Quimotripsina

TABLA DE CONTENIDO

Introducción y características generales ................................................................ 1

Activación del quimotripsinógeno ................................................................................. 1
Nombre sistémico y código numérico ............................................................................ 1

Generalidades sobre el mecanismo de acción........................................................ 2

Ensayo enzimático ................................................................................................ 3
Procedimientos de purificación ............................................................................. 3
Procedimiento experimental ......................................................................................... 3

importancia metabólica ........................................................................................ 4

Mecanismos de regulación de la actividad ............................................................ 4
aplicaciones biotecnológicas ................................................................................. 4
Bibliografía ........................................................................................................... 5

• LUCÍA GARCÍA FERNÁNDEZ

• ANDREA GARCÍA FERNÁNDEZ
• OLAYA GONZÁLEZ GARCÍA
• MARCOS MATEOS BENITO

Estructura y función de las proteínas

2º Grado en Biotecnología Universidad de Oviedo
INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES

La quimotripsina es un enzima hidrolítico que digiere proteínas en el intestino delgado. Esta

digestión conlleva la ruptura de enlaces peptídicos adyacentes a los grupos carboxilo de los aminoácidos
aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). Esta rotura es termodinámicamente favorable pero aún
así sucede de forma extraordinariamente lenta en ausencia de catalizadores.

Es una glicoproteína perteneciente a la familia de las peptidasas S1 y al grupo de las serín-

endopeptidasas porque tiene serina en su centro activo y actúa sobre residuos no terminales.

En humanos, es sintetizada por el páncreas en forma de quimotripsinógeno (zimógeno) en

respuesta a una señal hormonal generada cuando el alimento sale del estómago. No se secreta
directamente en su forma activa para evitar que lleve a cabo su actividad degradativa en el interior celular
lo que tendría consecuencias catastróficas para la célula. El quimotripsinógeno es transportado desde el
jugo pancreático hasta el duodeno, donde es activado por la tripsina mediante una escisión hidrolítica.

En cuanto las características estructurales, está formada por unos 241 residuos y presenta tres
cadenas polipeptídicas unidas entre sí por 5 puentes disulfuro intercatenarios. Su peso molecular es
aproximadamente de 24,8 kDa. Abunda la disposición antiparalela de láminas plegadas pero no hay
regiones extensas de lámina plegada regular. De hecho, los puentes de hidrógeno se establecen entre
aminoácidos muy próximos lo que indica que no sigue estrictamente una estructura de lámina beta.

ACTIVACIÓN DEL QUIMOTRIPSINÓGENO

El primer paso es la activación del tripsinógeno, precursor de la tripsina, otra serín proteasa. El
tripsinógeno es activado por la acción de unas enteropeptidasas del duodeno, que eliminan el
hexapéptido de su extremo N-terminal. Una vez que tenemos tripsina activa será esta proteasa la que
activará al resto de zimógenos, entre ellos el quimotripsinógeno, mediante rupturas proteolíticas
específicas:

1. La tripsina rompe en enlace entre la Arg 15 y la Ile 16; el péptido N-terminal continuaría unido a
la molécula debido a uno de los 5 puentes disulfuro (entre los residuos 1 y 122). El producto es
la π-quimotripsina, que ya presenta cierta actividad.
2. La carga positiva que se forma en el extremo Ile 16, que debido al corte anterior ahora está libre,
provoca ciertos reordenamientos en la estructura que facilitarán la formación del centro activo
correctamente.
3. Ahora se producen nuevas rupturas catalíticas, esta vez entre los residuos Ser 14 y Arg 15 y los
residuos Thr 147 y Asn 148 liberando dos dipéptidos. Esto produce la α-quimotripsina final que
es la forma principal y totalmente activa del enzima del tubo digestivo.

NOMBRE SISTÉMICO Y CÓDIGO NUMÉRICO

La α-quimotripsina, como todos los enzimas, esta designada por un número de clasificación y un
nombre sistémico que describen el tipo de reacción que cataliza el enzima. Estas dos formas de
nomenclatura han sido establecidas por la Comisión de Enzimas (E.C. por sus siglas en inglés). En este caso
el código numérico asignado a la α-quimotripsina es EC 3.4.21.1.

- La primera cifra es un 3 y representa el nombre de la clase (hidrolasa).

- La segunda cifra es un 4, indica la subclase. Aporta información del tipo de enlace que se rompe,
en este caso, un enlace peptídico.

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 - La tercera cifra, 21, es la sub-subclase. Señala que los uno de los residuos que participa en el
centro activo es de serina.
- La cuarta y última cifra, un 1, indica que la ruptura del enlace peptídico se produce cerca de un
aminoácido aromático.

GENERALIDADES SOBRE EL MECANISMO DE ACCIÓN

El mecanismo de proteólisis tiene lugar en varias etapas:

1. El sustrato polipeptídico se une de forma no covalente al enzima por su centro activo que
contiene la tríada catalítica que consiste en un residuo de Ser, uno de His y un Asp.
2. La histidina cede un protón al aspartato y lo recupera de la serina o, con otras palabras, el
aspartato capta un protón de la serina, que queda desprotonada, a través de la histidina.

3. La serina (desprotonada) es así capaz de atacar al enlace peptídico del sustrato, lleva a cabo un
ataque nucleófilo al carbonilo, y forma un intermediario tetraédrico. El sustrato queda unido a
la enzima de modo covalente (estado de transición).
4. Se transfiere un protón al fragmento C-terminal que se libera por ruptura del enlace peptídico.
El péptido N-terminal resultante de la ruptura queda unido a la Ser. El péptido liberado se vuelve
a protonar en su extremo amino captando un protón de la His, que recuperará a su vez la forma
protonada gracias a la cesión de un protón por el aspártico.

5. El aspartato capta de nuevo un protón de la histidina, con lo que ésta puede captarlo a su vez del
agua.

Se genera así un anión hidróxido que ataca al intermedio

éster entre la serina y la parte carboxilo del péptido
sustrato que estaba unido. Se forma un nuevo intermedio
tetraédrico unido a la enzima.

6. Se regenera el grupo carboxilo del péptido, separándose la serina y quedando así libre el otro
fragmento peptídico del sustrato inicial. La serina recupera el protón a costa de la histidina, que
a su vez lo capta del aspártico regenerando la tríada catalítica (Asp, His, Ser) en su estado original.

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ENSAYO ENZIMÁTICO

La actividad de la quimotripsina se puede medir mediante un ensayo fluorimétrico utilizando un

sustrato específico, (SC-Ala-Ala-Pro-Phe)2-rodamina. El péptido puede ser degradado por esta enzima al
ser la fenilalanina voluminosa y entonces se libera la rodamina, cuyas propiedades fluorescentes se
pueden cuantificar.

PROCEDIMIENTOS DE PURIFICACIÓN

Basándose en la purificación de enzimas proteolíticas tipo tripsina y quimiotripsina, es decir, serín

proteasas, se puede proponer el siguiente método de purificación del enzima.

El procedimiento se basa en una cromatografía de interacción hidrofóbicae (HIC), que consiste

en la separación de moléculas según su hidrofobicidad. En la fase estacionaria se sitúan ligandos
hidrofóbicos inmovilizados y la móvil la forma una disolución alta en concentración salina que hará que
los residuos hidrofóbicos se distribuyan por la superficie de la proteína. Para eluir se aplica un gradiente
salino descendente. La concentración de sal tiene que ir disminuyendo de forma que se vayan separando
de la fase estacionaria por hidrofobicidad.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Se homogeniza la muestra. En el caso del artículo (Osuna-Amarillas y col.) consistía en vísceras
de la especie Scomberomorus sierra, se centrifuga la mezcla obtenida y se recupera el
sobrenadante. Tras varios ciclos de centrifugación se obtiene el extracto crudo o libre de células.

2. Para la HIC se proponen los materiales utilizados en el artículo que consistían en una fase
estacionaria de fenil sacarosa establecida en una columna de 1,2 cm de diámetro y 40 cm de
longitud. Como fase móvil, una disolución 50 mM de Tris-HCl y CaCl2 0,02 M a pH=8,0. Como
eluyente se utilizó el mismo tampón de la fase móvil mezclado con glicerol.

3. Se obtienen las fracciones y se analizan espectroscópicamente (espectrofotómetro UV-Vis) a una

longitud de onda de 280 nm para analizar en cuáles de ellas se encuentran las proteínas.

3
 4. Se lleva a cabo una electroforesis en gel de
poliacrilamida en condiciones nativas (no
desnaturalizantes) utilizando como patrón
azocaseína. Se inyecta una pequeña alícuota de los
extractos que presentaban la absorbancia y se
espera a que finalice la electroforesis. En uno de los
extractos (extracto f) se obtuvo una banda de peso
molecular similar a 20 kDa que se correspondería con
una quimotripsina.

IMPORTANCIA METABÓLICA

Al ser una proteasa está claro que su papel principal es la degradación de proteínas, por lo que va
a colaborar en la digestión de alimentos ricos en proteínas en el organismo. Este enzima es sintetizado en
su forma inactiva en el páncreas y posteriormente llega al duodeno, donde desempeña su papel digestivo.

Además, la quimotripsina participa en la rotura mitocondrial durante la apoptosis.

MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD

El principal mecanismo de regulación de las enzimas digestivas consiste en sintetizarlas en forma

de precursor inerte (quimotripsinógeno) y luego activarlas por escisión de unos pocos nucleótidos.

Una vez se ha sintetizado la alfa-quimotripsina, se puede disminuir su actividad con inhibidores

como la aprotinina. Se trata de un polipéptido extraído del pulmón bovino que inhihbe de manera
reversible muchos tipos de proteasas. La aprotinina influye en el sistema de coagulación, por lo que es
frecuente su uso en cirugía cardiaca y cerebral para evitar hemorragias.

La inhibición es producida por la interacción del residuo de lisina en posición 15 del péptido de
aprotonina con la serina del centro activo de la quimotripsina. No solo se une a enzimas aisladas sino
también a aquellas que están unidas a un tercer elemento, por lo que su actividad inhibitoria es aún más
potente.

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS

La quimotripsina se utiliza como fármaco para pacientes con insuficiencia pancreática. Se

administra en forma de cápsulas entéricas (su contenido solo es liberado al llegar al intestino) que
contienen un cóctel de proteasas entre las que se encuentran tripsinas y quimotripsinas junto con otros
enzimas digestivos como lipasas o amilasas.

En estos casos las enzimas utilizadas fueron obtenidas de vegetales (como la papína de la papaya
o la bromelina de la piña) u hongos (como la Takadiastasa, un enzima obtenido de la especie Aspergillus
oryzae).

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BIBLIOGRAFÍA

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Recuperado de https://www.brenda-
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