UNMSM-FFYB LABORATORIO DE BIOQUIMICA-I

2021-0

Práctica N°4

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS

Km y Vmax DE LA FOSFATASA ALCALINA
INTESTINAL
I.- INTRODUCCION
Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Al igual
que los catalizadores inorgánicos, las enzimas aumentan la velocidad con que se alcanza
el equilibrio de la reacción. El mecanismo que permite que las enzimas incrementen la
velocidad de la reacción es la reducción de la energía libre de activación requerida para
transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de
equilibrio.

A y B = Sustratos
C y D = Productos
v1 = Velocidad de la reacción para formar los productos
v2 = Velocidad de la reacción para formar los sustratos
Keq = Constante de equilibrio
[ ] = Concentración molar.
A continuación se presenta un resumen de las características que distinguen a una
enzima:
1. Es una proteína.
2. Resulta muy específica para el sustrato.
3. Incrementa la velocidad de la reacción.
4. No modifica la constante de equilibrio (Keq).

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5. Se modifica de manera temporal, pero esta modificación no persiste al final de la

reacción, ni forma parte de los productos.
6. Requiere condiciones óptimas para la catálisis.
7. La actividad de una enzima se evalúa de acuerdo con la velocidad de la reacción.
La cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción enzimática, los factores que la
modifican y el mecanismo de la reacción. Los factores fisicoquímicos que modifican la
actividad de la enzima, son:
1. Concentración del sustrato.
2. Concentración de la enzima.
3. pH.
4. Temperatura.
5. Fuerza iónica.
6. Inhibidores.
La velocidad de la reacción enzimática se define como la variación en el tiempo de la
concentración del sustrato, siendo proporcional a dicha concentración. De manera que al
aumentar la concentración del sustrato llega un momento en que este satura a la enzima
y la velocidad de la reacción se hace constante. En este momento se dice que la reacción
ha alcanzado la velocidad máxima y que la enzima está saturada por el sustrato (Figura
1).

Donde Km es la constante de Michaelis-Menden, esta constante indica la afinidad por el

sustrato, cuanto más pequeña mayor es la afinidad.

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Figura 1. Curva de Michaelis-Menten

- Relación entre la concentración del sustrato y la velocidad de la reacción,

consideramos una cubeta de reacción donde se han añadido todos los componentes de
una reacción enzimática, a excepción del sustrato, y donde el pH y la temperatura son
óptimos. Al añadir cantidades progresivamente mayores de sustrato, se observa que la
velocidad inicial de la reacción aumenta hasta un valor máximo que corresponde a la
velocidad máxima, este valor se alcanza cuando la enzima se ha saturado de sustrato, es
decir cuando la cantidad de sustrato supera la de enzima y los sitios catalíticos de todas
las moléculas enzimáticas están ocupadas por moléculas de sustrato.
- La ecuación de Michaelis-Menten, se basa en tres suposiciones, la primera, el
complejo ES se encuentra en estado estacionario; la segunda suposición, bajo
condiciones de saturación, toda la enzima interviene en la formación del complejo ES.
En realidad, en la etapa de máxima formación de producto, el valor de [E] es muy bajo.
La tercera suposición, cuando toda la enzima se encuentra en forma de complejo ES, la
velocidad de la reacción (es decir, la formación del producto) es la máxima posible.
- En cinética enzimática, al igual que en cinética química, la velocidad de las reacciones
se expresa en función de la variación de la concentración del sustrato.

II. Objetivos:
- Determinar el Km y Vmax de la fosfatasa alcalina intestinal.

III. Parte Experimental: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad

de reacción de la fosfatasa alcalina.

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1. Numerar los tubos de ensayo correspondiente a 9 ensayos con sus respectivos

blancos, agregar los reactivos en el orden que se indica a continuación:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Glicerofosfato 0.025 M pH 8.6 (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Buffer pH 8.6 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

2. Inmediatamente después de añadir la enzima, agregar 1 ml de ATC al 10 % a los

tubos blanco. Centrifugar a 10 000 rpm por 5 minutos. Separar el sobrenadante y
guardar.
3. Incubar en baño maría a 37 °C por 20 min.
4. Terminado el tiempo agregar a cada uno de los tubos 1 ml de ATC al 10%.
5. Centrifugar los tubos, separar los sobrenadantes de cada uno de los tubos
incluido el blanco y determinar el contenido de fosfato liberado como se indica a
continuación:

Reactivos Volumen
Sobrenadante (mL) 1.0
Solución Molibdato de amonio (mL) 0.5
Ácido amino naftol sulfónico (mL) 0.25
Agua destilada (mL) 3.25

6. Agitar bien y dejar en la oscuridad por 10 minutos. Leer al Espectrofotómetro a

660 nm.

1. Calcular: La velocidad de las reacciones en µmoles fósforo/min y los parámetros

cinéticos Km y Vmax.
- Para calcular los parámetros cinéticos debemos calcular las velocidades instantáneas y
las concentraciones de sustrato que originaron dichas velocidades en los 9 ensayos
realizados.
A) Velocidades de Reacción.-
Las velocidades se expresan como µmoles de fosfato liberado por minuto:

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1. Corregir las absorbancias de los ensayos restando las absorbancias de sus

respectivos blancos.
2. Determinar los mg de fosforo contenidos en el ensayo colorimétrico, utilizando
la curva de calibrado de Fosfato: y= 0.052x +0.0243 (mg/L)
3. Si se determina 0.01 mg de fósforo en el ensayo colorimétrico:
0,01 mg de P ---- 1 ml sobrenadante
X -------- 2 ml sobrenadante
X = 0.02 mg
4. Hallamos las moles de fósforo:
mol Fosforo = 0.02 mg de P * 1 mol/98 g * 1 g/1000 mg = 0.204

Hallamos V= µmoles/min = 0.204 µmoles/20 = 0.0102

V= 0.0102 µmoles/min

B) Concentración de sustrato (βglicerofosfato de sodio)

- Debemos calcular la concentración de sustrato en cada una de las 6 mezclas
enzimáticas preparadas.
Ejemplo:
- La concentración del β-glicerofosfato de sodio fue 25 mM, si una primera reacción
contenía 0.2 ml, cuál será la concentración de sustrato en la mezcla enzimática?
Sabiendo que el volumen final de las mezclas enzimáticas fue de 1 ml:
C1 * V = C2* V2
25 mM * 0.2 ml= C2 * 1 ml
C2= 5 mM
- Finalmente graficar en papel milimetrado o Microsoft Excel V vs C y 1/V vs 1/C y
hallar el km y Vmax de la gráfica.

mL Glicerofosfato
0.025 M Absorbancia (nm)
0.1 0.1
0.2 0.18
0.3 0.24
0.4 0.31
0.5 0.34

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0.6 0.41
0.7 0.46
0.8 0.51
0.9 0.62

Ejercicios
1. Una fosfatasa actuando sobre glicerofosfato, es capaz de liberar fosfato
inorgánico -determinado por el método de Fiske- con los resultados que figuran
en la tabla anexa. Calcular gráficamente km y Vmax en las condiciones del
experimento.
[Glicerofosfato] Fosfato Liberado en 10 min
(mM) (µmoles)
1 0.09
2 0.17
5 0.33
10 0.50
20 0.67
50 0.83
100 0.91
200 0.95

2. Cuantas moles de p-nitrofenil-B-D glucósido son transformados en 1 segundo

por 1 mol de enzima glucosidasa (actividad molar o número de recambio) si una
mezcla de reacción (2 mL de volumen final) contenía 15 µg de enzima muestra
un cambio de absorbancia de 0.95 en 4 minutos a 410 nm? El coeficiente de
extinción molar de p-nitrofenol es ε410= 1.75 x 104 M-1 cm-1. La masa
molecular de la glucosidasa es 350000Da.
3.- La actividad de la enzima lactato deshidrogenasa es medida usando un
espectrofotómetro. El ensayo de 6 mL contiene 0.3 mL de solución stock de
LDH, el cual tiene una concentración de 3 µM, y la cantidad adecuada de otros
sustratos. La disminución en la cantidad de un sustrato es medida a 340 nm
durante la reacción. El cambio de absorbancia es 0.9 en 6 minutos. El coeficiente
de extinción molar del sustrato es 6x103 M-1 cm-1. La masa molecular de la
enzima es 105 Da.
a. Cuál es la actividad específica de LDH, expresada en µmol sustrato /mg
enzima/min?
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b. ¿Cuál es el número de recambio de la enzima (kcat) expresada en s-1? La enzima

es tetramérica.

Bibliografía
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