DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE

MICRORGANISMOS POR CONTEO EN DIFERENTES

FORMAS.
Concentración / Recuento de microorganismos

En microbiología, la unidad formadora de colonias​​ es una unidad de medida que se

emplea para la cuantificación de microorganismos, es decir, para contabilizar el número
de bacterias o células fúngicas ​ viables en una muestra líquida o sólida.

UFC = Unidad Formadora de Colonias(en inglés: CFU-Colony Forming Units) es un término de la

microbiología.
Es una unidad de medida que se emplea para la cuantificación de microorganismos, es decir, para
contabilizar el número de bacterias o células fúngicas, viables en una muestra líquida o sólida.
Este valor, determinado por el número de colonias individuales, describe el número de células de
un organismo en el agua. Estos pueden ser bacterias u hongos que viven y se multiplican en el
agua.
MÉTODOS UTILIZADOS
Los métodos empleados para la valoración o recuento de microbios , se
clasifican en dos grandes grupos:
Cualitativos
Cuantitativos
Estos métodos se utilizan para detectar la posible presencia de ciertos patógenos
como Salmonella, Clostridium botulinum, Esc. Coli, Listeria monocytogenes, etc

METODOS CUANTITATIVOS:
Estructurados para determinar o calcular de manera directa o indirecta, la
carga microbiana del material analizado.
Directo E IndirectoEjm: Recuento de aerobios en placa de petriRecuento
de anaerobiosRecuento de microorganismos TermorresistenteConteo de
coliformesConteo de hongos y levaduras.
METODOS CUALITATIVOS
METODOS CUALITATIVOS PARA AISLAR
MICROORGANISMOS
Aislamiento de patógenos: determinar si una muestra
contiene o no, células o esporas viables de un
patógeno específico. (Salmonella, Listeria, Vibrio y
Shigella

1El proceso de aislamiento

Enriquecimiento previo no selectivo: reparar células

lesionadas o estresadas y proliferen hasta una
cantidad medible.
Enriquecimiento selectivo: proliferación del patógeno
específico y multiplicación abundante.
Diferenciación e identificación: desarrollo de colonias
características del patógeno y realización de pruebas
bioquímicas preliminares y serológicas confirmativas
METODOS CUANTITATIVOS
Estructurados para determinar o calcular de manera
directa o indirecta , la carga microbiana del material
analizado.
Ejm: Recuento de aerobios en placa de Petri
Recuento de anaerobios
Recuento de microorganismos Termorresistente
Conteo de coliformes
Conteo de hongos y levaduras. Etc.
METODOS CUANTITATIVOS: CONTEO DIRECTO
1.Microscopio de contraste de fase se evidencian células coloreadas. Reportar los resultados como
cuenta microscópica por ml ó g del producto. Se reporta como cuenta microscópica por ml o g del
producto.
DESVENTAJA :No se diferencia entre células vivas o muertas; no se puede realizan en los alimentos que
contienen partículas,
la muestra debe contener más de 106 microorganismos por ml o g.
Ahora es posible el conteo de bacterias vivas, Gram (+/-) por medio de fluorescencia.

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)

2. En medios de agar no selectivos: agar plate count, tripsina soya, agar nutritivo, agar cerebro corazón.Ej: mesófilos
aerobios 37°C 48h; Psicrotrófos 7°C 10 días y 10°C 7 días. Se cuenta el número de colonias presentes.

En medios diferenciales no selectivos:

Adicionar componentes para diferenciar características que las hacen particulares. Ej: indicador de pH púrpura de
bromocresol, sustancias como fuente de carbono como la lactosa, yema de huevo.

El reporte de UFC estará enfocado en las manifestaciones microscópicas del grupo bacteriano.
En medio de agar selectivo: se agrega uno a mas inhibidores como antibióticos o sales donde sólo pueda proliferar los
microorganismos que sean resistentes a ellos.
CONTEO INDIRECTO
1. Diluciones hasta a extinción en caldos no selectivos:consiste en preparar diluciones
seriadas de una muestra y transferir 1ml o 0.1 a 10ml de un caldo final no selectivo como el
tripticasa soya.

2. Se examinan los tubos para observar si hubo proliferación bacteriana según la

turbidez del medio.
El reporte dependerá de la cantidad de microorganismos presentes a partir de la máxima
dilución de muestra con la que se produce multiplicación microbiana.
Ej: turbidez en la dilución 10-6= células por ml / g.

3. Prueba de reducción de colorantes : Basado en el principio que algunos colorantes,

como azul de metileno tiene un color en estado de oxidación, pero son incoloros en estado de
reducción (directamente proporcional con la carga bacteriana del producto).

4. Conteo de grupos de microbios lesionados por medios selectivos:

En el caso de coliformes y células bacterianas patógenas con lesiones subletales, los
microorganismos pueden morir durante el conteo en medio de agar selectivo, ya que
desarrollan sensibilidad a los agentes agregados.
Recuento de bacterias
El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana.
Se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de
medida:
1. Cuenta celular (directamente al microscopio )
2. Contador electrónico de partículas (indirectamente con cuenta colonias),
3. Masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno) 4.
Indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células)
5. Por actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica
al tamaño de la población bacteriana).
6. Otros

6. Otros:
- recuento por plaqueo
 PETRIFILM PARA COLIFORMES , MESÓFILOS,
OTROS
La placa Petrifilm es un
Petrifilm comprende un sistema que se utiliza
agente gelificante soluble en en industrias para cultivar
agua fría, nutrientes e varios microorganismos es
indicadores de actividad y un método más eficiente
recuento. para la detección y
enumeración de bacterias
 RECUENTO DE BACTERIAS EN PLACA
•
• Una célula o un grupo de células
dará origen a una colonia luego de
la siembra e incubación.
• Por lo general se evalúan
muestras pequeñas y
representativas, por lo que se
pueden producir errores
(necesidad de repeticiones)
• Presencia de viables no cultivables
(pH, temperatura, tiempo, medio
de cultivo)
 SIEMBRA EN SUPERFICIE : METODO DE
EXTENDIDO EN PLACA
•
• Siembra en superficie
• La muestra se inocula
en la superficie de la
placa de Petri que
contiene el medio de
cultivo adecuado.
• Microorganismos
aerobios estrictos,
facultativos
 METODO DE VERTIDO EN PLACA
•
Siembra en placa vertida
• La muestra se inocula en
el fondo de la placa de
Petri estéril y vacía y luego
se vierte el medio de
cultivo adecuado.
• Microorganismos
aerobios facultativos y
anaerobios
aerotolerantes
 Recuento de Bacterias en Placa Por Diluciones
• Conteo en placa de petri
• Método más usado para contar bacterias.
• Se prepara un caldo de cultivo, el cual posteriormente se vierte en las
placas de petri.
• Dependiendo del tipo de sembrado, puede que la muestra se encuentre
incorporada en el agar (Pour method) o
• puede que la muestra se disperse sobre el agar gelificado (Spread
method).
• Es de suponerse que cada célula o grupo de células presentes en la
muestra se reproducirá en sus múltiples alrededores para producir
"colonias de células" separadas en el agar.
• Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC).
• Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser
así, éstas pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango
sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias, otros dicen entre 30 -300
colonias)
• El conteo se facilita utilizando un contador de colonias.
• Este método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo
células vivas); en contraste con el conteo microscópico y el conteo de peso
seco.
• Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias,
ya que se necesitan como mínimo 24 horas o más.
 TÉCNICA DE DILUCIONES SERIADAS
Técnica de diluciones seriadas
Muestra líquida
9 ml sol fisiológica10 -310-4 10-5
10-6 1
ml muestra + 99 ml solución
fisiológica
1 ml10 – Poner en Placa Vertida.
Las placas se incuban por un período
de 24 a 48 h a 37°C
Se cuentan las UFC en la placa en que se
observen entre 30 y 300.
El número de UFC se multiplica por la
inversa de la dilución donde se realizó la
lectura.
Ej. 80 UFC x 104 ( de la dilución 10-4)
El resultado se expresa en
UFC / mLde muestra
Conteo por filtración
• Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en
• casos de lagos y arroyos relativamente puros.
• En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una
membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan
el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del
filtro.
• Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un
caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la
superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son
distintivas cuando ocupan un medio diferencial.

• Este método es aplicado frecuentemente en la detección y

enumeración de bacterias coliformes, las cuales son
indicadores de contaminación fecal en la comida o en el
agua.
 Método del número más probable (NMP)
• Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número
de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la
densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de
tubos de dilución.
• Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o
ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de
células.
• Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contados no
crecerán en medios sólidos, como en el caso de las bacterias nitrificantes
quimioautótrofas.
• También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido
diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes.
• El NMP es la única afirmación en la cual existe 95% de probabilidad que la
población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más
probable.
 Determinación directa por microscopio
• Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del
Método de Breed, colocando en la preparación un volumen conocido de
la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos.
Después de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un
microscopio las bacterias.
• Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células
en unos cuantos campos microscópicos seleccionados al azar.
• Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro objetivo,
se puede calcular fácilmente el área, entonces el número de campos en 1
cm² se multiplicará por el promedio del número de células por campo y
después por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será igual al número de
células por mililitro.
• Este método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de
uniformidad al momento de hacer el frote.
 Método de turbidez
• Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de
monitorizar el crecimiento bacteriano.
• Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las
células.
• El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro).
• En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un
detector sensible a la luz.
• Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio
en la luz se registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión.
• También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada
densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado.
• Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la primera señal de turbidez
sea visible.
• Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer
una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para
medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
 Determinación del peso seco en las células
• Determinación del peso seco en las células
• Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la
masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y
reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares
muy densas y las células deben ser lavadas muy bien para removerles
todo material extra.
• Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos.
• En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento,
filtrado para remover material extraño, drenado en un secador y
después es pesado.
 Camara de Petroff hausser ;fundamento
• Resultado de imagen para camara de petroff hausser fundamento
• El contador Petroff-Hausser es una construcción de una sola pieza
• Garantiza durabilidad y precisión, y presenta una resolución Neubauer
mejorada en una sola meseta.
• La cámara de conteo de Petroff-Hausser es popular para el conteo de
bacterias y espermatozoides.
https://www.youtube.com/watch?v=NXF9x0Q6NHc
PARTE EXPERIMENTAL
CAMARA DE NEUBAUER
 La cámara de Newbauer
Es un instrumento de vidrio que consta de una gruesa
placa de cristal con forma de portaobjetos de unos 30mm
x 70mm x 4mm de grosor.
Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el
número de partículas por unidad de volumen de un
líquido.
Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos,
bacterias, esporas, polen etc. se cuentan visualmente con
un microscopio. Las cámaras son instrumentos de
precisión para medición.
La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2.
Los 4 cuadrados grandes de las esquinas señalados con una "L" están divididos
en 16 cuadrados con aristas de 0,25 mm. Se utilizan para el recuento de
leucocitos.
El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos con aristas
de 0,2 mm estando cada cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados
pequeños con aristas de 0,05 mm y una superficie de 0,0025 mm2.
DIVISION CAMARA NEUBAUER
1 cuadrante lateral tiene
16 cuadrados
En total son 4 cuadrantes
laterales

1 cuadrante central tiene

25 cuadrados
Cada cuadrado esta
dividido en 16 (4x4)
cuadraditos
Microorganismos/ 1 mm3
Microorganismos/cm3
Microorganismos/ml
Largo 1 mm
Ancho 1 mm
Altura 0.1 mm
VOLUMEN: LxAxh
VOLUMEN : 1 X 1 X 0.1 mm3
0.1 mm3
NECESITO 1 FACTOR QUE COVIERTA 0.1 mm3 A 1 mm3
0.1 * F = 1
F = 10
Si tengo una muestra de agua la RPTA debo
darla en Microorganismos/ml
1 ml = 1 cm3
1 cm = 10 mm
1 cm3 = (10mm)3
FACTOR 10e3
Como realizar el conteo en los
cuadrantes laterales
 Voy a contar por ejemplo huevos de parásitos,
entonces lo hago en el cuadrante lateral
Ejemplo:
Cuadrante lateral I: 24
Cuadrante lateral II: 16
Cuadrante lateral III: 18
Cuadrante lateral IV: 22

Entonces debo sacar un promedio para hacer los

cálculos:
X = (24+ 16+ 18+ 22)/4
X = 20

Deseo saber cuantos huevos tengo por ml de

muestra

X = (20) * 10 * 1000
X = 2 * 10e5
Cuadrante central
Para realizar el conteo en el cuadrante central se escoge 5 cuadrados
Hay 2 maneras:
4 laterales y el del medio
Los 5 en diagonal
 Se aprecia las triples líneas que
El cuadrante central tiene separan los cuadrados
25 cuadrados Se observan las líneas simples
Cada cuadrado tiene 16 que separan los cuadraditos
cuadraditos

Como me doy cuenta que voy a

pasar de un cuadrado a otro
cuadrado?
Porque están separadas por triple
lineas

Como me doy cuenta que me

encuentro dentro de un
cuadrado?
Porque las líneas que lo separan
son simples delgadas
 EJERCICIO DE CONTEO EN CUADRANTE LATERAL

• CUADRANTE LATERAL I : 46
• CUADRANTE LATERAL II : 54
• CUADRANTE LATERAL III :62
• CUADRANTE LATERAL IV : 38
Debo obtener el PROMEDIO: X = 46+54+62+38/4 = 50
Microorganismos/mm3 = X * 10 me permite pasar de
0.1mm3 1 mm3

Microorganismos/1cm3 (X * 10) * 103 me permite pasar de

1 mm3 1 cm3
Microorganismos/1 cm3 = Microorganismos/ml

• 50 * 10 * 10e3
• 500000 = 5 *10e5 microorganismos/ml (se reporta 1 digito)
• MINIMA CANTIDAD MICROORGANISMOS QUE
DEBO TENER
• 1 * 10 * 10e3
• 1 *10e4
• Tengo 25 cuadrados
• Cada cuadrado tiene 16 cuadraditos
• Total 400 cuadraditos NO VOY A CONTAR TODOS

• Escoger cualquiera de las 2 maneras de escoger:

• 5 cuadrados (4Laterales +1central ) o (5 Diagonales)
• Cuadrado 1: 45
• Cuadrado 2: 55
• Cuadrado 3 : 64
• Cuadrado 4 36
• Cuadrado 5 50

Promedio = 45+55+64+36+50/5 = 50
TOTAL de microorg en 0.1 mm3 = 50 * 25
Microorgan/mm3 = (50 * 25) * 10
0.1mm3 voy a pasar a 1 mm3
Microorgan/1cm3 (50 * 25) * 10 * 10e3
1 mm3 voy a pasar a 1 cm3 • Respuesta: 1250 * 104 (expresar en 1 digito)
Microorgan/1 cm3 = Microorg/ml • Respuesta : 1.25 x 107 microorganismos/ml o
cme3
Si coloco la muestra y veo
que hay demasiados
microorganismos
DEBO realizar una dilución
A mi resultado debo
multiplicarlo por la dilución
respectiva
Puede ser 1/10, 1/20, 1/50,
1/100 etc
Los elementos están separados
y se puede contar sin dificultad
entonces la dilución es la
adecuada
 • Cuadrado 1: 45
• Tengo 25 cuadrados
• Cuadrado 2: 55
• Cada cuadrado tiene 16 cuadraditos
• Cuadrado 3 : 64
• Total 400 cuadraditos NO VOY A CONTAR TODOS
• Cuadrado 4 36
• Cuadrado 5 50
• Escoger cualquiera de las 2 maneras de escoger:
• 5 cuadrados (4Laterales +1central ) o (5 Diagonales)

• Respuesta: 1250 * 104 (expresar en 1 digito)

Promedio = 45+55+64+36+50/5 = 50 • Respuesta : 1.25 x 107 microorganismos/ml o
TOTAL de microorg/0.1 mm3 = 50 * 25 cm3
Microorgan/mm3 = (50 * 25) * 10
0.1mm3 1 mm3
Microorgan/1cm3 (50 * 25) * 10 * 10e3
1 mm3 1 cm3
Microorgan/1 cm3 = Microorg/ml
Del ejercicio anterior tenia como respuesta:
1.25 x 107 microorganismos/ml cm3

Muestra diluida:
Muestra pura : 20 ml
Suero fisiológico csp 2 lt

RECORDAR
Dilución= vol muestra/ vol
(muestra+diluyente)
Dilución= 20 ml /(2000ml)
Dilución = 1/100
Rpta * dilución RESPECTIVA
1.25*107 * 1/100
1.25 *105 MALO
RECORDAR
CUANDO DIGO DILUCION INVOLUCRA CUANTAS
VECES ESTA DILUIDA LA MUESTRA
EJEMPLO ES 1/100
QUIERE DECIR 100 VECES
POR ESO MULTIPLICO POR 100 Y NO POR 1/100

1.25*107 * 100
1.215 * 109 BIEN CORRECTO
Del ejercicio anterior tenia como respuesta:
1.25 x 107 microorganismos/ml cm3

Muestra diluida:
Muestra pura : |0 ml
Suero fisiológico 240 ml

RECORDAR
Dilución= vol muestra/ vol Rpta * dilución RESPECTIVA
(muestra+diluyente) 1.25*107 * 10/240
Dilución= 10 ml /(10+240ml) 1.25 *107* 1/24
Dilución = 10/250 30 *107
Dilución 1/25 3 * 108 MAL

Rpta * dilución RESPECTIVA

1.25*107 * 1/25 Rpta * dilución RESPECTIVA
1.25 *107* 25 1.25*107 * 1/25
31.25 *107 0.05 *107
3.125 *108 BIEN 5 *105 MAL
Preparación del inóculo según Escala de McFarland:
• Colocar en un tubo aproximadamente 2 a 3ml de suero fisiológicos,
agua destilada y caldo de cultivo
• Retirar colonias del medio de cultivo con una asa de kohle y
adicionar al tubo con el contenido líquido
• Homogenizar bien hasta que logre una turbidez semejante a la
turbidez de la escala de McFarland
• Preparar una Dilución de 1/10 (Ej: Colocar en un tubo 1.8 mL de
líquido y adicionar 200uL del inóculo con 10⁸ UFC/ml.
• Tomar una alícuota y realizar el conteo, luego utilizar el modelo
matemático para determinar la concentración microbiana.
Conteo en Cámara Neubauer:
• Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar una alícuota con una
pipeta Pasteur y colocar una gota cuidadosamente en la cámara de
Neubauer, debajo del cubreobjetos.
• Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio
• Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula
con el objetivo 10X. Al observar el cuadro central en el objetivo 40X,
éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros más
pequeños.
• Las células se cuantifican en el objetivo de 40X.
• En el caso demuestras muy concentradas, deberán hacerse
diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución (FD) debe
considerarse para cada dilución realizada:
 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE
MICRORGANISMOS POR CONTEO EN DIFERENTES
FORMAS.
Concentración / Recuento de microorganismos

En microbiología, la unidad formadora de colonias​​ es una unidad de medida que se

emplea para la cuantificación de microorganismos, es decir, para contabilizar el número
de bacterias o células fúngicas ​ viables en una muestra líquida o sólida.

UFC = Unidad Formadora de Colonias(en inglés: CFU-Colony Forming Units) es un término de la

microbiología.
Es una unidad de medida que se emplea para la cuantificación de microorganismos, es decir, para
contabilizar el número de bacterias o células fúngicas, viables en una muestra líquida o sólida.
Este valor, determinado por el número de colonias individuales, describe el número de células de
un organismo en el agua. Estos pueden ser bacterias u hongos que viven y se multiplican en el
agua.
MÉTODOS UTILIZADOS
Los métodos empleados para la valoración o recuento de microbios , se
clasifican en dos grandes grupos:
Cualitativos
Cuantitativos
Estos métodos se utilizan para detectar la posible presencia de ciertos patógenos
como Salmonella, Clostridium botulinum, Esc. Coli, Listeria monocytogenes, etc

METODOS CUANTITATIVOS:
Estructurados para determinar o calcular de manera directa o indirecta, la
carga microbiana del material analizado.
Directo E IndirectoEjm: Recuento de aerobios en placa de petriRecuento
de anaerobiosRecuento de microorganismos TermorresistenteConteo de
coliformesConteo de hongos y levaduras.
METODOS CUALITATIVOS
METODOS CUALITATIVOS PARA AISLAR
MICROORGANISMOS
Aislamiento de patógenos: determinar si una muestra
contiene o no, células o esporas viables de un
patógeno específico. (Salmonella, Listeria, Vibrio y
Shigella

1El proceso de aislamiento

Enriquecimiento previo no selectivo: reparar células

lesionadas o estresadas y proliferen hasta una cantidad
medible.
Enriquecimiento selectivo: proliferación del patógeno
específico y multiplicación abundante.
Diferenciación e identificación: desarrollo de colonias
características del patógeno y realización de pruebas
bioquímicas preliminares y serológicas confirmativas
METODOS CUANTITATIVOS
Estructurados para determinar o calcular de manera
directa o indirecta , la carga microbiana del material
analizado.
Ejm: Recuento de aerobios en placa de Petri
Recuento de anaerobios
Recuento de microorganismos Termorresistente
Conteo de coliformes
Conteo de hongos y levaduras. Etc.
METODOS CUANTITATIVOS: CONTEO DIRECTO
1.Microscopio de contraste de fase se evidencian células coloreadas. Reportar los resultados como
cuenta microscópica por ml ó g del producto. Se reporta como cuenta microscópica por ml o g del
producto.
DESVENTAJA :No se diferencia entre células vivas o muertas; no se puede realizan en los alimentos que
contienen partículas,
la muestra debe contener más de 106 microorganismos por ml o g.
Ahora es posible el conteo de bacterias vivas, Gram (+/-) por medio de fluorescencia.

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)

2. En medios de agar no selectivos: agar plate count, tripsina soya, agar nutritivo, agar cerebro
corazón.Ej: mesófilos aerobios 37°C 48h; Psicrotrófos 7°C 10 días y 10°C 7 días. Se cuenta el número
de colonias presentes.

En medios diferenciales no selectivos:

Adicionar componentes para diferenciar características que las hacen particulares. Ej: indicador de pH
púrpura de bromocresol, sustancias como fuente de carbono como la lactosa, yema de huevo.

El reporte de UFC estará enfocado en las manifestaciones microscópicas del grupo bacteriano.
En medio de agar selectivo: se agrega uno a mas inhibidores como antibióticos o sales donde sólo pueda
proliferar los microorganismos que sean resistentes a ellos.
CONTEO INDIRECTO
1. Diluciones hasta a extinción en caldos no selectivos:consiste en preparar
diluciones seriadas de una muestra y transferir 1ml o 0.1 a 10ml de un caldo final
no selectivo como el tripticasa soya.

2. Se examinan los tubos para observar si hubo proliferación bacteriana

según la turbidez del medio.
El reporte dependerá de la cantidad de microorganismos presentes a partir de la
máxima dilución de muestra con la que se produce multiplicación microbiana.
Ej: turbidez en la dilución 10-6= células por ml / g.

3. Prueba de reducción de colorantes : Basado en el principio que algunos

colorantes, como azul de metileno tiene un color en estado de oxidación, pero son
incoloros en estado de reducción (directamente proporcional con la carga
bacteriana del producto).

4. Conteo de grupos de microbios lesionados por medios selectivos:

En el caso de coliformes y células bacterianas patógenas con lesiones subletales,
los microorganismos pueden morir durante el conteo en medio de agar selectivo, ya
que desarrollan sensibilidad a los agentes agregados.
Recuento de bacterias
El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana.
Se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de
medida:
1. Cuenta celular (directamente al microscopio )
2. Contador electrónico de partículas (indirectamente con cuenta colonias),
3. Masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno) 4.
Indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células)
5. Por actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica
al tamaño de la población bacteriana).
6. Otros

6. Otros:
- recuento por plaqueo
 PETRIFILM PARA COLIFORMES , MESÓFILOS,
OTROS
La placa Petrifilm es un
Petrifilm comprende un sistema que se utiliza
agente gelificante soluble en en industrias para cultivar
agua fría, nutrientes e varios microorganismos es
indicadores de actividad y un método más eficiente
recuento. para la detección y
enumeración de bacterias
 RECUENTO DE BACTERIAS EN PLACA
• Una célula o un grupo de células
dará origen a una colonia luego de
la siembra e incubación.
• Por lo general se evalúan
muestras pequeñas y
representativas, por lo que se
pueden producir errores
(necesidad de repeticiones)
• Presencia de viables no cultivables
(pH, temperatura, tiempo, medio
de cultivo)
 SIEMBRA EN SUPERFICIE : METODO DE EXTENDIDO
EN PLACA
•
• Siembra en superficie
• La muestra se inocula
en la superficie de la
placa de Petri que
contiene el medio de
cultivo adecuado.
• Microorganismos
aerobios estrictos,
facultativos
 METODO DE VERTIDO EN PLACA

Siembra en placa vertida

• La muestra se inocula en
el fondo de la placa de
Petri estéril y vacía y luego
se vierte el medio de
cultivo adecuado.
• Microorganismos
aerobios facultativos y
anaerobios
aerotolerantes
 Recuento de Bacterias en Placa Por Diluciones
Conteo en placa de petri
Método más usado para contar bacterias.
Se prepara un caldo de cultivo, el cual posteriormente se vierte en las placas
de petri.
Dependiendo del tipo de sembrado, puede que la muestra se encuentre
incorporada en el agar (Pour method) o
puede que la muestra se disperse sobre el agar gelificado (Spread method).
Es de suponerse que cada célula o grupo de células presentes en la muestra se
reproducirá en sus múltiples alrededores para producir "colonias de células"
separadas en el agar.
Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC).
Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser así,
éstas pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango
sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias, otros dicen entre 30 -300
colonias)
El conteo se facilita utilizando un contador de colonias.
Este método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo células
vivas); en contraste con el conteo microscópico y el conteo de peso seco.
Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias, ya
que se necesitan como mínimo 24 horas o más.
 TÉCNICA DE DILUCIONES SERIADAS
Técnica de diluciones seriadas
Muestra líquida
9 ml sol fisiológica10 -310-4 10-5
10-6 1
ml muestra + 99 ml solución
fisiológica
1 ml10 – Poner en Placa Vertida.
Las placas se incuban por un período
de 24 a 48 h a 37°C
Se cuentan las UFC en la placa en que se
observen entre 30 y 300.
El número de UFC se multiplica por la
inversa de la dilución donde se realizó la
lectura.
Ej. 80 UFC x 104 ( de la dilución 10-4)
El resultado se expresa en
UFC / mLde muestra
Conteo por filtración
• Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en
casos de lagos y arroyos relativamente puros.
• En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una
membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan
el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del
filtro.
• Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un
caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la
superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son
distintivas cuando ocupan un medio diferencial.

• Este método es aplicado frecuentemente en la detección y

enumeración de bacterias coliformes, las cuales son
indicadores de contaminación fecal en la comida o en el
agua.
 Método del número más probable (NMP)
Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor
será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie
de tubos de dilución.
Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la
fermentación y da un estimado de número de células.
Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el caso
de las bacterias nitrificantes quimioautótrofas.
También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido diferencial, usado para identificar microbios,
como en bacterias coliformes.
El NMP es la única afirmación en la cual existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto,
siendo el número estadístico más probable.
 Determinación directa por microscopio
Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed, colocando en la preparación
un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y
teñido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias.
Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos microscópicos
seleccionados al azar.
Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro objetivo, se puede calcular fácilmente el área,
entonces el número de campos en 1 cm² se multiplicará por el promedio del número de células por campo y después
por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será igual al número de células por mililitro.
Este método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote.
 Método de turbidez
Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el
crecimiento bacteriano.
Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las células.
El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro).
En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un detector sensible a
la luz.
Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se
registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión.
También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un
valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado.
Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la primera señal de turbidez sea visible.
Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión
suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para medir contaminación en líquidos
por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
 Determinación del peso seco en
Determinación del peso seco en las células
las células
Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa
celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible,
aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y
las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material
extra.
Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos.
En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento,
filtrado para remover material extraño, drenado en un secador y
después es pesado.
 Camara de Petroff hausser ;fundamento
Resultado de imagen para camara de petroff hausser fundamento
El contador Petroff-Hausser es una construcción de una sola pieza
Garantiza durabilidad y precisión, y presenta una resolución Neubauer mejorada en una sola meseta.
La cámara de conteo de Petroff-Hausser es popular para el conteo de bacterias y espermatozoides.
https://www.youtube.com/watch?v=NXF9x0Q6NHc
PARTE EXPERIMENTAL
CAMARA DE NEUBAUER
 La cámara de Newbauer
Es un instrumento de vidrio que consta de una gruesa
placa de cristal con forma de portaobjetos de unos 30mm
x 70mm x 4mm de grosor.
Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el
número de partículas por unidad de volumen de un
líquido.
Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos,
bacterias, esporas, polen etc. se cuentan visualmente con
un microscopio. Las cámaras son instrumentos de
precisión para medición.
La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2.
Los 4 cuadrados grandes de las esquinas señalados con una "L" están divididos
en 16 cuadrados con aristas de 0,25 mm. Se utilizan para el recuento de
leucocitos.
El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos con aristas
de 0,2 mm estando cada cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados
pequeños con aristas de 0,05 mm y una superficie de 0,0025 mm2.
DIVISION CAMARA NEUBAUER
1 cuadrante lateral tiene
16 cuadrados
En total son 4 cuadrantes
laterales

1 cuadrante central tiene

25 cuadrados
Cada cuadrado esta
dividido en 16 (4x4)
cuadraditos
Microorganismos/ 1 mm3
Microorganismos/cm3
Microorganismos/ml
Largo 1 mm
Ancho 1 mm
Altura 0.1 mm
VOLUMEN: LxAxh
VOLUMEN : 1 X 1 X 0.1 mm3
0.1 mm3
NECESITO 1 FACTOR QUE COVIERTA 0.1 mm3 A 1 mm3
0.1 * F = 1
F = 10
Si tengo una muestra de agua la RPTA debo
darla en Microorganismos/ml
1 ml = 1 cm3
1 cm = 10 mm
1 cm3 = (10mm)3
FACTOR 10e3
Como realizar el conteo en los
cuadrantes laterales
 Voy a contar por ejemplo huevos de parásitos,
entonces lo hago en el cuadrante lateral
Ejemplo:
Cuadrante lateral I: 24
Cuadrante lateral II: 16
Cuadrante lateral III: 18
Cuadrante lateral IV: 22

Entonces debo sacar un promedio para hacer los

cálculos:
X = (24+ 16+ 18+ 22)/4
X = 20

Deseo saber cuantos huevos tengo por ml de

muestra

X = (20) * 10 * 1000
X = 2 * 10e5
Cuadrante central
Para realizar el conteo en el cuadrante central se escoge 5 cuadrados
Hay 2 maneras:
4 laterales y el del medio
Los 5 en diagonal
 Se aprecia las triples líneas que
El cuadrante central tiene separan los cuadrados
25 cuadrados Se observan las líneas simples
Cada cuadrado tiene 16 que separan los cuadraditos
cuadraditos

Como me doy cuenta que voy a

pasar de un cuadrado a otro
cuadrado?
Porque están separadas por triple
lineas

Como me doy cuenta que me

encuentro dentro de un
cuadrado?
Porque las líneas que lo separan
son simples delgadas
 EJERCICIO DE CONTEO EN CUADRANTE LATERAL

• CUADRANTE LATERAL I : 46
• CUADRANTE LATERAL II : 54
• CUADRANTE LATERAL III :62
• CUADRANTE LATERAL IV : 38
Debo obtener el PROMEDIO: X = 46+54+62+38/4 = 50
Microorganismos/mm3 = X * 10 me permite pasar de
0.1mm3 1 mm3

Microorganismos/1cm3 (X * 10) * 103 me permite pasar de

1 mm3 1 cm3
Microorganismos/1 cm3 = Microorganismos/ml

• 50 * 10 * 10e3
• 500000 = 5 *10e5 microorganismos/ml (se reporta 1 digito)
• MINIMA CANTIDAD MICROORGANISMOS QUE
DEBO TENER
• 1 * 10 * 10e3
• 1 *10e4
• Tengo 25 cuadrados
• Cada cuadrado tiene 16 cuadraditos
• Total 400 cuadraditos NO VOY A CONTAR TODOS

• Escoger cualquiera de las 2 maneras de escoger:

• 5 cuadrados (4Laterales +1central ) o (5 Diagonales)
• Cuadrado 1: 45
• Cuadrado 2: 55
• Cuadrado 3 : 64
• Cuadrado 4 36
• Cuadrado 5 50

Promedio = 45+55+64+36+50/5 = 50
TOTAL de microorg en 0.1 mm3 = 50 * 25
Microorgan/mm3 = (50 * 25) * 10
0.1mm3 voy a pasar a 1 mm3
Microorgan/1cm3 (50 * 25) * 10 * 10e3
1 mm3 voy a pasar a 1 cm3 • Respuesta: 1250 * 104 (expresar en 1 digito)
Microorgan/1 cm3 = Microorg/ml • Respuesta : 1.25 x 107 microorganismos/ml o
cme3
Si coloco la muestra y veo
que hay demasiados
microorganismos
DEBO realizar una dilución
A mi resultado debo
multiplicarlo por la dilución
respectiva
Puede ser 1/10, 1/20, 1/50,
1/100 etc
Los elementos están separados
y se puede contar sin dificultad
entonces la dilución es la
adecuada
 • Cuadrado 1: 45
• Tengo 25 cuadrados
• Cuadrado 2: 55
• Cada cuadrado tiene 16 cuadraditos
• Cuadrado 3 : 64
• Total 400 cuadraditos NO VOY A CONTAR TODOS
• Cuadrado 4 36
• Cuadrado 5 50
• Escoger cualquiera de las 2 maneras de escoger:
• 5 cuadrados (4Laterales +1central ) o (5 Diagonales)

• Respuesta: 1250 * 104 (expresar en 1 digito)

Promedio = 45+55+64+36+50/5 = 50 • Respuesta : 1.25 x 107 microorganismos/ml o
TOTAL de microorg/0.1 mm3 = 50 * 25 cm3
Microorgan/mm3 = (50 * 25) * 10
0.1mm3 1 mm3
Microorgan/1cm3 (50 * 25) * 10 * 10e3
1 mm3 1 cm3
Microorgan/1 cm3 = Microorg/ml
Del ejercicio anterior tenia como respuesta:
1.25 x 107 microorganismos/ml cm3

Muestra diluida:
Muestra pura : 20 ml
Suero fisiológico csp 2 lt

RECORDAR
Dilución= vol muestra/ vol
(muestra+diluyente)
Dilución= 20 ml /(2000ml)
Dilución = 1/100
Rpta * dilución RESPECTIVA
1.25*107 * 1/100
1.25 *105 MALO
RECORDAR
CUANDO DIGO DILUCION INVOLUCRA CUANTAS
VECES ESTA DILUIDA LA MUESTRA
EJEMPLO ES 1/100
QUIERE DECIR 100 VECES
POR ESO MULTIPLICO POR 100 Y NO POR 1/100

1.25*107 * 100
1.215 * 109 BIEN CORRECTO
Del ejercicio anterior tenia como respuesta:
1.25 x 107 microorganismos/ml cm3

Muestra diluida:
Muestra pura : |0 ml
Suero fisiológico 240 ml

RECORDAR
Dilución= vol muestra/ vol Rpta * dilución RESPECTIVA
(muestra+diluyente) 1.25*107 * 10/240
Dilución= 10 ml /(10+240ml) 1.25 *107* 1/24
Dilución = 10/250 30 *107
Dilución 1/25 3 * 108 MAL

Rpta * dilución RESPECTIVA

1.25*107 * 1/25 Rpta * dilución RESPECTIVA
1.25 *107* 25 1.25*107 * 1/25
31.25 *107 0.05 *107
3.125 *108 BIEN 5 *105 MAL
Preparación del inóculo según Escala de McFarland:
• Colocar en un tubo aproximadamente 2 a 3ml de suero fisiológicos,
agua destilada y caldo de cultivo
• Retirar colonias del medio de cultivo con una asa de kohle y
adicionar al tubo con el contenido líquido
• Homogenizar bien hasta que logre una turbidez semejante a la
turbidez de la escala de McFarland
• Preparar una Dilución de 1/10 (Ej: Colocar en un tubo 1.8 mL de
líquido y adicionar 200uL del inóculo con 10⁸ UFC/ml.
• Tomar una alícuota y realizar el conteo, luego utilizar el modelo
matemático para determinar la concentración microbiana.
Conteo en Cámara Neubauer:
• Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar una alícuota con una
pipeta Pasteur y colocar una gota cuidadosamente en la cámara de
Neubauer, debajo del cubreobjetos.
• Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio
• Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula
con el objetivo 10X. Al observar el cuadro central en el objetivo 40X,
éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros más
pequeños.
• Las células se cuantifican en el objetivo de 40X.
• En el caso demuestras muy concentradas, deberán hacerse
diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución (FD) debe
considerarse para cada dilución realizada: