UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE INGENIERÍAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Asignatura : Biotecnología
Docente : Óscar Julián Sánchez Toro
Tema : Cinética Enzimática Básica y Biorreactores Enzimáticos

1. Con el objetivo de medir la actividad enzimática y la velocidad inicial de reacción, 5

mL de una solución de celobiosa con una concentración de 100 μmol/mL y 44 mL de
solución buffer o amortiguadora se mezclaron en un matraz agitado. La reacción se
inició adicionando 1 mL de solución de β-glucosidasa, la cual contiene 0,1 mg de
proteína por mL. A los 1, 5, 10, 15 y 30 min se tomaron muestras de 0,1 mL de
mezcla reaccionante y se midió su contenido en glucosa. Los resultados se muestran
en la Tabla 1.
a. ¿Cuál es la actividad específica de la β-glucosidasa en unidades/mL de solución
de enzima y en unidades/mg de proteína? En este caso, se define unidad como la
cantidad de enzima que produce 1 μmol de glucosa en un minuto.
b. ¿Cuál es la velocidad inicial de la reacción?
c. ¿Cuál es la estructura química de la celobiosa? ¿Qué se entiende por solución
buffer y cuál es su importancia en la determinación de la actividad enzimática?

Tabla 1.
Tiempo, min Concentración de Glucosa, μmol/mL
1 0,05
5 0,23
10 0,38
15 0,52
30 1,03

2. Se requiere procesar 20 ton de harina de maíz (maizena) como materia prima para la
producción de jarabe de glucosa. La harina contiene 91,3% (w/w) de almidón. Dos
proveedores de glucoamilasa comercial ofrecen sendos preparados enzimáticos para
este proceso. El proveedor A suministra el preparado AMG® 300 de Novozymes a un
precio de $750.000 el litro; en la ficha técnica de este preparado se indica que su
actividad enzimática es de 300 GAU/mL. Por su parte, el proveedor B comercializa el
preparado OPTIDEX® L-400 de Genencor a un precio de $850.000 el kilogramo; la
actividad enzimática de este segundo preparado es de 350 GAU/g de acuerdo con su
ficha técnica. En el laboratorio de la empresa procesadora de harina de maíz se
realizaron ensayos con cada uno de los dos preparados, arrojando los datos de la
Tabla 2; para ello, se incubaron 100 mL de una solución de 4% de almidón de Lintner
con 1 mL del preparado enzimático y se midió la concentración de glucosa formada
al minuto de reacción en condiciones estándar para esta enzima (pH de 4,5 y
temperatura de 60ºC). Se definió una unidad de actividad glucoamilasa (U) como la
cantidad de enzima que en una solución al 4% de almidón de Lintner forma 1 µmol

1
 de glucosa en 1 minuto bajo condiciones estándar. Por su parte, los fabricantes de
los preparados enzimáticos emplearon la unidad GAU como medida de la actividad
enzimática; una unidad GAU es la cantidad de glucoamilasa que libera 1 g de
azúcares reductores (como glucosa) a partir de una solución de almidón soluble por
hora en las condiciones especificadas en cada ensayo. Según la literatura científica,
la dosis más adecuada para convertir el almidón de maíz en glucosa empleando
glucoamilasa es de 22 U/g de almidón; en contraste, el rango de las dosis de
preparado enzimático de glucoamilasa recomendado por los fabricantes es de 0,36 a
1 kg (de 0,29 a 0,88 L) por tonelada de almidón a procesar (en base seca). Compare
las actividades enzimáticas específicas de cada preparado en U/mL y U/mg
obtenidas en el laboratorio con las indicadas por los proveedores. ¿Cuál preparado
enzimático recomendaría usted?

Tabla 2.
Preparado Concentración de Contenido de proteína en Densidad del
enzimático glucosa, el preparado, preparado,
mol/L mg/mL g/L
AMG 300® 0,25 0,40 1140
OPTIDEX L-400® 0,31 0,30 1160

3. Una reacción enzimática presenta la cinética relacionada en la Tabla 3.

a. Determine Vmáx y KM.
b. ¿Cuál es el valor de la velocidad de la reacción enzimática si la concentración
inicial de sustrato es igual a la constante de Michaelis?
c. ¿Cuánto tiempo demandará la transformación del sustrato en un 35% si la
concentración inicial del mismo es de 3 mmol/L?

4. En la Tabla 4 se relacionan las velocidades iniciales de una reacción catalizada por

una enzima a diferentes concentraciones iniciales de sustrato.
a. Determine Vmáx y KM por el método de Lineweaver-Burk
b. Determine estos parámetros cinéticos por el método de Eadie-Hofstee.
c. Determine estos mismos parámetros por el método de Langmuir.
d. Calcule los coeficientes de regresión y de determinación en cada caso, así como
las covarianzas para cada método. Saque sus propias conclusiones.

5. Una enzima con un KM = 0,001 M se incubó con un sustrato a una concentración

inicial del mismo de 3.10-5 M. A los 2 min reaccionó el 5% del sustrato.
a. ¿Qué tiempo requiere la transformación del 15% del sustrato?
b. Hallar los perfiles de sustrato y producto con respecto al tiempo para esta
reacción enzimática, si se supone que por cada mol de sustrato transformada
se forma 0,75 mol de producto.
c. ¿Qué cantidad de sustrato será transformado a los 10, 30 y 60 min?
d. Mostrar las gráficas de grado de transformación y de rendimiento en función
del tiempo de reacción.

2
 Tabla 3. Tabla 4.
S0, mmol/L V0, mmol/(L.min) S0, mmol/L V0, mol/(L.min) × 106
0,20 0,034 4,100 177
0,29 0,051 0,950 173
0,50 0,067 0,520 125
1,00 0,100 0,103 106
2,50 0,133 0,049 80
1,06×10-2 67
5,1×10-3 43

6. De una serie de ensayos en diferentes lotes o “corridas” experimentales con una

concentración constante de enzima, se obtuvieron los datos de velocidad de la
reacción enzimática como función de la concentración inicial de sustrato que se
ilustran en la Tabla 5.
a. Evalúe los parámetros cinéticos del modelo de Michaelis-Menten empleando los
métodos de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Langmuir y por regresión no lineal.
En la determinación de los parámetros no tome en cuenta los puntos que se
desvían sistemáticamente del modelo de Michaelis-Menten y explique la razón
de esta desviación.
b. Compare las predicciones de cada método graficando las curvas de V0 vs. S0,
además de los datos experimentales y analice las ventajas y desventajas de
cada método teniendo en cuenta los coeficientes de determinación y las
covarianzas. Mostrar las curvas en una sola gráfica e indicar los datos
experimentales sin unirlos con ninguna curva.
c. Repita la parte (a) usando todos los datos. Compare los valores de los
parámetros obtenidos por cada método. Analice los resultados obtenidos.

7. Un carbohidrato se descompone en presencia de una hidrolasa. Los parámetros de

la cinética de Michaelis-Menten que se determinaron fueron los siguientes: KM = 200
mol/m3 y Vmáx = 100 mol/(m3.min).
a. Genere la curva que muestre el cambio de la concentración de sustrato con el
tiempo en un reactor por lotes si la concentración inicial del carbohidrato es de
300 mol/m3. Muestre también, mediante una curva, cómo varía el grado de
hidrólisis con respecto al tiempo en el mismo reactor.
b. Se llevaron a cabo varios ensayos en un quimioestato (reactor continuo de
tanque agitado). Si la concentración del sustrato en la alimentación es de 300
mol/m3 y el caudal es de 100 cm3/min, ¿cuál es la concentración de sustrato en
el efluente si se supone estado estacionario? El volumen del reactor es de 300
cm3. Asuma que la concentración de la enzima en el reactor es constante, de tal
manera que se puedan utilizar los mismos parámetros cinéticos. ¿Cuál es el
grado de hidrólisis en este caso?

3
 Tabla 5.
S0, mmol/L V0, mmol/(L.min)
1 0,20
2 0,22
3 0,30
5 0,45
7 0,41
10 0,50
15 0,40
25 0,33

8. La fumarasa cataliza la producción de ácido málico a partir de ácido fumárico;

muestre esta reacción con las estructuras químicas respectivas. Diferentes datos
experimentales muestran que la reacción transcurre hasta el producto en un 94%.
Se implementó un proceso por lotes en un reactor de tanque agitado. La
concentración inicial de ácido fumárico fue de 0,8 M. Si la constante de Michaelis es
de 0,025 M y la velocidad máxima es de 0,3 mol/(L.h), hallar:
a. El tiempo necesario para que se transforme el 78% del sustrato.
b. La concentración de ácido málico y el grado de transformación a las 4 h de
reacción.
c. La curva de producto y del grado de transformación (conversión) en función del
tiempo de reacción.
d. La cantidad de lotes de producción de ácido málico que se pueden realizar en un
año, seleccionando un tiempo de reacción adecuado para este proceso
enzimático; asumir que el tiempo de preparación del reactor en cada lote de
producción es de 24 h.
e. La cantidad anual en kilogramos de ácido málico que se puede producir en un
biorreactor enzimático por lotes que tiene 10 m3 de capacidad, considerando
que las pérdidas en las etapas de separación y purificación son del 1,2%;
emplear el tiempo de reacción seleccionado en el literal anterior.

9. En un reactor de tanque agitado continuo de 0,5 m3 que opera en estado

estacionario, se lleva a cabo la hidrólisis de celobiosa bajo la acción de la enzima β-
glucosidasa. El tanque está construido de tal forma que la enzima no abandona el
reactor durante su operación. La velocidad de la reacción enzimática se puede
describir de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten. El reactor debe garantizar una
conversión del sustrato del 88%. Si el reactor se alimenta con una solución que
contiene 25% (p/v) de sustrato, calcular:
a. El caudal de alimentación necesario para la conversión indicada y la
concentración de producto en el efluente.
b. El caudal de alimentación y la concentración del producto en el efluente para la
conversión indicada si la velocidad de la reacción enzimática se describiera por
una ecuación de primer orden con respecto al sustrato con una constante de
velocidad k.
c. ¿Cuál cinética es más favorable para el proceso comparando los literales a y b?

4
 d. La concentración de producto en el efluente si la reacción transcurriera en un
87% hasta el producto considerando una cinética de Michaelis-Menten.
Datos necesarios: Vmáx = 23 g/(L×h), KM = 2 g/L, k = 1,2 h-1.

10. La velocidad de una reacción enzimática para la síntesis de un compuesto

biológicamente activo se puede describir de acuerdo con la siguiente ley de
segundo orden:

v = k S2

Si la constante de velocidad de la reacción tiene un valor de 0,03 L/(mmol.min) y si

la concentración inicial del sustrato es de 5 mmol/L, hallar el grado de
transformación que se alcanza en un biorreactor enzimático que trabaja por lotes a
los 30 min de reacción. Construir la curva que muestre la dependencia de la
concentración de sustrato en función del tiempo.

11. La hidrólisis de celulosa empleando un complejo celulolítico da lugar a la liberación

de glucosa. Se asume que la cinética global de este proceso se puede describir por
la siguiente expresión:

v = k 5 S3

La constante cinética k tiene un valor de 0,1 g2/5×L-2/5×min-1. Durante un proceso por

lotes se agregó el complejo celulolítico a una solución al 10% (p/v) de celulosa. Si la
reacción transcurre en un 87%, calcular:
a. La concentración de glucosa a los 120 minutos.
b. La conversión de sustrato a la hora de reacción si se disminuye en un 75% el
valor de la constante cinética.

12. La cinética de hidrólisis del polímero xilano con la enzima β-xilosidasa se puede
describir con un modelo basado en la siguiente ecuación:

Vmáx S
v=
S
KM + S +
Ki

El producto de la reacción enzimática es la xilosa, un azúcar de cinco carbonos.

Según las diferentes mediciones realizadas durante este proceso de degradación
enzimática, por cada 100 g de xilano hidrolizado se forman 111 g de xilosa. Si se
desea obtener un grado de hidrólisis del 85% a partir de una solución que contiene
15% (p/v) de xilano, y si se dispone de un reactor enzimático de 3.000 L que puede
trabajar tanto en régimen por lotes como en forma continua en una planta de
producción que opera 330 días al año, calcular:

5
 a. El tiempo requerido de la reacción enzimática en un proceso por lotes y la
cantidad de producto obtenido durante un año; la duración de un lote es un 35%
mayor que el tiempo requerido de la reacción enzimática en un proceso por lotes
debido a la necesidad de preparar los reactores para el siguiente lote.
b. El tiempo de residencia requerido para el proceso continuo en el biorreactor y la
cantidad de producto obtenido durante un año.
Datos necesarios: KM = 2 g/L, Ki = 1 L1/2/g1/2, Vmáx = 1,8 g/(L×h).

13. La invertasa cataliza la reacción de hidrólisis de la sacarosa en azúcar invertido. La

estequiometría de la reacción muestra que por cada mol de sacarosa hidrolizada se
forma 0,94 moles de glucosa, 0,94 moles de fructosa y una mínima cantidad de
productos secundarios. Sin embargo, la invertasa es inhibida por el mismo sustrato.
De esta manera, la expresión de la velocidad para la reacción de hidrólisis
enzimática de la sacarosa es:

V máx S
v=
 S 
S 1 +  + K M
 K i 

En un reactor agitado por lotes se lleva a cabo la inversión de la sacarosa con

invertasa para obtener glucosa como producto principal. La concentración inicial de
sacarosa es de 10% (p/v). Si la constante de Michaelis es de 0,015 M, la
constante de inhibición (Ki) es de 0,2 M y la velocidad máxima es de 0,1 mol/(L.h),
hallar:
a. La expresión que indique la dependencia de la concentración de sacarosa en
función del tiempo de hidrólisis.
b. El grado de hidrólisis (en %), la concentración de glucosa (en mol/L) y el
rendimiento (en g glucosa/g sacarosa) para un tiempo de hidrólisis de 246 min.
c. Demostrar gráficamente que cuando existe inhibición por sustrato, la velocidad
máxima no se alcanza. ¿A partir de qué concentración de sustrato se observa el
efecto de la inhibición? ¿Qué pasa con la velocidad de la reacción enzimática si
la constante de inhibición aumenta o disminuye?
d. La curva de formación de glucosa (o fructosa) con el tiempo; con base en esta
curva, seleccionar un tiempo de reacción adecuado para este proceso.
e. Si se requiere producir 10 ton de azúcar invertido en un año, estimar el volumen
de un biorreactor enzimático cilíndrico para realizar este proceso (estos
biorreactores tienen generalmente una relación altura/diámetro de 2,5).
Considerar el tiempo de reacción seleccionado en el literal anterior y que las
pérdidas en la etapa posterior a la reacción enzimática para la obtención de la
forma comercial del azúcar invertido son del 0,25%.

6
14. Un sustrato se convierte en producto bajo la acción catalítica de una enzima.
Asumiendo que los parámetros de la cinética de Michaelis-Menten para esta
reacción enzimática son KM = 0,03 mol/L y Vmáx = 13 mol/(L.min), determinar el
volumen de un reactor continuo de tanque agitado (CSTR, por sus siglas en inglés)
que opere en estado estacionario para convertir el 95% del sustrato que entra en la
corriente de alimentación, cuyo caudal es de 10 L/h. La concentración del sustrato
en la alimentación es 10 mol/L. La enzima no abandona el biorreactor debido a la
ubicación de una membrana que retiene las proteínas en la tubería de salida del
mismo.

15. Usted llevó a cabo una reacción enzimática en un reactor CSTR de 5 L. La

concentración de sustrato en la alimentación fue de 100 mmol/L y el caudal se
ajustó a 1 L/h. Después que se alcanzó el estado estacionario, la concentración de
sustrato en el efluente fue de 10 mmol/L. La enzima no abandona el biorreactor
debido a la ubicación de una membrana que retiene las proteínas en la tubería de
salida del mismo.
a. ¿Cuál es la velocidad de la reacción enzimática dentro del reactor?
b. Usted midió la concentración en estado estacionario del sustrato en el efluente
como una función del caudal de alimentación y encontró los resultados que se
consignan en la Tabla 6. Estime los parámetros cinéticos del modelo de
Michaelis-Menten usando el mejor método de linealización que tenga en cuenta
el peso de todos los puntos.

Tabla 6.
Caudal, L/h Concentración de Sustrato
en el Efluente, mmol/L
0,70 4,0
0,80 7,0
1,00 10,0
1,16 14,0