural del succinato.
 Por otro lado, esta enzima se constituye como una de las dianas moleculares
en la intoxicación por cianuro, compuesto que inhibe su acción y así bloquea la
producción de ATP, induciendo a hipoxia celular.

2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte

de electrones y la formación de ATP en la cadena respiratoria.
a) Azida:
Inhibidor del transporte electrónico, afectan a la cadena respiratoria de igual
forma que el cianuro, la AZIDA y el CO se unen al Cu del complejo IV.
Inhiben el paso final de los e- hacia el O2. Los dos primeros reaccionan con
la forma oxidada del Fe3+ del cit aa3, mientras que el CO lo hace con la
forma reducida.
b) Atractilósido:
Inhibe la fosforilación oxidativa mediante la inhibición del transportador de
ADP hacia dentro de la mitocondria, y ATP hacia afuera de ella,
c) Rotenona:
El plaguicida botánico Rotenona, es un inhibidor de una de las enzimas del
Complejo I de la cadena de transporte de electrones. En presencia de este
insecticida, los electrones procedentes del NADH no pueden entrar en la
cadena de transporte de electrones, teniendo como consecuencia la
imposibilidad de obtener ATP a partir de la oxidación del NADH. La enzima
inhibida por la rotenona es la NADH deshidrogenasa. La rotenona afecta a
la respiración celular y también la coordinación muscular.
d) Monóxido de carbono
Inhibidor de la fosforilación oxidativa, aparte de desplazar al O2 de la
hemoglobina, a nivel celular se une a la forma reducida del hierro (Fe++)
de los grupos hem de la citocromo-oxidasa terminal y bloquea la entrada
de O2 a la misma.
e) Antimicina A:
Inhibidor de la fosforilación oxidativa, es un antibiótico producido por
Steptomyces griseous, que ha sido usado como veneno para controlar
alguna especie de peces, interfiriendo con el flujo de electrones en el
complejo III.

3. Asumiendo que las concentraciones mitocondriales de succinato y fumarato son

respectivamente de 0.0002 M y 0.00003 M, estimar el potencial redox en estas
condiciones. Considere que el proceso se estudia a pH 7.0 y a 25°C.

Succinato +CO2 + 2H +2e α - cetoglutarato + H2O EO= -0.031

Succinato fumarato + 2H + 2H +2e- EO= -0,031
2 succinato + CO2 fumarato + α – cetoglutaratp + H2O
0.0592
𝐸 = 𝐸𝑜 − ( 𝑙𝑜𝑔𝑄)
𝑛
0.0592 [0.00003]
𝐸 = (−0,639) − 𝑙𝑜𝑔
2 0.0004
𝐸 = −0,606

4. En el estudio de la reacción catalizada por la fosfoglucomutasa se encontró que

en el equilibrio las concentraciones de glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato
fueron 4.5 mM y
96.0 mM respectivamente. Calcular la constante de equilibrio y el G°' para
 esta reacción que se procesa a 25 °C.
5. Cuando el citrato es descompuesto para dar acetato y oxalacetato, el G°' es
de -680 cal/mol. Para la reacción catalizada por el citrato sinteasa la constante
de equilibrio es de 0.000032. Estime con estos datos la constante de equilibrio
para la reacción de hidrólisis del acetil CoA y el G°'.

Δ G°' acetilCaA = -7.5 Kcal/mol

Δ G°' = RT InK' eq
−7,5 = 1,987(298,15𝐾)𝑋 𝐼𝑛 𝐾𝑒𝑞
−7,5
= 𝑙𝑜𝑔𝐾𝑒𝑞
1,987(298,15𝐾)
7,5
𝐼𝑛 𝐾𝑒𝑞 =
592,424
𝐼𝑛 𝐾𝑒𝑞 = 0,01266
𝐼𝑛 𝐾𝑒𝑞 = 𝑒 0,01266

6. La reacción de hidrólisis del lactato deshidrogenasa tiene un G°' de -3.8

Kcal/mol. Encontrar la constante de equilibrio para dicha reacción que se realiza
en condiciones estándar.
Δ G° = RT In (Keq)
𝑐𝑎𝑙
−3,8 = −(1,98 )(298,15𝐾)𝐼𝑛𝐾𝑒𝑞
𝐾𝑚𝑜𝑙
−3.8
𝐼𝑛𝐾𝑒𝑞 =
592,126
𝐼𝑛𝐾𝑒𝑞 = −0,0064