1.

En una cinética enzimática se obtiene los siguientes datos de velocidad de reacción al probar
diferentes concentraciones de sustrato. Determine la Vmax y la Km matemáticamente para la enzima
en cuestión.
Vo
400
[S](1) Vo
2 139 350
3 179
4 213 300
10 313
250
15 370
(2)
200

150
max = 185
100

50
(3)
0
0 2 4 6 [S] 8 10 12 14 16

3.8 = Km

Hemos dicho que la Km y la Vmax se pueden determinar a “ojo” para ello primero debemos construir
la gráfica correspondiente con los “datos directos”, a continuación; definimos en la grafica el valor de
máxima velocidad alcanzada (1), para el caso el valor de velocidad máxima (Vmax) es 370 (En el
ejercicio no se señalan unidades ni de velocidad ni de concentración de sustrato).

Para determinar la Km también dijimos que la podemos determinar dividiendo el valor de la Vmax
entre dos (1/2 Vmax), 370/2 = 185 ubicar el valor obtenido en el eje de Vo de gráfica, ubicar donde
cruza este valor en la línea de la gráfica (2) e interpolar este punto hacia el eje de [S], definir el valor
del punto donde interpola y ese será el valor de Km (3), en mi apreciación, aquí el valor de Km será
aproximadamente de 3.7

Entonces de manera aproximada, esta enzima en las condiciones de reacción tiene un valor de Vmax =
370 (unidades de masa / unidad de tiempo)y una Km = 3.7 (unidades de sustrato).

Pero los resultados son aproximados y se requieren datos lo más exacto posible, para ello la gráfica se
puede linealizar, esto se logra graficando los inversos de concentración de sustrato (1/[S]) contra los
inversos de velocidad (1/Vo). Entonces lo primero a hacer es determinar los inversos de los datos.

1/[S] 1/Vo
0.5000 0.0072
0.3333 0.0056
0.2500 0.0047
0.1000 0.0032
0.0667 0.0027
Ahora se construye la gráfica de los inversos y se determina la ecuación de la recta.
 0.0080
1/Vo
0.0070

0.0060

0.0050

0.0040

0.0030

0.0020

0.0010

0.0000
0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 1/[S]
0.6000

La ecuación que describe la recta es Y = 0.0103X + 0.0021

Vmax [X]
Debemos recordar que la ecuación Michaelis-Menten es: Vo =
Km + [X]
Sí a esta ecuación le sacamos los inversos obtenemos
1 Km 1 1
la ecuación de Lineweaver – Burk: = +
Vo Vmax [X] Vmax

Que es la ecuación de la recta: Y = m X + B

Y que para nuestra gráfica tenemos Y = 0.0103X + 0.0021

Usando la notación de la ecuación de Lineweaver-Burk tenemos: 1/Vo = (0.0103) (1/[X]) + 0.0021

Entonces 1/Vmax es igual a la ordenada al origen B y esta tiene un valor de 0.0021

Esto es: 1/Vmax = 0.0021 Si despejamos Vmax y resolvemos: Vmax = 1/0.0021 = 476.19

Ahora sí: Km/Vmax es igual a la pendiente de la recta m y esta tiene un valor = 0.0103
Esto es: Km/Vmax = 0.0103 Sí despejamos Km entonces: Km = (0.0103) (Vmax)
Pero Vmax = 476.19 sustituyendo en la ecuación previa: Km = (0.0103) ( 476.19) = 4.9

Por este método analítico los valores de Km = 4.9 y Vmax = 476.19

Como se observa los valores a “ojo” son diferentes a los resultados analíticos y estos últimos son mas
exactos, por lo que el cálculo de Km y de Vmax se deberán hacer de modo analítico

Para no errar debemos saber determinar la ecuación en la calculadora y saber claramente cual valor es
la ordenada al origen y cuál es la pendiente.

EJERCICIO 2.
 En un ensayo enzimático en condiciones dadas se obtienen los siguientes datos de velocidad para tales
concentraciones de sustrato. Determina Km y Vmax por el método analítico.

[S]mmol/L Vo sin
RECUERDA:
inhibidor
1 Obtener los inversos de los datos.
3.0 2 Construir
10.4la gráfica correspondiente.
5.0 3 Obtener 14.4
la ecuación de la recta.
10.0 4 Determinar
22.5 el valor de Vmax. Recordar que 1/Vmax
30.0 es el valor
33.8
de la ordenada al origen
90.0 5 Determinar
40.5 el valor de Km. Recordar que el valor de
la pendiente corresponde a la relación Km/Vmax
1 INVERSOS 2 GRAFICA DE INVERSOS

1/1/[S] 1/Vo
0.3333
Vo] 0.0962

0.2000 0.0690

0.1000 0.0444

0.0333 0.0269

0.0111 0.0247

LA GRÁFICA

[S]) + 0.0224 1/[S]

0.1200

0.1000

0.0800

0.0600

0.0400

0.0200

0.0000
0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000

4 DETERMINACIÓN DE Vmax:
1/Vmax = 0.0224 Vmax = 1/0.0224 Vmax = 44.6

5 DETERMINACIÓN DE Km:

Km/Vmax = 0.224 Km = (0.224)(Vmax) Km = (0.224)(44.6) Km = 9.99mmol/L

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis disminuyendo la
velocidad de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimática, tales
como: análogos de sustratos, toxinas, drogas, complejos metálicos, anticoagulantes, etc.

Los estudios sobre inhibición enzimática nos dan información sobre las vías metabólicas, una
visión acerca de los mecanismos de acción de drogas y toxinas, y una mejor comprensión de
los mecanismos de las reacciones enzimáticas. La determinación de Km y Vmáx tiene gran
importancia y utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se
puede determinar la presencia y tipo de inhibidor.

Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.

INHIBIDORES REVERSIBLES
1- INHIBICIÓN COMPETITIVA
Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la
unión del sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen
estructuralmente al sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI].
Debido a que el inhibidor se une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el
sentido de la competición en favor del sustrato simplemente añadiendo más sustrato. Cuando
hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor
por lo que la reacción muestra la misma V máx que la reacción sin inhibidor, pero K m aumenta
en presencia del inhibidor (K´m) (Figura 5).

Vo V max (A ) (B )
1
r
V o id o
h ib

or
id
n in

o r dor b
ib i d n h ib i n hi
in h i ni
Co

n C on Si
Si
V max
2
1
V max

Km K ´m [S ] 1 1 1
K m K ´m [S ]

FFigura
igu ra 5:
9: E fecto de un in hib idor com p etitivo en una rea c ción enz im ática . ( A ) C urva d e sustrato en pre sen c ia
y e n a usenc ia d el in hib id or. ( B ) D o ble re cípro ca e n p resencia y e n au sen cia de l in hib ido r.

2- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La
fijación del inhibidor puede o no bloquear la fijación del sustrato, pero si este último se une al
sitio activo no se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye
de manera efectiva la concentración de enzima activa por lo que disminuye la Vmáx aparente
(V´máx). Frecuentemente el efecto sobre Km es nulo (Figura 6).

Vo Vm a x (A ) 1 (B )
r

Vo
do
ib i

b id o r or
in h

id
in h i hi
b
n

S in
Co

n
ni
V ḿ ax 1 Si
h ib id o r V ḿ a x
n in
 1
V ḿ ax V m ax
2

Km [S ] 1 1
3- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA Km [S ]

En esteFFigura
ig u ra 6:
caso 1el
0: Einhibidor
fe cto d e u n se
inh ib ido r al
une n o complejo
c om p etitiv o [ES],
en una reac
conciónlo en z im ática.
cual ( A ) C urva
el valor de Kdemsudisminuye
strato e n p resen cia
(como
y en ausenc ia d el in h ib id o r. ( B ) D o b le recíproca e n p resen cia y en au senc ia de l in hib id o r.
si la enzima tuviera más afinidad por el S). También disminuye la V máx ya que el complejo
[SEI] es inactivo (Figura 7).

Vo Vm a x (A ) (B )
1
Vo
or
b id o r id
inh i nh
i b
Sin n i b id o
r
V ḿ a x o
C nh i
ib id or ni
n in h Si
V m ax Co 1
2 V ḿ a x
V ḿ ax
2 1
V max

Km [S ] 1 1 1
K ´m K ḿ Km [S ]
Figura
F ig u ra7:11: E fe c to de un in h ibidor acom p e titiv o en un a rea cción en z im á tic a. ( A ) C u rva d e su stra to en presen c ia
y e n a use nc ia de l inh ibid or. ( B ) D oble re cíproca e n p rese ncia y e n ause nc ia d e l inh ib id or.

INHIBIDORES IRREVERSIBLES
Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formación de un enlace covalente
entre un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy útiles para estudiar los
mecanismos de reacción. Estos juegan un papel central en los métodos modernos para
obtener nuevos agentes farmacéuticos, proceso que se denomina diseño racional de
fármacos. Debido a que el inhibidor se ha diseñado para una enzima específica y no es
reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo de la enzima, los fármacos basados en este
método son con frecuencia muy efectivos y tienen pocos efectos secundarios.

EJERCICIO 3

Empleando un sistema similar al anterior (ejercicios uno y dos) pero adicionando una sustancia
inhibidora se corrió el experimento cinético y se obtuvieron los siguientes datos.

[S] Vo s/Inhib Vo c/Inhib

3 10.4 4.1
5 14.5 6.4
10 22.5 11.3
30 33.8 22.6
90 40.5 33.8

Para los datos con inhibidor:

1 INVERSOS GRAFICA DE INVERSOS

0.3

1/[S] 1/Vo c/inhib 0.25

0.333 0.2439
0.2000 0.1563 0.2
0.1000 0.0885 0.15
0.0333 0.0442
0.0111 0.0296 0.1

0.05

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

3 ECUACIÓN DE LA GRÁFICA

1/Vo = (0.667)(1/[S]) + 0.0221

4 DETERMINACIÓN DE Vmax´ (Vmax aparente –con inhibidor-).

1/Vmax´ = 0.0221 Vmax´ = 1/0.0221 Vmax ´= 45.24

5 DETERMINACIÓN DE Km

Km´/Vmax = 0.667 Km´ = (0.667)(Vmax) Km´ = (0.667)(45.24) Km´ = 30.17

Resultados con inhibidor: Vmax ´= 45.24 Km ´= 30.17

Resultados sin inhibidor: Vmax ´=44.6 Km ´= 9.99

Si se construyen las gráficas de los inversos en el mismo eje cartesiano, es posible definir también el
tipo de inhibición que se está presentando, las gráficas se cruzan muy próximas al eje de las
ordenadas, característico de a inhibición competitiva.

0.3000

0.2500
Con inhibidor
0.2000

0.1500

0.1000

0.0500 Sin inhibidor

0.0000
0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500

Si comparamos los valores de Km y Vmax con los de Km´y Vmax´se observa que corresponde con una
inhibición competitiva.