Nombre de la práctica:

RECUENTO MICROSCÓPICO DE CÉLULAS

Realizó: Calificación:

INTRODUCCIÓN

La cuantificación de células requiere que contemos con instrumental adecuado para

la manipulación de los cultivos celulares además de emplear todo lo necesario para
mantener condiciones de asepsia. El desarrollo de técnicas que nos permiten llevar
a cabo la cuantificación de poblaciones microbiológicas ha sido de alta importancia
en diversas industrias debido a que nos permiten analizar e identificar aplicaciones
positivas o negativas que le podemos dar según el comportamiento de los
microorganismos cultivados.

Una vez realizado el cultivo de las muestras seleccionadas por medio de técnicas
adecuadas es importante escoger los métodos pertinentes para la preparación y
observación de las muestras cultivadas. El recuento microbiológico abarca técnicas
que se adaptan a diversas condiciones y conocer el uso más viable de cada una
resulta en un conteo más eficiente.

Es importante que tomemos en cuenta variables como el tipo de microorganismo o

el peso de la muestra que vamos a analizar además de las ventajas y desventajas
que tienen ciertas técnicas de cuantificación para así en combinación utilizar las que
más nos acerquen a los resultados esperados. El aumento ordenado de los
constituyentes químicos de los microorganismos implica un aumento en el número
de células o masa celular y el crecimiento de una población se mide a través de
métodos directos e indirectos.

Por un lado, dentro de los métodos directos podemos encontrar por número de
células mediante el uso del microscopio o recuento en placa y recuento de células
con la cámara de Neubauer donde se estudian las unidades formadoras de colonias
(UFC). Por otro lado, encontramos la medición por medio de masa celular la cual
puede darse de las siguientes maneras:
 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO
FACULTAD DE QUÍMICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

Peso seco Turbidez

Filtración y centrifugación para eliminar Densidad de una suspensión de células

el medio de cultivo

En general, los métodos directos de número de células cuentan todo el contenido en

las placas, sin importar si son microorganismos vivos o muertos.

Por medio de los métodos indirectos se aplican incentivos a los componentes

celulares y gracias a la información que proveen estos procedimientos,
cuantificamos la biomasa viable mediante:

● Análisis en el consumo de sustratos (azúcares)

● Formación de productos (Etanol)
● Respirometría (O2 / CO2)
● Actividad enzimática (Deshidrogenasa)
● Según la presencia de componentes celulares (ácidos nucléicos, proteínas,
lípidos e inclusive ATP).

En esta práctica llevamos a cabo métodos de observación que posteriormente

pueden servirnos para cuantificar la biomasa contenida en los medios de cultivo, sin
embargo, nos centramos un poco más en las técnicas de tinción que fueron un tema
desarrollado ampliamente en la práctica 2 y principalmente, podemos rescatar el
fundamento de la tinción de Gram donde las bacterias Gram positivas retienen el
colorante violeta de la tinción y luego de un proceso de decoloración con
éter-acetona (las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de
peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram
negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano en su
pared) y, por lo tanto, se ven teñidas de este color; en tanto, las Gram negativas se
decoloran y se contra tiñen de rosado con safranina, el segundo con colorante de
esa tinción. Entonces, con la tinción de Gram, las bacterias Gram positivas
aparecen violeta o azul oscuro y las Gram negativas aparecen rosadas como se
muestra en la siguiente imagen:

Imagen 1.6 Tinción de bacterias (Yael, 2015)

OBJETIVO

● Aplicar las técnicas de preparación y tinción adecuadas para el estudio

microscópico de las levaduras
● Observar y describir las características microscópicas de las levaduras
● Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento directo
de microorganismos
● Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la
aplicación de un conteo directo

MATERIALES Y EQUIPO

● Cajas Petri preparadas con ● Agar Sabouraud

colonias de hongos ● Lugol
● Asas microbiológicas ● Acetona con etanol
● Portaobjetos ● Agua destilada
● Cubreobjetos ● Cristal violeta
● Microscopio ● Muestra de bacterias
● Mechero ● Safranina
● Micropipeta 100 μL

MÉTODOS
Parte A. Identificación de hongos.
Parte B. Tinción Gram.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Parte A. Resultados de la visualización de hongos.

Muestra. Descripción.

En este podemos observar un hongo

con colores blanquecinos y textura
algodonosa y por otro lado también
tenemos partes con color verdoso y
textura mohosa. Creemos que el hongo
que se desarrolló aquí es el Penicillium
chrysogenum, por las características
observadas.
 Aquí podemos observar un hongo
esporulado, podemos ver muchas
“bolitas” que son las esporas y todas
tienen un color verde. Este hongo es
Trichoderma.

En este hongo pudimos observar sus

filamentos (señalado con una flecha) y
que todas las colonias presentaron
formas iguales y el mismo color. Este
hongo era Aspergillus niger.

Parte B. Tinción Gram.

Muestra. Descripción.

Esta muestra que tomamos es de la

bacteria E. Coli, que es teóricamente una
bacteria Gram negativa, lo que significa que
debería tener un color rosado. En este caso
la tinción no salió como debería, es por eso
que la bacteria no se tiñó.
CONCLUSIONES

La elaboración de esta práctica nos permitió conocer el método de tinción de Gram,

así como su ejecución con múltiples áreas de oportunidad y su importancia para la
clasificación de bacterias por su pared celular. Es fundamental tener las bases para
el proceso de tinción para no dejar a un lado algún paso, dentro del tiempo
determinado, que pueda afectar la visualización de las bacterias teñidas. También,
aprendimos a utilizar un microscopio, el cual es esencial para nuestra carrera, para
visualizar microorganismos, en este caso hongos. Pudimos apreciar muchísimas
esporas y filamentos, que indican que el hongo se encontraba esporulando.

En el caso de la tinción Gram, hicimos pruebas con E. Coli que es una bacteria
Gram -, lo que en teoría debió teñir nuestra muestra color rosado, en el caso de
nuestra muestra hubo algunos errores en el momento de teñirla que es lo que
ocasionó que esta no tomara color. El primero consideramos que fue no dejar el
tiempo suficiente los reactivos para hacer la tinción; y el segundo creemos que fue
que no tomamos una cantidad considerable de la muestra, por lo tanto vemos muy
poca presencia de la bacteria.

La utilización de hongos y levaduras en la industria biotecnológica resulta de alto

interés para nosotros debido a que el conocer las características de estos
microorganismos nos permitirá hacer uso de sus habilidades para obtener productos
de alto interés para diversos procesos. En levaduras como Kluyveromyces fue de
vital importancia identificar sus habilidades respiro-fermentativas debido a que
mediante ese proceso es capaz de producir bioetanol. Como el anterior, existen
muchos casos en los que se ha logrado hacer un uso adecuado de ciertas
características y para esto es importante conocer las técnicas de manipulación y
observación adecuadas.

PREGUNTAS
1. Describir el fundamento de los diferentes métodos de cuantificación directa

Métodos de cuantificación directa

Por número de células

● Conteo Directo al Microscopio: Consiste en la enumeración directa en el
microscopio de células microbianas. Se desarrolló en 1911 por Breed. Se coloca
cierta cantidad de la muestra sobre el portaobjeto, se deja secar y posteriormente,
se tiñe para que sean visibles los grupos o individuos microbianos en múltiples
campos a través de un microscopio compuesto con una iluminación convencional.