El nacimiento de una nueva era

En la década de 1950 se descubrió que los genes no eran nada más y

nada menos que cadenas de nucleótidos. Un descubrimiento que parece
tan sencillo desencadenó, sin embargo, el nacimiento de una nueva era:
la de la tecnología del ADN recombinante.

La primera molécula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a

comienzos de los 70. Para aquella época, los biólogos moleculares habían
aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar pedazos de ADN de
diferentes organismos y moverlos de uno a otro.

Otros pioneros de esta tecnología fueron Stanley Cohen, un genetista

estadounidense, y Herbert Boyer, un bioquímico de la misma
nacionalidad . Cohen estaba interesado en aprender cómo los genes de
plásmidos otorgan resistencia a las bacterias y Boyer trabajaba con
enzimas de restricción (ver apartado 3.3.), por lo que decidieron trabajar
juntos en la combinación de dos plásmidos resistentes a antibióticos
diferentes para crear una bacteria resistente a ambos.

¿Qué es la tecnología del ADN recombinante?

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial

de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN
recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de
un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro
diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal,
vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea
totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas

en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una
proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la
insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes
recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se
multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de
proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada.
A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de
organismos vivos o de sus productos con fines prácticos.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a

varias líneas de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de
restricción, 2) la replicación y reparación de ADN, 3) la replicación de virus
y plásmidos y 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de

restricción

En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de

proteínas -las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que
actúan como "tijeras moleculares", cortando la doble cadena de ADN a
través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de
estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio
origen a la ingeniería genética.
Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de
defensa contra virus y degradan el ADN extraño.

A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus

enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el
agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de
ciertos nucleótidos.

Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que

producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda
de un "pegamento molecular": la enzima ligasa).

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos.

Los extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos
hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple
cadena complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son
generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar,
generando dos extremos doble cadena.

Figura 1. Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos

tipos de extremos. En el primer caso, el corte genera nucléotidos de simple
cadena llamados extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por
medio de otra enzima, la ADN ligasa. En el segundo caso, se generan
extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos también pueden
ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los extremos no
son complementarios, la unión será más inespecífica.

Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier

organismo en pequeños fragmentos llamados fragmentos de
restricción. La colección de miles o millones de estos fragmentos se
llama biblioteca génica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante
usando enzimas de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo
producir grandes cantidades de genes y cómo introducirlos en bacterias
u otras células huésped. El primer problema fue solucionado con el uso
de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas
bacterias.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y

son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de
iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN
genómico.

Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido.

Este proceso consta de las siguientes etapas:
 1. Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción,
para generar extremos cohesivos.
2. Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos
de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean
complementarios y puedan unirse.
3. Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la
enzima ADN-ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en
bacterias.
4. Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con
la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen
de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese
antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la
resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan
morirán.

Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias

del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una
sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a
la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación. El término clon
proviene de la jardinería; desde hace siglos los jardineros generan plantas
nuevas a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente idénticas y
constituyen un clon.

Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente

idénticas.

El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en

la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material genético de
un organismo a otro.

Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un

organismo a otro

¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa

Durante las décadas de 1970-1980, la manera más práctica de hacer

múltiples copias de una secuencia particular de ADN era introduciendo
una molécula de ADN recombinante (un plásmido más un gen) en una
célula huésped. Esto podía resultar un poco engorroso, ya que muchas
veces se disponía de una cantidad muy pequeña de moléculas de ADN
para realizar pruebas.

A mediados de la década de los 80, la invención de una técnica capaz de

generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad
de clonarla en ningún tipo de vector resolvió este problema. Kary Mullis,
un bioquímico americano que trabajaba sintetizando ADN, resolvió este
problema con la invención de la reacción en cadena de la polimerasa.

Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión

de pequeños fragmentos (denominados primers) y la extensión de estos
fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos
copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. Para llevar
a cabo esta reacción se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz
de soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalización. Esta
enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria
termófila (la Thermus aquaticus), resistente a altas temperaturas.
La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de
manera espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una molécula
para que la reacción genere una infinidad de copias. Esto la convierte en
una importante, si no imprescindible, herramienta para el análisis de
filiación o de criminalística forense, ya que con sólo una pequeñísima
muestra se pueden realizar diferentes estudios comparativos que nos
permiten conocer el dueño de un "rastro" genético en particular.

También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico

médico, como la detección de virus o de mutaciones que provocan
enfermedades genéticas, a partir de una muestra de ADN tan pequeña
como un cabello o una gota de sangre.

Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es

la transcripción inversa de ARNm. Mediante el uso de una enzima de
origen viral denominada transcriptasa reversa puede usarse como molde
una molécula de ARNm, transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser
amplificada como cualquier otra secuencia por la reacción en cadena de
la polimerasa, con lo que se obtiene una gran cantidad de ADN a partir
de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy empleada para
el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas
en diferentes organismos.

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y

anticuerpos

Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como

encontrar una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea,
probablemente usaríamos un imán para atraer la aguja (siempre y cuando
esta sea de metal y posea propiedades magnéticas). De manera análoga,
hoy día podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente,
sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares.

Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena

complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar.
Contienen alguna "marca" que permite revelar su unión (hibridación) a la
secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada.

¿Cómo se marcan esas sondas o fragmentos de ácidos

nucleicos? Las sondas pueden ser "coloreadas" durante su síntesis
utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. Otra manera de
marcarlas es mediante la unión con una molécula que pueda ser
detectada posteriormente como fluorescente, un marcador químico que
puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad
produce el cambio de color de su sustrato.

Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos

determinados del genoma (o la expresión de algún gen en particular por
medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es
la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una
sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y
marcada radiactiva o químicamente.

La sonda "navega" por el interior de la célula hasta encontrar una

secuencia complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formará una
doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de esta
secuencia, sino indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula.
Si se tratara de un fragmento de un cromosoma, nos permitiría saber su
localización exacta o locus.

Para revelar la presencia de hibridación de la sonda, la muestra debe

exponerse a una placa radiográfica; en el caso de las sondas marcadas
químicamente se procede a su revelado mediante el uso de moléculas
fluorescentes o que puedan ser detectadas por colorimetría (utilizando
una enzima que provoque el cambio de color de un sustrato).

Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante

con una técnica similar, pero que usa anticuerpos en vez de sondas. Se
comienza por una colonia de bacterias que contengan y expresen el gen
de ADNc. Luego se trata las bacterias con un anticuerpo marcado, que se
unirá a la colonia que sintetice la proteína deseada. De esta manera se
puede localizar el gen en cuestión y clonarlo para obtener múltiples
copias.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Si visitamos un laboratorio de biología molecular, probablemente

encontraremos una cuba con un gel al cual se le aplica una corriente
eléctrica. Este método, llamado electroforesis en gel, es muy usado
para separar moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas
que describiremos para identificar ADN, ARN, y proteínas. En los párrafos
siguientes describiremos entonces la electroforesis para poder
comprender luego cómo funcionan las demás técnicas.

Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los

laboratorios para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su
tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las
moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga
eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas
negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva.
Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o
poliacrilamida.

La velocidad de desplazamiento de las moléculas es inversamente

proporcional a su tamaño. En los ácidos nucleicos la carga está dada por
los nucleótidos, por lo que el tiempo que tardará la molécula en atravesar
el gel será directamente proporcional al número de nucleótidos que tenga,
es decir a su tamaño. De esta manera, para un tiempo determinado, las
moléculas más grandes quedarán más retrasadas en el gel que las
moléculas más pequeñas.

La separación de proteínas es un poco mas complicada, ya que éstas

poseen una estructura tridimensional compleja y compacta, además de
una carga neta que depende de la identidad de los aminoácidos que la
componen. Esto hace más difícil separarlas sólo por su tamaño y por eso
se emplea una versión modificada conocida como electroforesis en gel
de poliacrilamida. Las proteínas forman bandas de acuerdo con su
tamaño; si se corre una muestra con proteínas de tamaño conocido se
puede determinar el tamaño de la proteína estudiada por la distancia
recorrida en el gel. Las proteínas más grandes quedarán arriba y las más
chicas quedan abajo (y las de tamaño medio quedarán entre las demás).
Además, el grosor de la banda obtenida dependerá de la cantidad de
proteína que se haya sembrado; cuanto mayor sea la cantidad de
proteínas, más gruesa será la banda.

Figura 1. Electroforesis en gel. Se siembra la muestra (ADN, ARN o

proteínas) en un gel que es sometido a una corriente eléctrica. Las
moléculas se mueven a través del gel impulsadas por dicha corriente. Esta
técnica permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya
que las más pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven con mayor
velocidad. El gráfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes
a distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern,

Northern y
Western Blot

Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por

electroforesis como primer paso para identificar la presencia de
determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue
inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN.
Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o
blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado.
Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo
denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre del científico
inventor de la técnica basada en ADN).

Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de

transferencia y emplean secuencias específicas (sondas)
complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir,
ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las
moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay
diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se
degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar
muchas más precauciones.

Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida

electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de
manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren
los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que
quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con
sondas específicas para detectar la presencia de determinadas
secuencias.

Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta
la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para
estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite
detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos
visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes
que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar
el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes
genes.

Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el

Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas
mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que la muestra
con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la
transfiere a una membrana especial donde las proteínas quedan
"ancladas" o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el
anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta
técnica pueden obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y
su concentración en la muestra sembrada.

¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos

Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es

la de microarreglos (Microarrays), que consta de una membrana dividida
en celdillas que poseen adheridas sondas que representan un gen en
particular. En conjunto, estas celdillas contienen todos los genes
conocidos de un organismo. De esta manera, cuando se coloca una
muestra en estos chips se irá hibridando cada gen que se encuentre en la
muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando
una celdilla da positivo, quiere decir que ese gen determinado está
presente en la muestra.

Los ensayos con microarreglos son rápidos de realizar, pero muy

engorrosos de analizar. Además, están muy limitados a los genes que ya
se conocen. Permiten obtener un pantallazo rápido sobre qué está
pasando en la célula en ese momento determinado, en cuanto a qué
genes están encendidos y cuáles apagados. Sin embargo, los resultados
obtenidos nunca deberían ser concluyentes, sino que tendrían que ser
validados mediante otras técnicas (por ejemplo, Northern Blot).

Microarreglos: esta técnica permite analizar simultáneamente miles de

genes.