TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES

DE ECATEPEC
División de Ingeniería Química y Bioquímica.

Pruebas de perfil fenotípico para la bacteria

Lactobacillus bulgaricus.

Microbiología

Protocolo Experimental lll

Presentan – Equipo 3

 García Alonso Bryan Alberto

 Ortega Sánchez Emanuel
 Sánchez Segundo Ana Karen

Director
Dr. Hugo Minor Pérez.

Grupo 3651 Ecatepec de Morelos, de 2021

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Resumen

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos basados en las

características fenotípicas, debido a que su realización y coste los hace ideales. Estas
técnicas son dependientes del cultivo bacteriano y no son aplicables para la identificación
de bacterias directamente de las muestras.

Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que tenerlas en
cuenta cuando se inicia el proceso de identificación, pero en principio se seleccionan
aquellas que se consideran pruebas primarias, que son rápidas y fáciles de realizar, como
la morfología en la tinción de Gram u otras tinciones, características macroscópicas en la
morfología de las colonias observadas después del cultivo bacteriano, oxidasa, catalasa y
fermentación de carbohidratos, entre otras.

Sin embargo, los métodos de identificación fenotípica pueden proporcionar una certeza
absoluta, debido a que resultados erróneos en las pruebas primarias pueden conducir a
una identificación equivocada. Solamente indican cuál es el género y/o la especie a la que
la bacteria identificada tiene mayor probabilidad de pertenecer.

Dichas técnicas evalúan las muestras con pruebas de crecimiento, forma, color, tamaño,
presencia de esporas, fermentación de carbohidratos, presencia de enzimas catalasa y
oxidasa, etc.

Para este protocolo se tomó como bacteria de interés a L. bulgaricus, una bacteria Gram
positiva productora de ácido láctico. Se investigaron las pruebas de perfil fenotípicas que
se pueden aplicar para su identificación.

Introducción

Una de las tareas más importantes del laboratorio de Microbiología es la aplicación de

una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismos implicados
en procesos de interés. La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente
en la comparación de las características fenotípicas de bacterias desconocidas con
aquellas de cultivos previamente identificados.

Los métodos tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las

características observables de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y
propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo, continúa siendo el método diagnóstico
de elección; permite el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación
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mediante distintos perfiles presuntivos de identificación bacteriana. En el cultivo es
esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación.

Éstos métodos de identificación comprenden pruebas de perfil morfológico, fisiológico,

bioquímico y ecológicas. Y en ellas se evalúan: (1) Características microscópicas, usando
tinciones, como la tinción simple, para observar forma bacteriana en general (cocos,
bacilos, etc). (2) Características macroscópicas, técnicas como el aislamiento bacteriano
permiten observar características macroscópicas de las colonias en el medio de cultivo y
compararlas con las características descritas en la literatura. La morfología de las colonias
es fundamental en la identificación preliminar y para la diferenciación de los
microorganismos. Las colonias bacterianas se describen por sus características de tamaño,
forma, consistencia, y a veces, por su color. (3) Pruebas bioquímicas, las cuales permiten
determinar las características metabólicas de las bacterias a identificar. Algunas de estas
pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su
lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas en la mayoría de los casos.
Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar, con lectura inmediata son: prueba
de la Catalasa y la prueba de la Oxidasa, ambas enzimas.

Lactobacillus bularucus es una especie de bacteria que pertenece al grupo de las BAL de
las más importantes en la industria de alimentos. No posee cápsula, no forma esporas, no
es móvil, es Gram positivo y su morfología es de bacilos alargados. A través de pruebas
de perfil fenotípico se puede hacer una identificación preliminar, pero no es posible
asegurar la caracterización completamente, para ello se necesitan pruebas genéticas como
la PCR.

Objetivo General

Caracterizar mediante pruebas de perfil fenotípico a Lactobacillus bulgaricus.

Objetivos específicos

 Investigar pruebas que componen a un perfil fenotípico.

 Fundamentar el uso de las pruebas para la identificación de L. bulgaricus
 Identificar el material necesario para las pruebas
 Explicar los diferentes pasos para la realización de las distintas técnicas.

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Metodología

- Pruebas de perfil morfológico -

 TINCIÓN SIMPLE.

Materiales Reactivos
1 propipeta de 100ml. 1. Azul de metileno
1 vaso de precipitados de 100ml. alcalino.
1 mechero. 2. Aceite de inmersión.
1 asa de siembra.
5 porta objetos.
Piseta con agua destilada.
Microscopio compuesto de campo claro

Tabla 1. Materiales para tinción simple. Tomado de Ramos, M. & Chabela, M. (2016)

Procedimiento, como menciona Ramos, M. & Chabela, M. (2016):

A partir de cultivos de Lactobacillus bulgaricus, se prepararán frotis de la bacteria, el cual

se fijará mediante calor seco y se teñirá con azul de metileno.

1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno (anexo 5) durante 30 segundos a

1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado de agua destilada con ayuda de la
piseta.
3. Dejar secar al aire.
4. Observar al microscopio a 10x y 40x.

 AISLAMIENTO BACTERIANO POR TÉCNICA DE ESTRÍA CRUZADA E

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA POR MORFOLOGÍA COLONIAL.

Materiales
 4 placas de Agar MRS  5 aplicadores con
 1 frasco para recolectar la punta de algodón
muestra.
 1 mechero de Bunsen.
 1 asa de siembra.
 1 puente de tinción
 1 pizeta con agua destilada.
 2 cajas de Petri de vidrio
 Microscopio compuesto de
campo claro
Tabla 2. Materiales para aislamiento bacteriano por técnica de estría cruzada. Tomado de Velasco y Tapia
(2014)

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 1. Marcar la caja de Petri especificando tipo de muestra y medio utilizado. Trabajar
en el área de esterilidad que provee la llama del mechero de gas.
2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.
3. Enfriar el asa, tomar una asada de la muestra y colocar en un borde de la placa
haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja.
4. Esterilizar el asa nuevamente, enfriar y hacer una segunda serie de estrías tocando
la porción final de la primera estría.
5. Repetir el punto 4 para hacer la serie de estrías.
6. A partir del cuarto trazo hacer una estría amplia hacia el centro de la caja.
7. Finalmente, esterilizar el asa.

Desarrollo.

1. Sembrar la muestra por la técnica de estría cruzada en placas de agar MRS (Anexo
8)
2. Incubar las cajas de Petri en posición invertida, durante 24 horas a 37 ºC.
3. Seleccionar cuatro colonias con diferente morfología colonial considerando:
Tamaño, color, luz reflejada, luz transmitida, elevación, bordes, etc. Resembrar
cada colonia por estría continua para su purificación en Agar MRS. Etiquetar las
cajas e incubarlas a 37 °C durante 24 horas.
4. Describir las características coloniales observadas y registrarlas en una hoja.
5. Preparar tres frotes con cada una de las cepas puras. Teñir uno por el método de
Gram para observar la morfología microscópica y otro frote para tinción de
esporas. (Ver apéndice B). Observar con objetivo de inmersión.
6. Realizar las pruebas de catalasa y de oxidasa para una primera clasificación de las
cepas purificadas. Es recomendable realizar las pruebas en cajas de Petri de vidrio
(Velasco y Tapia, 2014).

- Pruebas de perfil fisiológico -

 TINCIÓN DE GRAM.

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 Materiales Reactivos
 1 propipeta de 100ml  Cristal violeta
 1 vaso de precipitados  Lugol
de 100ml.  Etanol al 95%
 1 Mechero.  Safranina
 1 Asa bacteriológica
 5 Portaobjetos.
 1 Piceta con agua
destilada
 1 Microscopio
compuesto
Tabla 3. Materiales para tinción de Gram. Tomado de Ramos, M. & Chabela, M. (2016)

Se prepara el frotis y se realiza el procedimiento, como menciona Ramos, M. & Chabela,

M. (2016):

1. Con un asa de siembra tomar una colonia y extenderla en un portaobjetos con el

fin de preparar un frotis bacteriano y fije la preparación.
2. Teñir con cristal violeta durante 30 segundos. (Anexo 1)
3. Tirar el exceso de colorante
4. Añadir lugol, esperar un minuto. (Anexo 3)
5. Decolorar con etanol al 95%, 20 segundos. (Anexo 4)
6. Lavar con agua.
7. Añadir el colorante de contraste, safranina, esperar 1 minuto. (Anexo 2)
8. Lavar con agua.
9. Observar al microscopio (x40, x100).

 TINCIÓN DE SHAEFEER-FULTON PARA ESPORAS

Procedimiento descrito por Velasco y Tapia (2014)

1. Se prepara un frote y se cubre con solución de verde de malaquita (Anexo 6). Se

deja actuar durante un minuto.
2. Se calienta la preparación a emisión de vapores durante 5 minutos, (el colorante
no debe hervir, ni secarse), se escurre la laminilla y se lava con agua corriente.
3. Se cubre la preparación con solución de safranina y se deja actuar durante un
minuto, se escurre y se lava con agua corriente.
4. Se deja secar al aire y se observa al microscopio. Las esporas se ven de color verde
y las bacterias de color rojo.

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  TINCIÓN DE CÁPSULA (MÉTODO DE ROJO CONGO)

Procedimiento descrito por Velasco y Tapia (2014)

1. Se coloca una gota de solución de rojo congo en el centro de un portaobjetos

(Anexo 7).
2. Se toma una asada del cultivo, se suspende y dispersa en la gota de colorante para
hacer un frote. Dejar secar al aire.
3. Se cubre el frote con unas gotas del mordente de cápsula y se deja actuar durante
un minuto, se escurre y se lava con agua destilada. Dejar secar al aire.
4. Se observa la preparación al microscopio con objetivo de inmersión. La cápsula
se observará como una zona luminosa de color rojo alrededor de la bacteria en un
campo azul oscuro.

- Pruebas de perfil bioquímico -

 PRUEBA DE CATALASA

Procedimiento descrito por Velasco y Tapia (2014).

1. Transferir células del centro de una colonia aislada a la superficie de un

portaobjetos limpio.
2. Añadir 1 ó 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3 %.
3. La aparición rápida y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia
indica una reacción positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas
distintas a la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas
pocas burbujas diminutas formadas de 20 a 30 segundos, no se consideran una
prueba positiva.
 PRUEBA DE OXIDASA

Procedimiento descrito por Velasco y Tapia (2014).

1. Se añaden unas gotas de Diclorhidrato de tetrametilp-fenilendiamina al 1% a una

tira de papel filtro o discos comerciales impregnados con el reactivo.
2. En la zona del papel, donde se halla el reactivo, se extiende una asada de la colonia
de prueba.
3. Las colonias bacterianas con actividad de citocromo-oxidasa desarrollan en
segundos un color azul intenso en el sitio de aplicación.

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  FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Agar Triple Azúcar Hierro (TSI). Procedimiento como lo menciona Camacho y

Velázquez (2009):

Inocular Triple Sugar Iron Agar con una colonia presuntiva de una placa de aislamiento
primario, tal como se describió en la técnica anterior de aislamiento bacteriano. Incubar
en atmósfera aerobia a 35 – 37 °C durante 18 – 24 h. No incubar en una atmósfera aerobia
enriquecida con dióxido de carbono ni por períodos más prolongados que 24 h, dado que
de esa manera se podrían producir resultados erróneos.

- Pruebas de perfil ecológico -

Resultados y discusión

Figura 1. Tinción de Gram de L. bulgaricus. Obtenido

Figura 1. Colonias de L. bulgaricus en medio MRS.
de Gónzalez, R. et al. (2020)
Obtenido de Gil, (2019).
En este protocolo, no se realizó una identificación de L. bulgaricus a partir de pruebas de
perfil fenotípico de forma presencial. Sin embargo, la literatura indica que una vez
realizada ésta, se observa:

(1) En las pruebas de perfil morfológico, L. bulgaricus presenta forma de bacilos

alargados, sus colonias son blancas puntiformes, pero algunas llegan a medir de 2-3 mm
de diámetro, de borde entero y con ligera elevación.

(2) Las pruebas de perfil fisiológico presentan una tinción Gram positiva debido a la
composición de su pared bacteriana que posee un mayor grosor y una mayor proporción
de cantidad de enlaces entre subunidades de peptifoglucano. No poseen esporas y
tampoco cápsula.

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(3) Las pruebas de perfil bioquímico proporcionaron características propias de L.
bulgaricus, oxidasa y catalasa negativos, debido a que este microorganismo no posee un
sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por
el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno, ni citocromos que
sintetizan la catalasa. En fermentación de carbohidratos dio un resultado positivo
fermentando azúcares como glucosa y lactosa por la vía de la glucólisis por lo que se
evidenció la acidificación del medio de cultivo y el viraje de color indicador de pH.

Conclusiones

Las técnicas de análisis de muestras, cuyas características macro y microscópicas,

fisiológicas, bioquímicas y ecológicas, permiten identificar una bacteria dentro de un
grupo de bacterias, pertenecen a un perfil fenotípico.

Lactobacillus bularucus es una especie de bacteria que pertenece al grupo de las BAL,
que tienen la propiedad de formar ácido láctico y en algunos otros casos, otros ácidos que
no solo contribuyen a las propiedades sensoriales de los alimentos fermentados, sino
también son responsables de la inhibición de bacterias patógenas y deterioradas que
pueden afectar la calidad y seguridad del alimento, por lo que su estudio resulta muy
interesante y de utilidad.

Bibliografía

▫ Ramos, M. & Chabela, M. (2016). Manual de prácticas de microbiología general.

Uamenlinea.uam.mx. https://n9.cl/7egxs
▫ Velasco, R. & Tapia, R. (2014). Curso práctico de Microbiología. UAM.
http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/cpm.pdf
▫ González, R., et al. (2020). Las tinciones básicas en el Laboratorio de
microbiología: Un enfoque gráfico. UNAM.
▫ Camacho, A., Ortegón, M., & Velázquez, O. (2009). Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos (2.a ed.). Facultad de Química, UNAM.
▫ Gil, M. (2019). Agar M.R.S: fundamento, preparación y usos. Lifeder.
Recuperado de https://www.lifeder.com/agar-m-r-s/.

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Anexos

- Reactivos -

Anexo 1. Cristal violeta

Esta solución se prepara en dos partes:
1. Solución a: en un vaso de precipitados de 50mL colocar 10 mL de alcohol etílico y
disolver 1 g de cristal violeta. Solución b: en otro vaso se disuelven 0.4 g de oxalato de
amonio en 40 mL de agua destilada.
2. Mezclar cuidadosamente las soluciones a y b
3. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel
Whatman No. 1 antes de utilizarlo.
(Ramos & Chabela, 2016)
Anexo 2. Safranina
En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de alcohol etílico y disolver 0.125 g de
safranina. Aforar con agua destilada (Ramos & Chabela, 2016).

Anexo 3. Lugol
En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de yoduro de potasio en 20 mL de agua
destilada y enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo, mezclar completamente y
aforar con agua destilada. (Ramos & Chabela, 2016)
Anexo 4. Solución decolorante alcohol-acetona
Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alcohol etílico y 20 mL de acetona, mezclar
perfectamente. (Ramos & Chabela, 2016)
Anexo 5. Azul de metileno
Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de alcohol etílico al 95% y mezclarlo con
100 mL de solución de hidróxido de potasio al 0.01%. (Ramos & Chabela, 2016)
Anexo 6. Verde de malaquita al 5%
Verde de malaquita 5.0 g. Agua destilada 100.0 ml. (Velasco y Tapia, 2014)
Anexo 7. Rojo congo al 1%
Rojo congo 1.0 g. Agua destilada 100.0 ml. (Velasco y Tapia, 2014)
Anexo 8. Agar MRS
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
Acetato de sodio 5.0 Fosfato disódico 2.0

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Agar 12.0 Peptona proteosa No. 3 10.0
Citrato de amonio 2.0 Polisorbato (Tween 80) 1.0
Dextrosa 20.0 Sulfato de magnesio 0.1
Extracto de carne 10.0 Sulfato de manganeso 0.05
Extracto de levadura 5.0
PREPARACION
Rehidratar 67 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para
disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante
15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri estériles.
Conservar en refrigeración de 2º a 8ºC.
NOTA: La superficie de las placas no debe secarse, porque aumenta la concentración
de acetato en la superficie y se inhibe el crecimiento de Lactobacilos.

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