

1. Demostrar la actividad de la enzima citocromo oxidasa presente en

músculo cardíaco o hígado bovino.
2. Demostrar la inhibición de la enzima citocromo oxidasa de corazón
o hígado bovino por efecto de cianuro de potasio (KCN).
3. Valorar a través del análisis del experimento, la importancia de la
citocromo oxidasa en la cadena respiratoria.

La energía que proviene de la oxidación completa de los combustibles es

convertida a enlaces fosfato de alta energía del trifosfato de adenosina o
ATP por el proceso de fosforilación oxidativa.
La mayor parte de la energía de la oxidación de combustibles obtenida en
el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs y otras vías es
conservada en la forma de coenzimas reducidas NADH y FADH 2. La cadena
transportadora de electrones oxida al NADH y FADH2 y dona los electrones
al oxígeno, el cual es reducido a H2O (Fig. 1). La energía liberada en la
reducción del oxígeno es usada para la fosforilación del ADP a ATP por la
ATP sintasa.
Fig. 1. Resumen del flujo de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno, ques
se reduce a agua. El bombeo de protones por el paso de electrones permite la síntesis
de ATP

Fosforilación oxidativa: La generación de ATP a partir de la fosforilación

oxidativa requiere un donador de electrones (NADH o FADH 2), un aceptor
de electrones (O2) y una membrana mitocondrial interna intacta, que es
impermeable a los protones, además de todos los componentes de la
cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa.
El rendimiento neto de la fosforilación oxidativa se aproxima a 2.5 mol de
ATP por mol de NADH oxidado o 1.5 mol de ATP por mol de FADH 2 oxidado.
Los componentes de la cadena respiratoria están contenidos en cuatro
complejos proteínicos grandes insertos en la membrana mitocondrial
interna Los electrones fluyen por la cadena respiratoria a través de un
intervalo redox de 1.1 V desde NAD+/NADH hacia O2/2H2O, y pasan por tres
complejos proteínicos grandes: NADH-Q oxidorreductasa (complejo I),
donde se transfieren electrones desde NADH hacia la coenzima Q, también
llamada ubiquinona; Q-citocromo c oxidorreductasa (complejo III), que
pasa los electrones hacia el citocromo c, y citocromo c oxidasa (complejo
IV), que completa la cadena, pasa los electrones hacia O 2 y hace que se
reduzca a H2O Algunas sustancias con potenciales redox más positivos que
NAD+/NADH, p. ej., succinato pasan electrones hacia Q por medio de la
succinato-Q reductasa (complejo II), en lugar del complejo I. Los cuatro
complejos están embebidos en la membrana mitocondrial interna, pero Q
y citocromo c son móviles. Q se difunde con rapidez dentro de la
membrana, mientras que el citocromo c es una proteína soluble. El flujo de
electrones a través de los complejos I, III y IV da por resultado el bombeo
de protones desde la matriz a través de la membrana mitocondrial interna
hacia el espacio intermembranal.
El último complejo citocromo de la cadena transportadora de electrones es
el del citocromo oxidasa; existe en todos los tejidos del cuerpo, excepto en
células donde no hay mitocondrias y se encuentra en más altas
concentraciones en el músculo cardíaco. Por este complejo pasan los
electrones del citocromo c al O2. La citocromo oxidasa contiene los
citocromos: a y a3, así como el sitio de unión al oxígeno. Una sola molécula
de O2 debe aceptar cuatro electrones para ser reducida a 2H 2O. La unión a
los iones cobre (Cu+2) en el complejo citocromo oxidasa facilita la captación
de los cuatro electrones y la reducción del O2. A través de estudios
efectuados con inhibidores, como monóxido de carbono, se ha concluido
que la citocromo oxidasa es una proteína que contiene hierro que se
encuentra en el anillo de porfírina. La actividad de la enzima y su inhibición
por CN- puede ser demostrada en una preparación de tejido por la
oxidación secundaria de sustancias tales como el indicador de óxido-
reducción llamado p-fenilendiamina, el cual se vuelve rojo o púrpura al
oxidarse (Fig. 2). En la célula, el cianuro se une al hierro de los grupos hemo
del citocromo aa3, componente de la citocromo oxidasa, en su estado
Fe3+impidiendo el transporte de electrones al O2. La respiración
mitocondrial y producción de energía cesa y la muerte celular ocurre
rápidamente.

Figura 2. Donación de electrones por el indicador p-fenilendiamina cuando compite con el

citocromo c para donar electrones al complejo citocromo oxidasa
La p-fenilendiamina reducida compite con el citocromo c reducido en su
papel de donador de electrones para la citocromo oxidasa; ambos son
sustratos capaces de ser oxidados por la citocromo oxidasa, pero la
oxidación de la p-fenilendiamina, al provocar una coloración roja, nos sirve
de indicador de la actividad del citocromo a + a3 (complejo citocromo
oxidasa).
En este experimento, se comprueba la inhibición de la enzima por KCN al
acoplarse con el hierro oxidado del citocromo a + a 3, al no producirse la
oxidación de la p-fenilendiamina permaneciendo incolora.

MUESTRA BIOLÓGICA

 Tejido cardíaco bovino

MATERIAL
 guantes
 1 Mortero y pistilo
 1 Tubo de centrífuga
 1 Espátula
 1 aspirador de pipetas
 1 Pipeta graduada de 5 mL
 1 Pipeta graduada de 10 mL
 4 Pipetas graduadas de 1 mL
 5 Tubos de ensayo
 beaker de 250 ml
 1 Gradilla para tubos
 Arena
 Hielo
REACTIVOS

 Solución de fosfato disódico 1/5 M (Na 2HPO4)

 Solución de cianuro de potasio 0.01% (KCN)(veneno)
 Solución indicadora de p - Fenilendiamina al 0.2%
EQUIPO
 1 Centrífuga
PROCEDIMIENTO
Se preparará un extracto de citocromo oxidasa a partir de tejido cardíaco o
tejido hepático bovino, pero debido a que las enzimas pierden actividad
rápidamente después de la muerte del animal, deberá prepararse el
extracto enzimático lo más pronto posible.
Pasos a seguir:
1. Utilice 5 gramos de corazón bovino y córtelo en pequeñas porciones
con una tijera o escalpelo y colóquelas en un mortero, el cual debe
colocar previamente sobre el recipiente con hielo.
2. Agregue aproximadamente una cantidad de arena igual a la cantidad
de tejido cardíaco y 4 mL de Na2HPO4 (fosfato disódico) 1/5 M
3. Triture la mezcla hasta obtener una pasta fina y agregue 8 mL más de
Na2HPO4 1/5M. Traslade el contenido a un tubo de centrífuga y deje
reposar durante 20-30min. en baño de hielo, utilizando para ello el
beaker y agitando ocasionalmente.
4. Centrifugue por 10 minutos y separe el sobrenadante colocándolo en
un tubo que rotulará: "Preparación de citocromo oxidasa". NOTA:
Mientras no se utilicen los tejidos o sus extractos, deberán
mantenerse en baño de hielo.
5. Prepare tres tubos de ensayo, rotúlelos 1, 2, 3, y colóquelos en la
gradilla para tubos.
 6. Siga los pasos que están descritos en el siguiente cuadro. Debe
respetar el orden que se indica.

1er. paso 2do. paso 3er. paso 4to. paso

mL de
mL de KCN* mL de p-
Preparación de mL de H2O
TUBOS al 0.01% fenilendiamina
Citocromo Destilada
(veneno) al 0.2%
Oxidasa
1 1 0 1 1
2 1 1 0 1
3 0 0 2 1

* PRECAUCIÓN: Por ser una sustancia venenosa, la solución de KCN nunca

se pipetea con la boca, sino que deberá extraerse por capilaridad con
pipeta serológica de 5 mL., o utilizando el aspirador de pipetas teniendo
cuidado de no entrar en contacto con la solución.
Agite los tubos frecuentemente y observe cualquier cambio de color; los
resultados de la reacción se obtienen entre 10 y 25 minutos.

1. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza tejido cardíaco o hepático en

este experimento?
Porque el tejido cardiaco es un tejido con un gran alto trabajo
metabólico y además es un tejido con un alto contenido de
mitocondria.
2. ¿Por qué se debe procesar rápidamente este tejido?
3. ¿Observa alguna diferencia de color en cada uno de los tubos? Si su
respuesta es sí, explique cuál es esa diferencia de color.
En el tubo número 1 se observa una coloración roja o púrpura, en el
tubo número 2 se observa un color rosa pálido y el tubo número 3 se
observa una solución incolora.
4. ¿En cuál de los tubos se evidencia la actividad de la enzima
estudiada y por qué?
 En el tubo número 1 se evidencia se evidencia la reacción de
transferencia de electrones porque el indicador p- Fenilendiamina ha
cambiado a un color rojo, la solución de p- Fenilendiamina es un
indicador de óxido-reducción. Los indicadores de óxido-reducción en
estado reducido tienen un color y en estado oxidada otro color, el p-
Fenilendiamina es estado reducido es incoloro y en estado oxidado
es de color rojo, por lo que en el tubo 1 que se colocó extracto de
citocromo, agua destilada y p- Fenilendiamina y en este tubo se
tienen dos donadores de electrones para el citocromo oxidasa, un
donador natural que es el citocromo C y un donador artificial que es
el p- Fenilendiamina.
5. ¿Cuál fue el resultado en el tubo 2? Explíquelo.
En el tubo 2 se evidencia la inhibición del complejo 4 por el cianuro
de potasio, el cianuro de potasio se une al hierro de los grupos hemo
del citocromo oxidasa en su estado férrico y de esta forma impide el
transporte de electrones hacia el oxígeno.
6. ¿Cuál es el estado de oxidación del indicador en el tubo 3?
Explíquelo.
En el tubo 3 que se colocó 2 mL de agua destilada y 1 mL de p-
Fenilendiamina, este tubo sirve como una forma de comparar el
indicador en estado reducido que es incoloro y cuando a ocurrido la
oxidación de este indicador cambia a color rojo.
7. Escriba la lista de los reactivos y la función que realizan en este
experimento cada uno de ellos.
p- Fenilendiamina: sirve como indicador redox y es donadora artificial
de electrones.
8. Esquematice la cadena transportadora de electrones y ubique los
inhibidores de cada complejo.
Inhibición del complejo 4 por el cianuro de potasio.
9. Investigue el potencial de óxido reducción de la p-fenilendiamina
p-fenilendiamina E0= +0.24
10.Escriba los desacopladores naturales y artificiales de la cadena
transportadora de electrones y la fosforilación oxidativa.
 Naturales: p- Fenilendiamina, citocromo c.
Artificiales: p- Fenilendiamina
11.Escriba la reacción global de la cadena respiratoria con la secuencia
de los transportadores electrónicos

Complejo I: NADH + H+ + Q → NAD+ + QH2

Complejo II: succinato + Q + 2H+ → fumarato + 2H+ + QH2
Complejo III: QH2 + 2 citocromo C1 (oxidado) + 2H+ → Q + 2 citocromo C1
(reducido) + 4H+
Complejo IV: 2 citocromo C (reducido) + 4H+ + ½ O2 → 2 citocromo C
(oxidado) + 2H+ + H2O
Oxidado: Fe3+
Reducido: Fe2+
12.Defina el proceso de fosforilación oxidativa.
La fosforilación oxidativa es el proceso mediante el cual se oxidan
estas moléculas transfiriendo sus electrones al O 2 y la energía
resultante es aprovechada en forma de síntesis de ATP.
que comprenden este experimento número 4 tienen las herramientas para poder responder a estas
preguntas hemos terminado la práctica número 4 Muchas gracias por su atención Este es el
experimento número 4 de bioquímica 1 preparado por mi persona Mi nombre es este la luz Rivas de
carril el experimento número 4 tiene como título actividad de la enzima citocromo oxidasa en corazón
bovino la enzima citocromo oxidasa pertenece a la clase de las óxido reductasas citocromo oxidasa es
el nombre del complejo número 4 de la cadena transportadora de electrones que tiene como función
transportar los electrones desde el citocromo c hace el oxígeno molecular al aceptar los electrones el
oxígeno molecular se reduce a agua los objetivos a cumplir en este experimento son demostrar la
actividad de la enzima citocromo oxidasa presente en músculo cardíaco bovino demostrar la inhibición
de la enzima citocromo oxidasa Por efecto de cianuro de potasio valorar a través del Análisis del
experimento la importancia de la citocromoxidasa en la cadena transportadora de electrones los
reactivos a utilizar son una solución buffer de fosfato disódico un quinto molar una solución de cianuro
de potasio 0.01% una solución de parafenal de amino al 0.2% agua destilada el material que se va a
utilizar en esta práctica son un mortero y pistilo tubo de centrífuga una espátula un aspirador de
pipetas una pipeta graduada de 5 mililitros una pipeta de 10 mililitros 4 pipetas graduadas de un
mililitro tubo de inside un biker de 250 mililitros una gradilla para tubo de ensayo y una gradilla para
pipetas además se va a utilizar hielo arena y guantes y como equipo se va a utilizar una centrífuga la
muestra biológica que se va a utilizar en esta determinación de la actividad de la citocromoxidasa es
tejido cardíaco para preparar un extracto de citocromo oxidasa entonces va a ser a partir del tejido
cardíaco Por qué razón porque el tejido cardíaco es un tejido con un alto trabajo metabólico y además
es un tejido con un alto contenido de mitocondrias por lo que se procede a comenzar en la preparación
de la muestra la preparación del extracto de citocromo oxidasa y se pesan 5 gramos de tejido cardíaco
y con una tijera se corta en pequeñas porciones y se coloca en un mortero luego se va a agregar una
cantidad de arena igual a la cantidad de músculo cardíaco es necesario agregar arena porque se
conoce que los diferentes complejos de la cadena transportadora de electrones están incrustados en
la membrana mitocondrial interna y para extraerlos es necesario la trituración de la muestra biológica
con arena luego se va a agregar 4 mililitros de la solución buffer de sulfato disódico un quinto molar
para poner la encima en sus condiciones óptimas de catalizar la reacción se procede a triturar el tejido
cardíaco hasta obtener una pasta fina para obtener la pasta fina es necesario agregar 8 mililitros de la
solución buffer fosfato fosfato de sodico un quinto molar cuando ya se obtiene la pasta fina se traslada
el contenido a un tubo de centrífuga se deja reposar el extracto se deja reposar durante 30 minutos
en un baño de hielo luego se centrifuga se colocan ustedes los dos tubos que se tienen de centrífuga
se colocan en aceite jugadora se centrifuga por 10 minutos a 200 revoluciones por minuto después de
los 10 minutos se sacan los tubos la centrifugación es un método físico de separar sólidos de líquidos
después de los 10 minutos de centrifugación se separa el sobre nadante y se coloca en un tubo
rotulado preparación de citocromoxinas aquí tenemos ya el sobre nadante obtenido de la
centrifugación y es el preparado de citocromo oxidación luego se procede a la preparación de los tubos
de ensayo siguiendo las indicaciones debe prepararse tres tubos de ensayo rotulados 1 2 y 3 y
colocados en una gradilla para todos en el tubo número 1 se va a colocar un mililitro de preparado de
citocromo oxidasa un mililitro de agua destilada y un mililitro de la solución de para femenil de amino
al 0.2% en el tubo número 2 se va a colocar un mililitro del preparado de citocromo oxidasa un mililitro
de la solución de cianuro de potasio al 0.1% al 0.01% y un mililitro de la solución de parafeno y el día
amino al 0.2% en el tubo número 3 se va a colocar 2 mililitros de agua destinada y un mililitro de para
mí precaución por ser una sustancia venenosa la solución de cianuro de potasio nunca se piquetea
con la boca sino que deberá extraerse por capilaridad con pipeta serológica de 5 mililitros o utilizar el
aspirador de pipeta teniendo cuidado de no entrar en contacto con la solución luego que ya se tienen
los tres tubos de ensayo preparados agite los tubos frecuentemente y observe cualquier cambio de
color los resultados de la reacción se obtienen Entre 10 y 25 minutos observación y resultados en el
tubo número 1 Se observa una coloración rojo o púrpura en el tubo número 2 Se observa una
coloración rosa pálido y en el tubo número 3 Se observa uno una un una solución incolora y los
resultados son en el tubo número uno se evidencia que ha ocurrido la reacción de transferencia de
electrones porque el indicador para fines de amino ha cambiado a un color rojo es la solución de
parafene y amino es un indicador de óxido reducción Los indicadores de óxido reducción en estado
reducido tienen un color y en estado oxidado tienen otro color el parapéndiramino en estado reducido
es incoloro y en estado oxidado es de color rojo por lo que en el tubo número 1 que se colocó extracto
de citocroma agua destilada y para femenil de amino en este tubo se tienen dos donadores de
electrones para la citocromoxidasa un donador natural que es el citocromo c y un donador artificial
que es el paramino entonces la solución de parafenis hoy en día mino en este experimento tiene dos
funciones una de servir de indicador y otra de ser donador artificial de electrones entonces en el tubo
número uno hay un una transferencia de electrones que se puede evidenciar por el cambio de color
del indicador redox en el tubo número 2 se evidencia la inhibición del complejo 4 por el cianuro de
potasio él se anuló de potasio se une al hierro de los grupos hemo del citocromo oxidasa en su estado
férrico y de esta forma impide el transporte de electrones hacia el oxígeno en el tubo número 3 que
se colocó 2 mililitros de agua destilada y un mililitro de paramino este tubo sirve como una forma de
comparar el indicador en estado reducido que es en color y cuando ha ocurrido la oxidación de este
indicador cambie a un color rojo porque utilizamos el parapén hoy en día mino como indicador de
óxido reducción en este experimento si observamos en la diapositiva está la tabla que contiene los
potenciales redos de los transportadores electrónicos de la cadena respiratoria aquí podemos
observar los diferentes transportadores electrónicos de la cadena transportadora de electrones con
sus respectivo potencial r2 y aquí está el indicador para feneriamina con su potencial redox que es
más 0.24 y si observamos en esta tabla el potencial r2 del citocromo C Que es más 0.254 entonces
podemos concluir que este indicador puede ser utilizado en este experimento como donador artificial
de electrones porque por el por el valor del potencial redox puede competir con el citocromo C para
donarle los electrones al citocromo oxidasa ya he realizado los diferentes pasos

1- ¿Cuál es la razón por la que se utiliza tejido cardíaco o hepático en este experimento?

Pregunta 1 No se utiliza tejido cardíaco hepático en este experimento. Se utiliza tejido cardíaco bovino
porque es un tejido con un alto trabajo metabólico y un alto contenido de mitocondrias, lo que lo hace
ideal para la preparación del extracto de citocromo oxidasa.

3. ¿Observa alguna diferencia de color en cada uno de los tubos? Si su respuesta es sí, explique cuál
es esa diferencia de color.

Pregunta 3

En el tubo número 1, se observa una coloración rojo o púrpura, lo que indica que ha ocurrido la
reacción de transferencia de electrones. En el tubo número 2, se observa una coloración rosa pálido,
lo que indica la inhibición del complejo 4 por el cianuro de potasio. En el tubo número 3, se observa
una solución incolora, que sirve como una forma de comparar el indicador en estado reducido

La rapidez en el procesamiento del tejido cardíaco bovino utilizado en el experimento es importante

porque el tejido cardíaco es un tejido con un alto trabajo metabólico y un alto contenido de
mitocondrias. Por lo tanto, es necesario procesar rápidamente la muestra para obtener un extracto
de citocromo oxidasa activo y evitar la degradación de la muestra.
4. ¿En cuál de los tubos se evidencia la actividad de la enzima estudiada y por qué?

Pregunta 4

La actividad de la enzima citocromo oxidasa se evidencia en el tubo número 1. En este tubo se observa
una coloración roja o púrpura debido a que ha ocurrido la reacción de transferencia de electrones, lo
que se evidencia por el cambio de color del indicador redox. El indicador utilizado es el
parafenilendiamina, que en estado reducido es incoloro y en estado oxidado es de color rojo. En el
tubo número 1 se tienen dos donadores de electrones para la citocromo oxidasa: uno natural, que es
el citocromo c, y otro artificial, que es el parafenilendiamina. Por lo tanto, la solución de
parafenilendiamina en este experimento tiene dos funciones: servir de indicador y ser donador
artificial de electrones. La transferencia de electrones se produce cuando el parafenilendiamina dona
sus electrones al citocromo oxidasa, lo que provoca el cambio de color del indicador

5. ¿Cuál fue el resultado en el tubo 2? Explíquelo.

Pregunta 5

La coloración rosa pálido en el tubo número 2 indica que ha ocurrido una inhibición del complejo 4
por el cianuro de potasio. El cianuro de potasio se une al hierro de los grupos hemo del citocromo
oxidasa en su estado férrico y de esta forma impide el transporte de electrones hacia el oxígeno. La
coloración rosa pálido es el resultado de la reacción del indicador para feneriamina con el complejo 4
inhibido.

6. ¿Cuál es el estado de oxidación del indicador en el tubo 3? Explíquelo.

Pregunta 6

El indicador utilizado en el tubo número 3 es el parafenilendiamina, y en su estado reducido es

incoloro, mientras que en su estado oxidado es de color rojo. Se utiliza como una forma de comparar
el indicador en estado reducido porque al agregar el donador artificial de electrones (paramino) al
tubo número 1, se produce una transferencia de electrones que cambia el color del indicador a rojo,
lo que indica que ha ocurrido la reacción de transferencia de electrones. Al comparar el color del
indicador en el tubo número 3 con el color del indicador en el tubo número 1, se puede determinar si
ha habido una transferencia de electrones en el tubo número 1.

7. Escriba la lista de los reactivos y la función que realizan en este experimento cada uno de ellos

Pregunta 7

Los reactivos utilizados en este experimento son una solución buffer de fosfato disódico, una solución
de cianuro de potasio al 0.01%, una solución de parafenal de amino al 0.2%, y agua destilada.

La solución buffer de fosfato disódico se utiliza para poner la enzima en sus condiciones óptimas de
catalizar la reacción. La solución de cianuro de potasio se utiliza para demostrar la inhibición de la
enzima citocromo oxidasa. La solución de parafenal de amino se utiliza como indicador de óxido-
reducción y como donador artificial de electrones. El agua destilada se utiliza como disolvente y para
preparar las soluciones diluidas

9. Investigue el potencial de óxido reducción de la p-fenilendiamina

El potencial de óxido reducción de la p-fenilendiamina no se menciona en el contexto proporcionado.
Lo siento, no puedo proporcionar una respuesta precisa a su pregunta