PCR.

MR2 TALAVERA GARCIA, KATTIA

Desde que Watson y Crick publicaron el modelo
de la estructura en doble hlice del cido
desoxirribonucleico o ADN, se ha producido una
verdadera revolucin que ha llevado a crear una
nueva rama de la ciencia, la Biologa
Molecular, cuyo objetivo fundamental es la
comprensin de todos aquellos procesos
celulares que contribuyen a que la informacin
gentica se transmita eficientemente de unos
seres a otros y se exprese en los nuevos
individuos, es decir, aquellos procesos celulares
en los que participan los cidos nucleicos; por
tanto utiliza varias herramientas y tcnicas para
su estudio
Gracias a este avance, se pueden
producir fragmentos de cidos
nucleicos a gran escala, abriendo as
las puertas a la secuenciacin de los
cidos nucleicos y por ende a nuevas
disciplinas como el diagnstico
molecular, la terapia gnica o la
obtencin de organismos superiores
recombinantes
Hechos que contribuyeron en el
desarrollo de la biologa molecular
En 1866 Mendel publica sus experimentos
conducentes a los principios de segregacin y
clasificacin independiente de los genes.
En 1869 Frederick Miescher, cientfico suizo
descubre en el ncleo de las clulas una sustancia
de carcter cido a la que llam nuclena.
En los aos veinte el qumico alemn Robert
Feulgen, utilizando una tincin especfica descubri
que el DNA estaba situado en los cromosomas.
En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban
que el DNA es el portador de la informacin
gentica.
En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del
DNA
Hablando especficamente de DNA
segn el modelo de Watson y Crick, la
molcula est constituida por dos
largas cadenas de nucletidos con
polaridad opuesta, unidas entre s
formando una doble hlice. Cada
nucletido est formado por :
1.- Molcula de azcar (desoxirribosa)
2.- Base orgnica nitrogenada: bases
pirimdicas (Citosina, timina), bases
pricas (Adenina, Guanina).
3.- Grupos fosfato.
ADN
El ADN es una estructura de forma helicoidal
constituida por dos cadenas complementarias
entre si;
En la parte externa se localizan las molculas
de azcar-fosfato y en la parte central se
encuentran las bases orgnicas nitrogenadas
unidas las de una cadena con las de la otra, a
travs de puentes de hidrgeno, lo que da as
estabilidad a la doble hlice; las dos cadenas
tienen sentidos opuestos, una va en sentido 5 -
3 y la otra lo hace en sentido 3 - 5.

ADN
El ADN regula la naturaleza y
composicin de las clulas, transmite
la informacin hereditaria, determina la
estructura de las protenas y a travs
de enzimas controla el resto de las
funciones celulares.

Estas actividades las lleva a cabo al
realizarse una copia de un fragmento de la
molcula o de toda, ya sea que se
requiera la sntesis de una protena o la
transmisin de la informacin gentica de
la clula.
Para que ambas
situaciones se
lleven a cabo
eficientemente,
las dos cadenas
de ADN deben
separarse.
Estructura primaria del DNA
La estructura primaria viene dada por la
secuencia de nucletidos.
Cuando se quiere representar la
secuencia de un oligonucletido o de un
cido nucleico, se representa mediante la
terminologa de cada una de las bases.
Por ejemplo:
5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3
El orden de la secuencia es muy
importante, ya que en l reside la
informacin contenida en el cido
nucleico; la orientacin viene dada en el
sentido 5 3 o 3 5 ;
el 5 representa el extremo terminal del
fosfato y el 3 el extremo final del tomo de
carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria del DNA
El DNA es una doble hlice antiparalela ya que
el enfrentamiento entre las bases nitrogenadas
es constante; la Adenina siempre se enfrenta
con la timina formando dos puentes de
hidrgeno y la Guanina siempre se enfrenta con
la Citosina formando tres puentes de hidrgeno.
Esta caracterstica provoca que las dos cadenas
sean complementarias.
Las dos cadenas de la doble hlice tienen
sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5
3 y la otra lo hace en sentido 3 5.
Estructura terciaria y cuaternaria
del DNA
Recordemos que la longitud de una hebra de
DNA humano es de varios metros, por
necesidad debe adoptar otras estructuras para
poder estar en el interior de las clulas.
Estas estructuras, terciaria y cuarternaria,
permiten el empaquetamiento del DNA
formando los cromosomas.
En las clulas eucariotas existen varios
cromosomas y en los procariotas, existe un DNA
empaquetado denominado pseudocromosoma.
Aspectos bsicos de la Biologa
Molecular
La aparicin de una serie de tcnicas
englobadas dentro del trmino genrico de
Ingeniera gentica y referidas indistintamente
como clonacin, DNA recombinante o
manipulacin gnica han sido la causa de
pocas reas de la biologa molecular
permanezcan inalteradas.
Antes del desarrollo de la ingeniera gentica no
era posible aislar un gen concreto eucaritico en
cantidades suficientes para su estudio molecular
o el de su producto.
Una de las sustancias mas importantes y
de participacin decisiva en distintos
procesos de la Biologa Molecular son las
enzimas; existen varias que podemos
destacar:
Endonucleasas de restriccin:
Son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos
rompiendo enlaces internucletidos del interior
de la cadena.
Son producidas principalemnete por bacterias
que hidrolizan enlaces fosfodiester del
esqueleto del DNA de doble hebra en
secuencias especficas. Las endonucleasas de
restriccin de tipo II son las mas tiles en los
mtodos de DNA debido a su especificidad de
secuencia absoluta, tanto para la reaccin de
unin como para la de ruptura.
Endonucleasas de restriccin:
Casi todas las secuencias nucleotdicas
reconocidas por las endonucleasas de
restriccin poseen un eje de simetra impropio
binario, esto es, la lectura de la secuencia en
ambas direcciones es la misma, lo que recibe el
nombre de palndromes.
La rotura se produce en ambas hebras de DNA
siendo esta simtrica respecto al eje binario.
Las endonucleasas de restriccin cortan el DNA
generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro
nucletidos de longitud, denominados extremos
cohesivos, o bien extremos romos.
Polimerasas:
Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA
"in Vitro". La mayora de estas enzimas
requieren un molde y sintetizan una molcula
complementaria al molde.
Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia
son: DNA polimerasa I de E. Coli, el fragmento
de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como
molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA
polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa
de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq
polimerasa.
Polimerasas:
La mayora de las polimerasas necesitan
un pequeo cebador o primer
complementario al DNA molde para iniciar
la polimerizacin a partir de ese punto.
La transferasa terminal es una polimerasa
que no requiere molde y que aade
nucletidos exclusivamente a los
extremos de las cadenas preexistentes.
Todas ellas requieren Mg2 .
Otras enzimas:
Ligasas (une extremos de DNA
protuberantes o romos),
fosfatasas (eliminan el fosfato de la regin
5 de los cidos nucleicos),
quinasas (incorporan fosfatos en el
extremo 5 que han dejado las fosfatasas).
LA REACCION EN CADENA
DE LA POLIMERASA
El mtodo y sus aplicaciones

PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa,
ya ms conocida como PCR, es una
tcnica que permite replicar entre cientos
de miles y millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in vitro,
pequeas cantidades de ADN.
PCR
Uno de los aportes fundamentales de esta
metodologa a la investigacin bsica en
biologa molecular consiste, precisamente, en la
rapidez y eficiencia mediante las cuales se
realiza una tarea que antes requera largas y
tediosas ornadas.
El producto que se obtiene al finalizar la
reaccin -una gran cantidad de un fragmento
gnico con alto grado de pureza- favorece la
tarea de los investigadores empeados en
ampliar nuestros conocimientos sobre la
estructura y funcin de los genes.
PCR
Por su alta sensibilidad, esta tcnica
permite identificar un gen a partir de un
solo cabello, una clula somtica o un
espermatozoide.
Ha facilitado, y en muchos casos hecho
posible, la tarea de identificacin de
personas, por ejemplo de hijos de
desaparecidos, mediante el anlisis de
muestras del nio y de su abuela materna.
PCR
Entre las aplicaciones mdicas de la PCR
cabe destacar su aporte al desarrollo de
nuevas estrategias de diagnstico.
Permite detectar agentes infecciosos
como los virus de las hepatitis B y C o
regiones del genoma del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV).
PCR
Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar
la presencia o ausencia de HIV en recin
nacidos de madres seropositivas, pues la
existencia de anticuerpos maternos impide
obtener resultados confiables, con los mtodos
convencionales, durante el primer ao de vida.
Tambin ha facilitado el diagnstico de
enfermedades tales como las hemofilias A y B,
la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo
posible reconocer mutaciones de genes
vinculadas con enfermedades oncolgicas.
PCR
Su sensibilidad permite detectar
poblaciones residuales de clulas
cancerosas en pacientes sometidos a
quimioterapia y de este modo se ha
podido determinar, con una antelacin
en extremo valiosa, un nuevo avance
de la enfermedad.
DESARROLLO DE LA
TCNICA DE REACCION EN
CADENA
DE LA POLIMERASA
En los aos setenta se desarrollaron los
mtodos que permitieron de manera simple y
relativamente rpida para determinar la
secuencia nucleotdica de cualquier fragmento
de DNA.
Estos primeros intentos de secuenciar los
cidos nucleicos siguieron los pasos empleados
en la secuenciacin de protenas: romper las
molculas en pequeos fragmentos, determinar
su composicin de bases y deducir la secuencia
a partir de fragmentos solapantes.
Este mtodo resulta mas o menos sencillo
para protenas que resultan de la
combinacin de hasta veinte aminocidos
distintos, pero constituye un problema en
el caso de los cidos nucleicos donde la
secuencia resulta de la combinacin de
nicamente cuatro nucletidos diferentes.
REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a
conocer la Tcnica de reaccin en cadena
de la Polimerasa o PCR que es una
tcnica para la sntesis "in Vitro" de
secuencias especficas de DNA con la
cual la insuficiente cantidad de ADN ya no
es un problema en los procedimientos de
Biologa Molcular ni en los
procedimientos de diagnstico basados en
el estudio de DNA.
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La tcnica se basa en la replicacin del
ADN en los organismos eucariotas
realizada por la DNA polimerasa.
Estas enzimas realizan la sntesis de una
cadena complementaria de DNA en el
sentido 5-> 3 usando un molde de
cadena sencilla, pero a partir de una
regin de doble cadena.
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Para crear esta regin doble cadena se
usan los denominados iniciadores
(primers).
Son una pareja de oligonucletidos
sintetizados de manera que sean
complementarios a cada uno de los
extremos 3 del fragmento de DNA que se
desea amplificar.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Partiendo de este principio, la reaccin
en Cadena de la Polimerasa se basa en
la repeticin de un ciclo formado por
tres etapas:
ETAPAS
1 Desnaturalizacin del ADN doble
cadena
2 Hibridacin de los iniciadores a la
zona 3 especfica de cada una de las
hebras
3 Extensin del cebador por actuacin
de la DNA polimerasa
Desnaturalizacin del ADN doble
cadena
En la primera etapa (desnaturalizacin) la
doble hlice de ADN se separa en dos
hebras.
Para ello se realiza una incubacin de la
muestra a altas temperaturas (93-97C).
La renaturalizacin se producir cuando
la temperatura disminuya.
Hibridacin
En el segundo paso (hibridacin) los
cebadores se unen a las zonas 3
complementarias que flanquean el
fragmento que queremos amplificar.
Se realiza gracias a la bajada de la
temperatura (50-65 C)
En la tercera etapa (elongacin) se
produce la sntesis de una cadena sencilla
(producindose un fragmento de doble
cadena por la complementariedad) en la
direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA
polimerasa, la cual incorpora los
desoxinucletidos fosfato presentes en el
medio siguiendo la cadena molde.
Este proceso se
lleva a cabo en
un equipo
llamado
termociclador.
Este aparato realiza los
ciclos en los tiempos y
temperaturas
programadas de forma
exacta.


Termociclador para
reacciones de PCR


una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la
muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del
tercero 8...Si los ciclos se producen un nmero "n" de veces y
suponiendo que el nmero de copias de ADN se duplica en cada
ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la
amplificacin se realiza en forma de progresin geomtrica.
La deteccin del producto de la Reaccin
en Cadena de la Polimerasa se realiza
normalmente mediante corrido
electrofortico (fig 5) dependiendo del
tamao de la amplificacin y la resolucin
que deseemos utilizaremos diferentes
medios (agarosa, poliacrilamida) a
distintas concentraciones.
La posterior visualizacin se puede
realizar con bromuro de etilio (lmpara de
luz UV), tincin de plata, fluorescencia,
radioactividad.
Preparacin del corrido electrofortico
A continuacin trataremos de profundizar
en los componentes y parmetros ms
importantes para obtener una
amplificacin ptima.
Componentes y optimizacin
de la reaccin de
amplificacin



Muestra de ADN
Existen una serie de reglas sencillas para que el
DNA molde no sea un problema en la reaccin:
Integridad del ADN: no puede estar
fragmentado en trozos ms pequeos de lo que
queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de
extraccin: la muestra no debe llevar agentes
quelantes (EDTA) que reducen la concentracin
de iones de Mg. en la disolucin. Tampoco debe
haber determinados factores sanguneos, fenol,
detergentes... que inhibiran la actividad de la
polimerasa.

Cantidad de la muestra: si se dispone de
suficiente cantidad para la amplificacin
de ADN genmico de copia nica se usan
cantidades de 100-500 ng.
En el caso de zonas repetidas se puede
reducir esta cantidad a 10-50 ng. El
mnimo oscila entre 10-100 ng. y el
mximo entre 400-500 ng.
Diseo de los iniciadores
Para la eleccin de los primers, existen una
serie de normas que nos pueden ayudar,
aunque hay que indicar tambin que existen
programas de ordenador que nos facilitan esta
tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
El contenido en G + C debe ser
aproximadamente del 50%. La relacin mxima
de purinas/pirimidinas ser 60%/40%.
Deben evitarse zonas con largas secuencias de
una sola base.

Diseo de los iniciadores
No seleccionar cebadores que en su extremo 3
tenga una importante estructura secundaria.
Se recomienda que en los extremos las ltimas
bases sean G o C.
Se debe evitar la complementariedad entre la
pareja de iniciadores. Si esta existe entre los
extremos 3existe la posibilidad de que se
formen dmeros de iniciadores.
Diseo de los iniciadores
Normalmente deben tener un tamao de
18-30 pb.
La Temperatura de hibridacin de los
cebadores debe ser similar en ambos y
ser variable en funcin de la secuencia
de los mismos. Generalmente oscila entre
los 45 y 60 C.
Diseo de los iniciadores
Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de
fusin (Tm), se calcula en base a la siguiente
frmula:

Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)

Siendo G, C, T y A el nmero de cada una de
las bases que forman cada uno de los oligos. La
temperatura de hibridacin debe ser
aproximadamente 5 menor que la temperatura
calculada.
DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA
polimerasa que llevan a cabo la
replicacin del ADN, siguiendo el mismo
mtodo de sntesis. Se pueden clasificar
en:
Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se
desnaturalizan con el calor.
Termoestables: T ptima de 74 C.
Resiste durante 40-50a 96C.


DNA Polimerasa
Actualmente la polimerasa que se utiliza
es la Taq polimerasa.
Es una enzima termoestable aislada de
Termus aquaticus (Taq), una bacteria
que soporta altas temperaturas.
La Taq polimerasa ha simplificado
enormemente la tcnica de la PCR, ya
que ha permitido su automatizacin
(desarrollo del termociclador).
DNA Polimerasa
la Taq polimerasa, carecen de actividad
3-> 5 exonucleasa, lo que las hace
menos seguras a la hora de comparar las
fidelidades.
Por ello hay que intentar conseguir las
mejores condiciones para que sta
aumente. Podemos citar:
DNA Polimerasa
No usar un alto nmero de ciclos, ya que la tasa
de error es proporcional al nmero de estos.
Normalmente el nmero de ciclos utilizado es de
25-30.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
La concentracin de Mg++ en la reaccin oscila
entre 0,50 y 2,5 mM. Se trata de un in
necesario, pero su exceso hace que disminuya
la especificidad de la PCR.
Deoxinucletidos trifosfato (dNTPs)
Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las
concentraciones de ambos componentes deben
guardar siempre la misma relacin.
No debemos variar ninguno de ello de manera
independiente. Se aconseja que la
concentracin de Mg++ sea de 0.5 1.0 mM
veces superior a la concentracin de dNTPs.
Sales
Es de gran importancia la concentracin de dos
cationes que son aadidos en forma de sales.
Cloruro potsico (KCl). Influye en la
desnaturalizacin del ADN.
Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la
temperatura de hibridacin del DNA. La
concentracin de este ion resulta fundamental
para la optimizacin de la reaccin.
Cloruro de magnesio
Altas concentraciones de Mg++
disminuyen la especificidad de la reaccin.
Bajas concentraciones de Mg++
aumentan la especificidad de la reaccin


Temperaturas y tiempos de los
ciclos
Como hemos explicado anteriormente la
PCR se realiza en tres etapas que
constituyen un ciclo, que repite durante un
nmero determinado de veces.
El tiempo, la temperatura y el nmero de
ciclos son factores determinantes en los
resultados de la PCR, por lo tanto
modificndolos podemos optimizar la
reaccin.
Temperaturas y tiempos de los
ciclos
Las primeras reacciones se realizaban
manualmente cambiando continuamente los
tubos de un bao Mara a otro de diferente
temperatura (la T de desnaturalizacin, la de
hibridacin y la de elongacin).
El proceso resultaba demasiado tedioso y era
difcil alcanzar las temperaturas y los tiempos
correctos, por lo que se desarroll el
termociclador que lo haca de manera
automtica.

Temperaturas y tiempos de los
ciclos
A continuacin describiremos de forma
ms detallada el tiempo y la temperatura
de cada una de las etapas de un ciclo.

1.- Desnaturalizacin
Se trata de una etapa crtica ya que es
muy importante que el ADN molde se
desnaturalice completamente.
Para lograrlo de manera adecuada se
recomiendan temperaturas de 94C
durante 30 segundos a 1 minuto.
2.- Hibridacin
En este caso, la temperatura y el tiempo van a
depender de 3 factores relacionados con los
oligonucletidos: la composicin de bases, el
tamao y la concentracin.
En la prctica, la temperatura de hibridacin
puede oscilar entre 45C y 65C, durante un
tiempo comprendido entre 30 segundos y 1
minuto.
Un aumento de temperatura o del tiempo
favorece la especificidad ya que disminuye las
uniones incorrectas de los iniciadores con la
hebra molde.
3.- Elongacin
En la mayora de las reacciones, la etapa de
extensin se realiza a 72C. Tericamente esta
temperatura puede variar entre 70-72C. El
tiempo de extensin depende del tamao de la
amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1
minuto para elongar 1 Kb
En la prctica es normal que al final de todos los
ciclos se realice una ltima elongacin de 5a
72C.
Nmero de ciclos
Tambin adquiere gran relevancia a la hora de
optimizar una PCR el nmero de ciclos que se
utilizan. Este nmero depende de la cantidad de
ADN que existe en la muestra una vez que el
resto de factores han sido optimizados
(normalmente de manera emprica).
Es importante no realizar un nmero alto de
ciclos ya que puede dar lugar a la amplificacin
de productos no deseados originados por
hibridaciones no especficas.
Contaminacin en la PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es
una tcnica muy sensible, por lo que es de gran
importancia evitar contaminaciones, ya que es
posible que el ADN no deseado (aunque se
encuentre en una cantidad muy pequea) se
amplifique y obtengamos un resultado que no es
real.
Vemos que una de sus mayores ventajas de la
tcnica, se convierte a la vez en el principal
inconveniente.
Existen una serie de normas que ayudan a
evitar las contaminaciones. En el caso de
trabajar con muestras de ARN las
precauciones se deben extremar al mximo:
1. Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR
2. Uso de instrumental exclusivo para la PCR
3. Utilizacin de reactivos y tubos estriles
4. Uso de guantes por el manipulador
5. Realizacin de controles de blanco (se aade
agua en lugar de ADN, no debe existir
amplificacin).

PCR es bsicamente una tcnica de
amplificacin del DNA.



DNA
(molecule sencilla)
Muchas
moleculas
PCR
amplificacin
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Cortos primers de DNA especficos
hibridizan con la cadena que tiene que ser
copiada

3 5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T
-A T G C A T G C A T G C * *
3 5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T- A
-A T G C A T G C A T G C * *
3 5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T- A- C
-A T G C A T G C A T G C * *
3 5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T- A- C- G
-A T G C A T G C A T G C * *
3
5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T- A- C- G- T
-A T G C A T G C A T G C * *
3
5
Sntesis por DNA polimerasa

T A C G-T- A- C- G- T- A
-A T G C A T G C A T G C * *
3
5
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos
copiada una cadena de DNA

Primer 1
Extensin de la cadena
Cadena original de DNA
Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?
Primero, la fusin separa las dos cadenas
de DNA a alta
temperatura (~100C)
Primero, la fusin separa las dos
cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2
1
Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente,
dado que hay un rexceso de Primer 1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusin
95C
Hibridizacin
50-60C
Extensin de
La cadena
75C
2
do
Ciclo
95C
50 - 60C
75C
Primer Ciclo
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el nmero de copias

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Hay 7 componentes esenciales en el
proceso standard de PCR
ADN polimerasa termoestable
Oligonucleotidos iniciadores (primers)
Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
Cationes divalentes
ADN molde (Templado)


ADN polimerasas termoestables
Llevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del
templado.
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3, ej. Taq agrega una A al exremo 3,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 10
12
moleculas (1.5 unidades)
La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus
furiosus, Tli Thermococcus littoralis


Oligonucletidos iniciadores (primers)

Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la eficiencia y
la especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (10
13
= 30
cycles, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas



ADN molde (templado)
Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble
cadena)
ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
Usualmente se utilizan varios miles de copias,
ej: 1 g de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de
bacteriano o 1 pg of plasmdico
Se puede amplificar a partir de una sola
molcula de ADN molde, pero las condiciones
deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR
Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos si G+C < 55%
Temperatura de hibridizacin (Annealing) debe ser calculada o
determinada empiricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no especfico = productos
incorrectos
Extensin -
a la temperatura ptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud
deseada, los cuales a partir de all se tornan en el producto principal

El ciclo de PCR
Nmero de ciclos -
- algunos componentes se tornan
limitantes despues de 30 ciclos (si
el nmero inicial = 10
5
molculas)
- se necesitan >25 ciclos para
amplificar un gen de copia nica a
partir de ADN genmico de mamfero
DNA

Variantes de la PCR
Touchdown PCR
Colony PCR
Multiplex PCR
Hot start PCR
Nested PCR
Inverse PCR
Long PCR


Multiplex PCR
Describe una PCR en la cual hay presentes
multiples pares de primers (hasta 8) lo que da
una serie de productos. Los mismos pueden
verse como mltiples bandas en un gel de
agarosa
Multiplex PCR es frecuentemente usada en
diagnstico mdico
Ahorra templado, tiempo y gastos
Requiere una cuidadosa optimizacin
Nested PCR
A veces 1 ronda de PCR no da un producto
nico producto a partir de un templado
complejo, apareciendo un chorreado
Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente
que los primeros
Realizar una segunda ronda de PCR usando el
producto de la primera (chorreado)
Rinde un producto nico porque solo el
fragmento correcto de ADN posee los sitios
correctos de hibridizacin para el segundo par
de primers

Mutagnesis por PCR
Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN
El mtodo de extensin solapada requiere 2
primers mutagnicos y otros 2
Amplifica un fragmento 5 y un fragmento 3 que
se solapan. Ambos portan la mutacin
Usa los productos en otra reaccin para
producir el ADN mutado de longitud completa

RT-PCR = PCR con transcriptasa
reversa
Para amplificar copias de cDNA de RNA
Es especialmente til cuando solo se dispone de
pequeas cantidades de RNA
Frecuentemente usada para amplificar genes
especficos si algo de su secuencia es conocida
Requiere primer antisense y un DNA polimerasa
dependendinte de RNA
Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
Luego se usa un segundo primer (sense) para hacer el
duplex de cDNA por PCR

PCR in situ
PCR realizada sobre preparaciones fijas
sobre un portaobjetos.
El PCR in situ consiste en una reaccin de
PCR en secciones histolgicas o clulas,
donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin.
Es realizada sobre preparaciones fijas en
un portaobjetos.
PCR in situ
En la tcnica de in PCR-in situ se realiza
primero amplificacin de ADN blanco y luego
deteccin mediante hibridacin in situ
convencional con sondas ADN/ARN.
De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma viral. Esta tecnologa
es de gran alcance en la capacidad de
amplificar especficamente una poblacin de
menor importancia de secuencias.
PCR tiempo real
Permite cuantificar, la cantidad de ADN o
ARN amplificado en cada momento. Para
la deteccin de la cantidad de ADN
especfico se emplea una sonda unida a
dos fluorocromos que hibrida en la zona
intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse), cuando la
sonda est intacta, presentan una
transferencia energtica de fluorescencia
por resonancia (FRET).
PCR tiempo real
Dicha FRET no se produce cuando la
sonda est daada y los dos fluorocromos
estn distantes, producto de la actividad
5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa.
Esto permite monitorizar el cambio del
patrn de fluorescencia y deducir el nivel
de amplificacin del gen.