UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMÁ

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA EN FARMACIA

FARMACOGNOSIA

MÓDULO: TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

UTILIZADAS EN LA IDENTIFICACIÓN, AISLAMIENTO Y
PURIFICACIÓN DE PRODUCTOS VEGETALES

PROFESOR. NELSON RODRÍGUEZ

CONCEPTOS
• La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en
colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswe.
• La cromatografía es un método que permiten separar, aislar e
identificar compuestos de una mezcla. Se emplean una fase
estacionaria fija, y una fase móvil.
• Los componentes de una mezcla se transportan a través de la fase
estacionaria por medio de la fase móvil que fluye; las separaciones se
basan en las diferencias de velocidades de migración entre los
componentes de la muestra, los cuales presentan diferencias de
afinidad o distribución por las fases.
CONCEPTOS
• Fase Estacionaria (Adsorbente): Fase fija que puede ser un sólido, un
gel o un líquido. Los adsorbentes más útil son:

• Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) ·

• Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) ·
• Tierra Silícea ó Kieselguhr ·
• Celulosa (Nativa o micro -cristalina) ·
• Poliamidasizados
CONCEPTOS
• Fase Móvil (eluente): Es el fluido (solvente o mezcla de solventes)
que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario (fase
estacionaria), en una dirección definida. Puede ser un líquido
(Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido
supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico).
• Cuando se utiliza un líquido como fase móvil mediante una serie
eluotrópica se escoge la mejor combinación de solventes miscibles
para una buena separación cromatográfica de una muestra en sus
componentes.
CONCEPTOS
• Fase Móvil (eluente):
CONCEPTOS
• Mezcla: consistente en cierto número de componentes, cuya
separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados
o eluidos por la fase móvil.

• Componentes de la Muestra: Los constituyentes químicamente puros

de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es
decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a
tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.
CONCEPTOS
CONCEPTOS
• Las propiedades en que se basa la explicación de la cromatografía
son:
• Solubilidad (Tendencia de un sólido a disolverse en un líquido)
• Volatilidad (Tendencia de una molécula a pasar al estado gaseoso)
• Adsorción (Tendencia de una molécula a adherirse a un sólido)
• Las sustancia pueden exhibir dos de estas propiedades

volatilidad
CONCEPTOS
• Solubilidad
• Ley de Distribución: Dos sólidos en presencia de dos líquidos inmiscibles se
distribuyen en una proporción que es constante a una temperatura dada que
se llama coeficiente de distribución o coeficiente de reparto o coeficiente de
partición.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐴
• = 𝐶𝑂𝑁𝑆𝑇𝐴𝑁𝑇𝐸 = 𝐶𝐷 ó 𝐶𝑃 ó 𝐶𝑅
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐵
CONCEPTOS
• Afinidad:
• La teoría se generaliza a los otros casos (líquido-sólido, gas-líquido y gas
sólido); si en vez de referirnos a solubilidades nos referimos a afinidad por
una fase o otra.

𝐴𝑓𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎 ℎ𝑎𝑙𝑙𝑎𝑟𝑠𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙

• = 𝐶𝑂𝑁𝑆𝑇𝐴𝑁𝑇𝐸
𝐴𝑓𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 ℎ𝑎𝑙𝑙𝑎𝑟𝑠𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑜 𝑎𝑑𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎
CONCEPTOS
• Cuando se usa un líquido como fase estacionaria el fenómeno que
predomina es la partición, cuando la fase estacionaria es sólida,
predomina la adsorción.
• Cuando la fase móvil es un gas el proceso se conoce como el nombre
de cromatografía gaseosa.
CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN
CONCEPTOS
• El movimiento relativo de una sustancia respecto a la fase móvil en un
sistema cromatográfico es constante y característico de dicha
sustancia.

• Relación de frente o Rf (Relación recorrida por la sustancia desde el

punto de siembra y la distancia recorrida por el solvente.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑢𝑛𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

• = 𝑅𝑓
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
CROMATOGRAFÍA SOBRE PLANOS
• La cromatografía sobre planos comprende: Papel y capa delgada. En
ambos casos la única fase móvil utilizada es líquida. La fase
estacionaria puede ser sólida o líquida. En este último caso la fase
estacionaria se encuentra sobre un soporte.

• Cromatografía en Papel: Se lleva a cabo en una tira de papel de filtro

de calidad especial (generalmente Whatman N°1 o Wathman N°3)
CROMATOGRAFÍA SOBRE PLANOS
• Cromatografía en Capa Fina: Es la técnica de separación en la que la
fase estacionaria está sobre un plano formando una capa de
partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de
vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es
aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser eluída dentro
de un tanque cromatográfico.
CROMATOGRAFÍA SOBRE PLANOS
• Cromatografía en Capa Fina: Los materiales utilizados en la CCF son:
• Silicagel: La silicagel es ligeramente ácida y requiere de activación
(deshidratación de la placa).
• La silicagel activada se utiliza en la separación de compuestos poco o
medianamente polares. Es útil en la separación de isómeros y moléculas que
difieren en sus grupos funcionales.
• Alumina: Se utiliza para separar compuestos pocos polares (esteroides,
vitamina, colorantes) y especialmente compuesto básicos como alcaloides
• Celulosa: Se utiliza para separar compuestos polares como azúcares,
aminoácidos, polifenoles)
• Poliamida: Se utiliza para la separación de compuestos fenólicos
FASE NORMAL Y FASE REVERSA
• Fase Normal: La fase estacionaria es más polar que la fase móvil y la
muestra. Los analitos polares son retenidos en la fase sólida mediante
interacciones hidrofílicas (puentes de Hidrógeno, dipolo-dipolo). Se
aplica a compuestos pocos o medianamente polares
• Fase reversa: La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil y
la muestra. Los analitos apolares o pocos polares son retenidos en la
fase sólida. Se aplica a compuestos más polares.
• En el caso de fases estacionarias con cadenas hidrocarbonadas unidas
(C8, C18) se usan como fase móvil mezclas de solventes orgánicos con
hasta un máximo de 20% de agua.
FASE NORMAL Y FASE REVERSA
RESOLUCION DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO
• Resolución de un Sistema Cromatográfico: Capacidad del sistema para
separar los componentes de una mezcla y refleja el grado de
separación de las manchas entre sí como la dispersión de cada una de
ellas.
• Los factores que afectan la resolución son: la capacidad (k'),
selectividad (α‘) y eficiencia (N)
RESOLUCION DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO
• En cromatografía sobre planos:
• La capacidad es la medida de la retención del sistema cromatográfico para un
compuesto dado y se relaciona con el Rf.

• Si el Rf es alto, la capacidad es baja y el compuesto migra con el solvente

• Si el Rf es bajo, la capacidad es alta y el compuesto se queda en el origen.
• Rf cercano a 0.5, entonces la capacidad es ideal

• La capacidad se optimiza variando la composición de la fase móvil

RESOLUCION DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO
• En cromatografía sobre planos:
• La selectividad es la capacidad del sistema para discernir entre dos
compuestos y se manifiesta en el grado de separación de las muestras. Se
optimiza variando ligeramente la fase móvil (sin variar la capacidad) o
agregando algún modificador químico en pequeña cantidad.

• La eficiencia está relacionada con el número de platos teóricos (unidades) y se

manifiesta en el tamaño y forma de las manchas. En un sistema eficientes se
observan manchas pequeñas y redondeadas.
POLARIDAD Y FUERZA DE UN SOLVENTE
• La habilidad de una molécula de la muestra o solvente de interactuar
(dispersión de cargas, formación de dipolos, formación de puentes de
hidrógenos, interacción dieléctrica) se denomina polaridad.
• Solventes polares disuelven y atraen moléculas de solutos polares.
• Fuerza del solvente es la capacidad de eluir del mismo con respecto a
una sustancia, de tal manera que regula la capacidad del sistema para
dicha sustancia.
• Existen listas de solventes de acuerdo a su capacidad de elución o
fuerza para una determinada fase estacionaria
POLARIDAD Y FUERZA DE UN SOLVENTE
FASE NORMAL FASE REVERSA
Hexano, Hepatano Agua
Cloruro de metileno Metanol
Tetrahidrofluorano Acetonitrilo
Cloroformo Acetona
Acetato de Etilo Etanol
Etanol Tetrahidrofluorano
Acetonitrilo Isopropranol
Metanol
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
• Es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está
contenido dentro de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada
líquida o sólida (adsorbida por fase la estacionaria). Posteriormente
se agrega el eluente por la parte superior del tubo cromatográfico y
se recogen volúmenes definidos por el analista de eluente luego de
ser eluído por el tubo cromatográfico, separando una muestra en sus
componentes.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
• Columna convencional. Las partículas de la fase estacionaria son
relativamente grandes y de tamaño irregular. Esto limita su eficiencia
y su desarrollo puede tardar varios días, se utilizan con fines
preparativos.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
• Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, CLAR): La fase
estacionaria esta constituidas por partículas finamente dividas,
uniformes y casi esféricas. Esto aumenta la eficiencia de la columna.
Se necesita de un bomba que suministra un flujo determinado, esto
aumenta la presión del sistema.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
• Cromatografía en fase gaseosa: La fase estacionaria está compuesta
por partículas finas conteniendo un líquido adsorbido. La fase móvil
es un gas.