INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas

Departamento de Ingeniería Química Industrial

Academia de Química Analítica

Laboratorio de Técnicas de Separación

Práctica No. 7 “Efecto de la composición de la

fase móvil en la elución de los analitos”.

Alumna: Reséndiz Gómez Chantal Abigail

Grupo: 3IM78 Sección: B

Dr. Luis Enrique Camacho Camacho

2022-1
TABLA DE CONTENIDO

Objetivos ........................................................................................................... 1
Introducción ..................................................................................................... 2
Influencia de la composición de la fase móvil en la elución de analitos .......... 2
Análisis isocráticos y análisis de gradiente de composición............................ 2
Tipos de compuestos que se usan como fase móvil ....................................... 3
Propiedades fisicoquímicas de los solventes importantes en HPLC ............... 4
Desarrollo experimental................................................................................... 7
Encendido del equipo ...................................................................................... 8
Generacion de un método de análisis a partir de cero .................................... 8
Obtención de los cromatogramas impresos .................................................... 9
Apagado del equipo ........................................................................................ 9
Datos experimentales .................................................................................... 10
Análisis de resultados ................................................................................... 10
Conclusiones y recomendaciones................................................................ 14
Bibliografía ..................................................................................................... 14
OBJETIVOS

 Inyectar estándares de benceno y tolueno a diferentes composiciones de

fase móvil.
 Establecer la influencia de la composición de la fase móvil en la elución
de cada analito.
 Inyectar muestras de mezcla de benceno - tolueno para identificarlos por
comparación de tiempos de retención.
 Realizar las modificaciones necesarias a los métodos de análisis para
realizar el trabajo experimental de esta práctica.

1
INTRODUCCIÓN

Influencia de la composición de la fase móvil en la elución de los analitos.

El orden de elución de los analitos en HPLC se rige por la polaridad. Para una
separación de fase normal, los solutos de menor polaridad pasan
proporcionalmente menos tiempo en la fase estacionaria polar y son los
primeros solutos en eluir de la columna.
Dada una fase estacionaria particular, los tiempos de retención en HPLC de
fase normal se controlan ajustando las propiedades de la fase móvil. Por
ejemplo, si la resolución entre dos solutos es mala, el cambio a una fase móvil
menos polar mantiene los solutos en la columna durante más tiempo y brinda
más oportunidades para su separación.
En la HPLC de fase reversa, el orden de elución es el opuesto al de una
separación de fase normal, con más solutos polares eluyendo primero. El
aumento de la polaridad de la fase móvil conduce a tiempos de retención más
largos. Los tiempos de retención más cortos requieren una fase móvil de menor
polaridad. Hay varios índices que ayudan a elegir una fase móvil, uno de los
cuales es el índice de polaridad.

Análisis isocráticos y análisis de gradiente de composición.

En la HPLC isocrática, el compuesto pasa por la
columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con
pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie)
mediante el bombeo de líquido a alta presión a
través de la columna. La muestra para analizar
es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente
dependiendo de las interacciones químicas o
físicas con la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna.

 Análisis Isocrático: Se lleva a cabo con un

solo disolvente o con una mezcla de
disolventes, constante, en el tiempo de
análisis.
 En un Análisis de gradiente: la
composición se va modificando durante la
separación, se debe de disponer de un
sistema de programación de gradiente,

Figura 1. Comparación entre los métodos

isocrático y elución con gradiente.
2
 que permita la mezcla reproducible de disolventes en distintas
proporciones durante la separación cromatográfica; puede efectuarse de
dos maneras: A baja presión y a alta presión.
Su objetivo es el de obtener la mejor resolución de los componentes de
la muestra en el menor tiempo posible, así como asegurar alta precisión
y exactitud.
Normalmente se procede de esta forma, utilizando una fuerza de fase
móvil más débil al principio para ir incrementándola después. Existe dos
tipos de gradientes:

 Lineales (curva 5). La velocidad de cambio del disolvente fuerte es

lineal en el tiempo.
 Exponenciales. (curvas 1 a 4 y 6 a 9). Éstos a su vez pueden ser: -
Convexos (curvas 1-4). Rápidas en alcanzar la composición final de
la fase móvil. Se utilizan para picos superpuestos al final del
cromatograma

Compuestos que se usan como fase móvil.

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una proporción determinada y realice la mezcla en
una cámara de mezclado.
 La fase móvil a diferencia de la Cromatografía de gases, en HPLC si tiene
polaridad:
 Fase Normal: la fase móvil debe ser no polar
 Fase reversa: la fase móvil es polar como el Acetonitrilo y el Agua

3
 Intercambio Iónico: la fase móvil se trata de un Buffer
 Size Exclusion Chromatograpy: la fase móvil, puede ser una la solución
Buffer o un solvente.

Propiedades fisicoquímicas de los solventes, que son importantes en

cromatografía de líquidos de alta resolución.

1. Índice de polaridad (P´)

Este índice de polaridad mide la atracción intermolecular entre un soluto y un
disolvente y, en resumen, se basa en las medidas de solubilidad para la
sustancia en cuestión en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de
dipolo débil), nitrometano (un aceptor de protones de dipolo intenso) y etanol
(un donador de protones de dipolo intenso). P’, por tanto, es una medida
numérica de la polaridad relativa de varios disolventes.

2. Parámetro de solubilidad de Hildebrand (δ)

A los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, a menudo se
les denomina disolventes “fuertes”. Para descubrir cuantitativamente la
polaridad de los disolventes se han desarrollado varios índices. El más útil en
cromatografía de reparto es el “índice de polaridad”, desarrollado por Snyder
(P’). También se utilizan el parámetro de solubilidad de Hildebrand (δ) y la
fuerza eluotrópica como disolvente (𝜀 0 ).

3. Fuerza eleutrópica o fuerza como disolvente ()

Define la energía de adsorción de cada disolvente por unidad de superficie de
sílice respecto al valor de (𝜀 0 ) del pentano, que es igual a “zero”. Cuanto mayor
es la polaridad del disolvente, mayor es su valor de (𝜀 0 ).
Siempre y cuando los disolventes sean miscibles, se pueden hacer
combinaciones binarias, ternarias o incluso cuaternarias variando las
proporciones de cada uno de ellos con objeto de obtener una amplia gama de
valores de (𝜀 0 ). Aunque depende del sistema cromatográfico empleado y el
valor de o no varía linealmente con la composición de una mezcla, en la
práctica resulta útil la siguiente aproximación:

0
𝜀𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 𝑥 % 𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 = 𝜀10 𝑥 %1 + 𝜀20 𝑥 %2

4
Queda lo suficientemente claro que a mayor valor de 𝜀 0 , mayor es la polaridad
del disolvente, pero conviene recordar que:
En cromatografía de reparto en “fase normal”, la fuerza de arrastre de la fase
móvil es mayor cuanto mayor sea su valor de 𝜀 0 . Por ejemplo, una fase móvil
de n-hexano puro ( 𝜀 0 = 0,01) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla
de n-hexano: cloroformo (50:50, v/v) ( 𝜀 0 = 0,205).
En cromatografía de reparto en “fase reversa”, la fuerza de arrastre de la fase móvil
es menor cuanto mayor sea su valor de 𝜀 0 . Por ejemplo, una fase móvil de
acetonitrilo puro ( 𝜀 0 = 0,65) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla de
acetonitrilo: acetona (50:50, v/v) ( 𝜀 0 = 0,605).

1
.

5
2.

6
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Revisar que se tenga suficiente fase móvil, de no ser así, será necesario filtrar más fase móvil para llevar a cabo el análisis.

7
 a) Encendido del equipo.
Este procedimiento por realizar se encuentra en la “Práctica 5: Encendido y
apagado de un equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC” en el
apartado de <Procedimiento experimental> en el inciso a) Pasos para el encendido
del equipo de HPLC Flexar, Perkin Elmer.

b) Generación de un método de análisis a partir de cero.

I. Al inicio se puede seleccionar la bomba para la línea azul, mientras que

para el detector será la línea negra.
II. Buscar la purga de la bomba el cual es del 100% de A Metanol,
seleccionar Apply, comenzara a funcionar y el líquido comienza a fluir a
una velocidad de 1 ml/min
III. Dejar por 5 minutos, poner un valor de cero al flujo para que la bomba se
detenga
IV. Repetir lo mismo para el reservorio B
V. AL detenerse l bomba cerrar la válvula con la jeringa puesta hasta que ya
no succione nada
VI. Poner 95% de A y un flujo de cero
VII. Cambiar el flujo a 0.2 y 90% de A
VIII. Cambiar los valores de flujo de 0.2 en
0.2 y de la composición hasta legar a
una composición del 50% A y 50% B
IX. Cambiar el modo de análisis único,
por lo que es necesario crear un
método
X. Abrir un método ya guardado, nos
mostrara las características de ese
método
XI. Editar el método, detector, datos que
recibirá el cromatógrafo por segundo,
tiempo final, longitud de onda y los
eventos que se puedan generar en el
detector.

XII. Se trabajar la bomba de

forma Isocrática.
XIII. Establecer los tiempos
iniciales de 1 min y final de
16 min así como una
reconciliación de tiempo
(tiempo en que el detector y
la bomba deben coincidir).

8
 XIV. Poner los parámetros de seguridad de la bomba como el límite de trabajo
que es de 6000 PSI y una presión de cero si se llega a presentar una
fuga.
XV. Establecer dos pasos, el tiempo de equilibrio y la corrida.
XVI. Una vez instalado el método se guarda para después ser seleccionado y
usarse.
XVII. Aparecerá que hay un nuevo método, pero no está activado.
XVIII. Una vez Inyectada la muestra, aparecerá el cromatograma del análisis.
XIX. Ir cambiando las composiciones para observar cómo van varían los
cromatogramas.

c) Obtención de los cromatogramas impresos.

1. Se selecciona la opción Reports para poder

visualizar el reporte que se necesita.

2. Aparecerán los reportes con el

Cromatograma con sus datos como
es el tiempo de retención, altura y
área del pico.
3. Antes de imprimirlos es necesario
incluir la información necesaria para
entender que sucedió en el análisis.

d) Apagado del equipo.

Este procedimiento por realizar se encuentra en la “Práctica 5: Encendido y
apagado de un equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC” en el
apartado de <Procedimiento experimental> en el inciso B) Apagado del equipo de
HPLC Flexar, Perkin Elmer.

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 DATOS EXPERIMENTALES

Composición de FM Flujo Tr benceno Tr tolueno Tanálisis Nombre

Muestra
% Metanol % Agua mL/min min min min del analito

1 3.411 ……. Benceno

2 80 20 ….. 3.818 8.0 Tolueno
3 3.422 3.827 Mezcla B-T
4 4.494 …… Benceno
5 65 35 1.0 …… 6.245 Tolueno
6 4.710 6.247 Mezcla B-T
7 7.818 …… Benceno
8 50 50 …… 13.323 Tolueno
9 7.850 13.108 Mezcla B-T
.
% Metanol Tr BENCENO Tr TOLUENO
50 7.85 13.108
65 4.71 6.247
80 3.422 3.827
90 3.3 3.4

ANALISIS DE RESULTADOS

☆ Realizar la identificación del benceno y del tolueno en los cromatogramas de

análisis de mezcla de acuerdo con los datos de los cromatogramas de los
estándares.

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En el cromatograma con una composición del 80%-20% como se hizo en la
muestra de benceno disuelto en metanol el pico más grande corresponde al del
benceno, los demás picos que se observan pueden ser impurezas del solvente, el
tiempo de retención del pico de benceno fue de 3.411 min, área de 568 139.4 y una
altura de 28 633.7
Después se hizo el análisis de tolueno disuelto en metanol donde se observa que
su pico es mucho más grande que el del benceno, su tiempo de retención fue de
3.818 min, área de 9 049 072.9 y altura de 421 526.6
Estos análisis fueron solamente de identificación, por lo que no se dio importancia a
la concentración.

Al realizar un análisis en las mismas concentraciones para la muestra de benceno-

tolueno los dos picos significativos tienen un tiempo de retención de 3.422 y 3.827
siendo el del benceno el del tiempo de retención más bajo.

Al cambiar el método cambiando la composición de metanol en la fase móvil,

obteniendo primero los cromatogramas de Identificación y luego el de la mezcla se
observa que no aparece el benceno con un pico significativo, por lo que se
procedió a abrir el tolueno el cual apareció un pico más alto con un tiempo de
retención de 6.245 min, área de 10 348418.7 y una altura de 356 258.2.

11
Ya en la mezcla se observan que los dos últimos picos son los más significativos
correspondientes del benceno y tolueno el primer pico tiene un tiempo de retención
de 4.710 min del benceno y de 6.247 del tolueno.

Finalmente se hizo un análisis con la composición del 50%-50% obteniéndose

como en los demás que el pico del tolueno es más grande que el del benceno,
siendo sus tiempos de retención de 7.818 min para el benceno y para el tolueno es
de 13.323.

12
 Proponer una composición óptima con el valor de resolución más bajo posible de
acuerdo con los datos obtenidos en los cromatogramas.

Gráfica 1. % Metanol vs Tiempo de

Retención
14
13
TIMEPOS DE RETENCIÓN (MIN)

12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
METANOL (%)

Benceno Tolueno

Considerando que en la composición de 65%-35% se obtuvo una buena resolución

mientras que en la composición 80%-20% los picos no se alcanzan a distinguir y en
la composición de 50%-50% hay una mala resolución ya que los picos están muy
separados, entonces la mejor composición podría ser de 70%-30% que sería una
composición del 5% con respecto al de 65%-35%.

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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

 Antes de realizar un análisis de una mezcla, es necesario primero hacer un

análisis de identificación para saber que compuesto saldrá primero, así
como la diferencia de alturas que pudiese presentarse.
En la variación de las composiciones se ve reflejado en la resolución de los picos,
en la composición del 80%-20% con respecto al de 50%-50% la primera tiene una
buena resolución que la de 50%-50% entonces se concluye que entre más se
disminuye la composición del Benceno va disminuyendo la resolución, para decidir
qué composición seria optima se tomó en cuenta la composición de la buena
resolución con la de 80-20%.
La influencia de la fase móvil se vio reflejada en la elución del analito ya que a
mayor composición del metanol el tiempo de retención es menor, observándose
que afecta más al tolueno el cambio de composición del metanol.

BIBLIOGRAFÍA

 Camacho, L. (2020a, diciembre 8). Práctica 8.- Influencia de la Composición de

Fase Móvil en la elución del analito. Parte 1 [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=0W5rOjVeLe8&feature=youtu.be
 Camacho, L. (2020b, diciembre 8). Práctica 8.- Influencia de la Composición de
Fase Móvil en la elución del analito. Parte 2 [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=Aote1mQSKno&feature=youtu.be
 Camacho, L. (2020c, diciembre 9). Práctica 8.- Influencia de la Composición de
Fase Móvil en la elución del analito. Parte 3 [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=aBb1A3TZ6CI&feature=youtu.be
 luis camacho. (2020a, diciembre 16). Práctica 8.- Influencia de la Composición de
Fase Móvil en la elución del analito. Parte 4 [Vídeo]. YouTube.
 luis camacho. (2020b, diciembre 16). Práctica 8.- Influencia de la Composición de
Fase Móvil en la elución del analito. Parte 5 [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=Yg6GjoWPgVU
 Cromatografía de Líquida de Alta Eficiencia. (s. f.). Relaq. Recuperado 31 de mayo
de 2021, de http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm
 Alarcón Borja, Legaz María, Peña Eva, San Cristóbal Mara, Vicente Carlos. (2011).
Curso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC): Prácticas de
laboratorio y cuestiones teórico-prácticas. Parte III. Práctica de laboratorio:
optimización en la separación de compuestos semejantes mediante modificación de
la fase móvil. Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos., 4 (3): 48-78. ISSN:
1989-3620.
 Gomis Yagües, V. (2008). Tema 4. Cromatografía de líquidos de alta
resolución. Técnicas Instrumentales en el Análisis Industrial.

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