es que sólo exige un medio adecuado; su desventaja es el tiempo necesario e97
e14 Diagnóstico de laboratorio
de las enfermedades infecciosas
Alexander J. McAdam, Andrew B. Onderdonk
Para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones es preciso demostrar di-
recta o indirectamente la presencia de elementos víricos, bacterianos, fúngi-
cos o parasitarios en los tejidos, líquidos o excreciones del hospedador. Los
laboratorios de microbiología clínica son los encargados de analizar estas
muestras, así como de averiguar la sensibilidad de las bacterias patógenas a los
antibióticos. Tradicionalmente, la detección de los microorganismos patóge-
nos dependía en gran parte de la observación microscópica de los gérmenes
en las muestras clínicas o de la proliferación de los microorganismos en el
laboratorio. La identificación se basaba generalmente en rasgos fenotípicos,
como los perfiles de fermentación de las bacterias, los efectos citopáticos de
los virus en los cultivos de tejidos y la morfología microscópica de los hongos
y parásitos. Estas técnicas son fidedignas pero a menudo demasiado lentas. El
uso de sondas de ácidos nucleicos se está convirtiendo en el método estándar
de detección e identificación en el laboratorio de microbiología clínica y ha ido
sustituyendo gradualmente a la caracterización fenotípica y a los métodos de
observación bajo el microscopio.
MÉTODOS DE DETECCIÓN
La reorganización de los métodos de laboratorio en microbiología clínica ha
llevado al establecimiento de estrategias destinadas a detectar a los microorga-
nismos patógenos por medio de la identificación de señales biológicas no vi-
suales. Gran parte de esta metodología se basa en la computadorización de los
sistemas de detección con ordenadores bastante baratos, aunque complejos, o
por medio de sondas de ácidos nucleicos dirigidos contra ciertos objetivos de
DNA o RNA. En este capítulo se describirán los métodos actualmente dispo-
nibles y los que están en estudio.
SEÑALES BIOLÓGICAS
Una señal biológica es un material que puede distinguirse de forma reprodu-
cible de otras sustancias que existen en el mismo ambiente físico. El problema
de las señales biológicas (y electrónicas) estriba en lograr distinguir entre la
verdadera señal y el ruido de fondo, así como en convertir la señal en una in-
formación significativa. Algunos ejemplos de señales biológicas aplicables a la
microbiología clínica son los componentes estructurales de bacterias, hongos
y virus; los antígenos específicos; los productos finales del metabolismo; las se-
cuencias de bases singulares de DNA o RNA; las enzimas; las toxinas y otras
proteínas; y los polisacáridos de superficie.
SISTEMAS DE DETECCIÓN
Para captar una señal y distinguirla del ruido de fondo se utiliza un detector.
Los sistemas de detección varían desde el ojo adiestrado de un técnico que
evalúa las variaciones morfológicas hasta los instrumentos electrónicos sen-
sibles, como los cromatógrafos de gas-líquido conectados a ordenadores para
el análisis de la señal. La sensibilidad con que se detectan las señales es muy
variable. Es fundamental utilizar un sistema de detección que distinga peque-
ñas porciones de la señal aunque exista ruido biológico de fondo, es decir, que
sea sensible y específico. Algunos sistemas de detección utilizados con regu-
laridad en microbiología son la inmunofluorescencia, la quimioluminiscencia
para las sondas de DNA/RNA, la ionización de llama para identificar ácidos
grasos de cadenas corta y larga y la detección de un sustrato o la formación de
un producto final en forma de cambios de color, de la actividad enzimática en
forma de cambios en la absorbancia de la luz, de cambios en la turbidez como
medida del crecimiento, de efectos citopáticos en líneas celulares y de la aglu-
tinación de partículas como medida de la presencia de antígenos.
AMPLIFICACIÓN
La amplificación aumenta la sensibilidad con la que se detectan las señales
débiles. La técnica de amplificación microbiológica más empleada es la pro-
liferación de una sola bacteria en una colonia aislada sobre una placa de agar
o en una suspensión donde abundan microorganismos idénticos. La ventaja
de la proliferación de los microorganismos como método de amplificación
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Harr-e_14.indd 97
para la amplificación. También se puede lograr una amplificación por medio
de la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) o
reacción en cadena de la ligasa ([ligase chain reaction, LCR], para DNA/RNA),
con enzimoinmunoanálisis ([enzyme immunoassays, EIA para antígenos y
anticuerpos), amplificación electrónica (para los análisis por cromatografía
gas-líquido), métodos de captación de anticuerpos (para la concentración o
separación) y filtración o centrifugación selectiva. Actualmente se están in-
vestigando varios métodos para amplificar y detectar las señales biológicas,
pero todavía es necesario evaluar su utilidad antes de aceptar su validez como
pruebas diagnósticas.
DETECCIÓN DIRECTA
MICROSCOPIA
El campo de la microbiología ha sido definido en gran parte por la creación y
el uso del microscopio. La observación de las muestras con métodos micros-
cópicos aporta información útil y rápida para el diagnóstico. Las técnicas de
tinción permiten ver los microorganismos con más claridad.
El estudio microscópico más sencillo es la preparación en fresco, que se
CAPÍTULO e14
utiliza en el examen de ciertas muestras como el líquido cefalorraquídeo
(LCR) para detectar Cryptococcus neoformans, con tinta china como fondo,
donde destacan las levaduras con sus grandes cápsulas. También se utilizan
preparaciones en fresco con iluminación en campo oscuro para descubrir es-
piroquetas en las lesiones genitales y para detectar Borrelia o Leptospira en
la sangre. Las muestras de piel obtenidas por raspado y las muestras de pelo
se examinan en frotis a los que se añade KOH al 10% o bien con el método
blanqueador del calciflúor y la luz ultravioleta para detectar hongos como es-
tructuras fluorescentes. Con frecuencia se utilizan preparaciones en fresco te-
Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas
ñidas, por ejemplo, con azul algodón lactofenol para identificar la morfología
de los hongos. Estas técnicas refuerzan las señales de detección y disminuyen
el fondo, lo que permite identificar con facilidad las estructuras específicas de
los hongos.
TINCIONES
Tinción de Gram Las bacterias difícilmente se pueden ver utilizando las am-
plificaciones normales (× 400 a 1 000) sin teñirlas previamente. Si bien es po-
sible utilizar tinciones sencillas o de un solo paso, es más frecuente recurrir
a las tinciones diferenciales. La tinción de Gram permite distinguir entre los
microorganismos con paredes gruesas de peptidoglucanos (grampositivos) y
los que tienen membranas exteriores que se disuelven con alcohol o acetona
(gramnegativos). La morfología celular y la tinción de Gram características
se utilizan a menudo para clasificar a los microorganismos teñidos en grupos
como estreptococos, estafilococos y clostridios (fig. e14-1).
La tinción de Gram es especialmente útil para examinar esputos y buscar
bacterias y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Las muestras de esputo con
25 o más PMN y menos de 10 células epiteliales por campo de pequeño au-
mento suelen proporcionar información clínica útil. En cambio, las muestras
de “esputo” con más de 10 células epiteliales por campo de pequeño aumento
y con bacterias de varios tipos indican contaminación con microflora bucal.
A pesar de la dificultad para distinguir entre la microflora normal y los mi-
croorganismos patógenos, la tinción de Gram es de gran utilidad en las mues-
tras procedentes de zonas con abundante flora saprofita teniendo a mano un
marcador (señal) biológico útil. La tinción de Gram de las muestras vaginales
sirve para identificar células epiteliales cubiertas por bacterias grampositivas
en ausencia de lactobacilos y la presencia de bacilos gramnegativos, escenario
que se considera un signo de vaginitis bacteriana. Igualmente, el examen de
muestras de heces fecales teñidas para identificar leucocitos es útil como prue-
ba de detección sistemática antes de buscar la toxina de Clostridium difficile u
otros microorganismos patógenos intestinales.
El examen del LCR y los líquidos articular, pleural o peritoneal utilizando
la tinción de Gram sirve para averiguar si existen bacterias, PMN o ambos.
Su sensibilidad es tal que permite detectar >104 bacterias/ml. Para concentrar
las muestras donde se sospecha una escasez de microorganismos se utiliza la
centrifugación antes de montar y teñir la preparación. Luego se examina el
sedimento una vez teñido. Este método tan sencillo es especialmente valioso
para detectar bacterias y leucocitos en el LCR o bacilos acidorresistentes (acid-
fast bacilli, AFB) en el esputo.
Tinción acidorresistente Esta tinción permite distinguir a los microorganis-
mos que absorben al colorante carbolfucsina después de tratarlo con un disol-
5/30/08 5:57:52 PM
 e98 Microorganismos gramnegativos a detectar. Los anticuerpos monoclona-
les o policlonales unidos a un indicador
Sólo GRx Oxidasa + Oxidasa – Exigente Anaerobio Curvo
(como las partículas de látex o una en-
Bacilos Pseudomonas Enterobacteriaceae Haemophilus Bacteroides Vibrio zima) se utilizan para detectar las reac-
Aeromonas Otras Legionella Prevotella Campylobacter ciones de unión entre el anticuerpo y el
Pasteurella Bordetella Fusobacterium antígeno.
Otros Brucella Otras Existen varias técnicas, como la aglu-
Francisella tinación directa de las células bacterianas
Otras
por anticuerpos específicos, que son sen-
Cocos Neisseria Veillonella cillas pero poco sensibles; en cambio, las
Branhamella Acidaminococcus técnicas de aglutinación con partículas de
Megasphaera látex y los enzimoinmunoanálisis son más
sensibles. Algunos antígenos incorpora-
Microorganismos grampositivos dos a las células, como los polisacáridos
Ramificadores Esporas Acidorresistentes Catalasa + Catalasa –
capsulares y los lipopolisacáridos, se de-
tectan por medio de la aglutinación que se
Bacilos Nocardia Clostridium Mycobacterium Corynebacterium Lactobacillus produce en una suspensión de células bac-
Actinomyces Bacillus Listeria Otras terianas al añadir el anticuerpo, método
Bifidobacterium Otras empleado para tipificar los antígenos so-
Cocos Staphylococcus Streptococcus
máticos de Shigella y Salmonella. En los sis-
Micrococcus temas como los EIA, que utilizan anticuer-
Otras pos unidos a una enzima, la reacción en-
PARTE 7

tre el antígeno y el anticuerpo da lugar a la

FIGURA e14-1. Interpretación de la tinción de Gram. conversión de un sustrato incoloro en un
producto teñido. Puesto que la unión de
una enzima con el anticuerpo puede am-
plificar una señal biológica débil, la sensi-
vente ácido/orgánico (p. ej., especies de Mycobacterium). Algunas modifica- bilidad de estos análisis suele ser alta. En cada caso, el fundamento de la de-
ciones de esta técnica también permiten distinguir a Actinomyces de Nocardia tección de antígeno es la unión del antígeno y el anticuerpo y el sistema
Enfermedades infecciosas

u otros microorganismos que son débil o parcialmente acidorresistentes. La de detección se modifica para que se acomode la señal biológica. Muchos de
tinción acidorresistente se emplea en esputos, otros líquidos y muestras de estos análisis sólo indican la presencia de antígeno en la muestra pero no de-
tejidos cuando se sospecha la presencia de bacilos acidorresistentes (p. ej., finen la cantidad del mismo. También se ha demostrado la utilidad de los EIA
especies de Mycobacterium). La identificación de estos bacilos teñidos en co- en la detección de toxinas bacterianas (p. ej., las toxinas A y B de C. difficile en
lor rosa/rojo sobre el fondo azul de la tinción de contraste exige un observa- las heces fecales).
dor experto, ya que aunque se amplifique la señal por medio de centrifugación En la clínica se pueden utilizar pruebas rápidas y simples para detectar an-
suelen ser pocos los microorganismos presentes en toda la preparación. tígenos de Streptococcus del grupo A, virus de la gripe y virus sincitial respira-
Otra opción es la tinción fluorescente con la combinación de auramina-ro- torio sin necesidad de recurrir a un laboratorio de diagnóstico especializado.
damina. Estas pruebas suelen tener una especificidad razonable pero una sensibilidad
moderada.
Tinciones fluorocrómicas Las tinciones fluorocrómicas, como el naranja de
acridina, se utilizan para identificar leucocitos, levaduras y bacterias en los
DETECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS PATÓGENOS
líquidos corporales. Para detectar Mycoplasma en cultivos celulares destina-
POR MEDIO DE CULTIVOS
dos para este fin se utilizan otras técnicas especiales, como la tinción de
Dappe. Para identificar o demostrar ciertas estructuras características se apli- OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
can tinciones especiales para cápsulas, flagelos y esporas. Para cultivar bacterias, hongos o virus patógenos la muestra correspondiente se
coloca en el medio idóneo para su proliferación (amplificación). El éxito de la
identificación de determinado microorganismo patógeno depende muchas ve-
Tinción inmunofluorescente La técnica de inmunofluorescencia directa utili- ces de la obtención y transporte de las muestras unido a un algoritmo de pro-
za anticuerpos unidos a un compuesto fluorescente, como la fluoresceína, que cedimiento del laboratorio idóneo para cada muestra o microorganismo. En
se dirigen contra un objetivo antigénico específico con el fin de observar mi- algunas ocasiones conviene sembrar la muestra en la placa en el momento de la
croorganismos o estructuras subcelulares. Cuando el examen se realiza en las obtención en lugar de transportarla inicialmente al laboratorio (p. ej., los hisopos
condiciones adecuadas, la sustancia fluorescente absorbe la luz ultravioleta y uretrales para los cultivos de Neisseria gonorrhoeae o las muestras de esputo para
la retransmite a una longitud de onda mayor (visible) que es captada por el ojo los neumococos). Por norma, cuanto antes se siembre la muestra en el medio de
humano. En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, un anticuerpo sin cultivo correspondiente mayores serán las probabilidades de aislar a las bacterias
marcar (objetivo) se une a un antígeno específico. A continuación la muestra patógenas. Es más probable obtener un resultado útil del cultivo cuando la mues-
se tiñe con anticuerpos policlonales marcados con fluoresceína que se dirigen tra proviene de un tejido profundo o de un líquido (pus) que cuando se obtiene
contra el anticuerpo objetivo. Puesto que cada anticuerpo objetivo sin mar- de exudados superficiales. En el cuadro e14-1 aparecen los procedimientos de
car unido a su correspondiente antígeno posee numerosos sitios para unirse obtención y transporte de las muestras más habituales. Existen numerosos ejem-
al segundo anticuerpo, la señal visual se puede intensificar (amplificación). plos de estas técnicas que son específicas para cada microorganismo patógeno,
Esta clase de tinción se denomina indirecta porque utiliza un sistema de dos de manera que es importante solicitar asesoramiento al laboratorio de microbio-
anticuerpos para generar la señal que permite detectar el antígeno. Estos logía en caso de duda sobre una situación determinada.
dos métodos de fluorescencia, directo e indirecto, detectan las inclusiones
víricas (p. ej., citomegalovirus, virus del herpes simple y virus respiratorios)
dentro de las células en cultivo, así como muchas bacterias de crecimiento SEPARACIÓN DE LAS BACTERIAS PATÓGENAS
lento (p, ej., Legionella pneumophila) directamente en muestras clínicas. Para separar a los microorganismos patógenos sospechosos en las muestras
clínicas se utilizan medios artificiales para conservar in vitro la proliferación
de las bacterias. Los medios de cultivo constan de agar, que no es metaboli-
DETECCIÓN MACROSCÓPICA DE LOS ANTÍGENOS zado por las bacterias, de nutrientes que favorecen la proliferación de las es-
Los análisis de aglutinación con látex y los enzimoinmunoanálisis (EIA) son pecies microbianas que interesan y de sustancias que inhiben la proliferación
métodos rápidos y baratos que permiten identificar microorganismos, toxi- de otros microorganismos. Cuando las muestras contienen pocas bacterias,
nas extracelulares y virus utilizando proteínas o polisacáridos antigénicos. como sucede con los líquidos de la diálisis peritoneal o el LCR, o cuando se
Estos análisis se llevan a cabo de manera directa, sobre muestras clínicas, bien trata de muestras que pueden contener anaerobios y otros microorganismos
después de dejarlos proliferar en placas de agar o en cultivos celulares para exigentes, se emplea un caldo de cultivo (amplificación). No merece la pena
virus. En cada uno de estos casos la señal biológica es el antígeno que se va utilizar en forma generalizada un medio líquido para todas las muestras.

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 CUADRO e14-1 INSTRUCCIONES PARA OBTENER Y TRANSPORTAR LAS MUESTRAS PARA CULTIVO
Nota: es absolutamente indispensable que el laboratorio de microbiología sea informado del sitio de origen de la muestra a cultivar y de las infecciones que se
sospechan. Esta información define la selección de los medios de cultivo y la duración del cultivo.
Tipo de cultivo
(sinónimos)
Sangre
Sangre, sistemático
(hemocultivo para
aerobios, anaerobios
y hongos)
Sangre para hongos/
Mycobacterium spp
Sangre, Isolator (centri-
fugación por lisis)
Vías respiratorias
Nariz
Garganta
Esputo
Aspirados bronquiales
Heces fecales
Coprocultivo sistemático:
Salmonella, Shigella y
Campylobacter
Heces para Yersinia,
E. coli O157
Heces para
Aeromonas
y Plesiomonas
Aparato urogenital
Orina
Secreciones urogenitales
Líquidos corporales, aspirados y tejidos
Líquido cefalorraquídeo Líquido cefalorraquídeo
(punción lumbar)
Líquidos corporales Líquidos corporales aspirados con
Biopsia y materiales
aspirados
Harr-e_14.indd 99
Muestra
Sangre completa
Sangre completa
Sangre completa
Exudado de las fosas nasales
Exudado del tercio posterior de la
faringe, de úlceras o de zonas
con sospecha de purulencia
Esputo fresco (no saliva)
Aspirado transtraqueal, muestra
obtenida por broncoscopia o
aspirado bronquial
Exudado rectal o (de preferencia)
heces frescas obtenidas al azar
Heces frescas obtenidas al azar
Heces frescas obtenidas al azar
Muestra de orina por micción
limpia o sonda
Secreciones vaginales o uretrales,
exudado cervical, líquido uteri-
no, líquido prostático, etc.
técnica aséptica
Tejido extraído en una cirugía,
hueso, médula ósea anticoa-
gulada, muestras de biopsia
u otras muestras de zonas
normalmente estériles
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Volumen mínimo
10 ml en cada uno de 2 frascos
para adultos y niños; 5 ml, si es
posible, en frascos aeróbicos para
lactantes; menos para neonatos
10 ml en cada uno de 2 frascos
para hemocultivo sistemático o
en tubo Isolator que se solicita
previamente al laboratorio
10 ml
Una muestra
Una muestra
2 ml
1 ml de aspirado o cepillado en
medio de transporte
1 g de heces fecales o 2 muestras
rectales
1g
1g
0.5 ml
Una muestra o 0.5 ml de líquido
1 ml para cultivos sistemáticos;
≥5 ml para Mycobacterium
1 ml para cultivos sistemáticos
1 ml de líquido o un trozo de tejido
de 1 g
Contenedor
Véase más adelantea
Igual que para el hemocultivo
sistemático
Tubos Isolator
Torunda estéril o sistema similar de
obtención de muestras con medio
de mantenimiento
Sistema estéril para cultivo o sistema
similar para recolectar muestras
con hisopo con medio de mante-
nimiento
Sistema comercial para obtener espu-
tos o contenedor estéril similar con
tapón de rosca
Aspirado estéril o tubo de broncosco-
pia, cepillo de broncoscopia en un
recipiente estéril separado
Vaso de cartón revestido de plástico o
vaso de plástico con tapa que ajus-
te bien. También son aceptables
otros recipientes herméticos
Vaso de cartón revestido de plástico
o vaso de plástico con tapa que
ajuste bien
Vaso de cartón revestido de plástico
o vaso de plástico con tapa que
ajuste bien
Recipiente hermético estéril con ta-
pón de rosca o tubo especial para
el transporte de orina
Muestras vaginales y rectales transpor- No se deben utilizar muestras vaginales
tadas en medio de Amies o medio
de mantenimiento similar para
Streptococcus del grupo B; para
Neisseria gonorrhoeae se prefiere la
inoculación directa
Tubo estéril con tapa que ajuste bien
Tubo estéril con tapa que ajuste bien. Para algunos líquidos corporales (p.
La muestra se puede dejar en
la jeringa utilizada para la toma
siempre y cuando se tape antes del
transporte
Escobillón del tipo “torunda” estéril o Es fundamental identificar con
sistema de transporte similar que
contenga medio de mantenimien-
to. Para muestras de tejidos se
utiliza un frasco estéril
e99
Otras consideraciones
Véase más adelanteb
Especificar “mantener para incubación
prolongada” ya que los hongos pue-
den tardar ≥4 semanas en crecer
Usado principalmente para el ais-
lamiento de hongos, Mycobacte-
rium y otros aerobios difíciles de
cultivar y para eliminar antibióticos
de la sangre cultivada en la que se
han concentrado los microorganis-
mos por la centrifugación
CAPÍTULO e14
Se pueden utilizar hisopos elaborados
con alginato cálcico
Véase más adelantec
Causa de rechazo: se debe tener cuida-
do para comprobar que la muestra
es esputo y no saliva. En ocasiones,
Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas
la tinción de Gram anotando el
número de células epiteliales y de
PMN forma parte importante de la
evaluación. No se deben rechazar
muestras de esputo provocado.
Algunas veces se requieren precaucio-
nes especiales dependiendo de las
consideraciones diagnósticas (p. ej.,
Pneumocystis)
Si se sospechan de Vibrio spp el labora-
torio debe ser notificado y se deben
utilizar los métodos adecuados de
obtención y transporte
Limitaciones: el procedimiento necesita
técnicas de enriquecimiento
Limitaciones: no se deben cultivar las
heces para esos microorganismos,
a menos que se cultiven también
para otros microorganismos
intestinales
Véase más adelanted
para “cultivo de rutina” a menos que
se sospeche un microorganismo
específico. Para la detección de
múltiples organismos (p. ej., Strep-
tococcus del grupo B, Trichomonas,
Chlamydia o Candida spp) se debe
utilizar un hisopo por prueba
No refrigerar; transportar al laboratorio
lo antes posible
ej., muestras de lavado peritoneal)
un mayor volumen ayuda a aislar
pequeñas cantidades de bacterias
precisión la muestra y su origen.
Se debe obtener tejido suficiente
para los estudios microbiológico y
anatomopatológico
(Continúa)
5/30/08 5:57:57 PM
e100 CUADRO e14-1 INSTRUCCIONES PARA OBTENER Y TRANSPORTAR LAS MUESTRAS PARA CULTIVO (CONTINUACIÓN)
Tipo de cultivo
(sinónimos) Muestra Volumen mínimo Contenedor Otras consideraciones
Heridas Material purulento o contenido de 2 escobillas o 0.5 ml de pus aspirado Torunda o medio de transporte similar Obtención: siempre que sea posible
abscesos obtenidos de heridas o tubo estéril con tapón de rosca se debe recoger el contenido del
o abscesos sin contaminación que ajuste bien. Para cultivos anae- absceso u otros líquidos con una je-
por la microflora normal robios se envía simultáneamente ringa (mejor que con un escobillón)
una muestra en un dispositivo para para obtener un volumen suficiente
transporte de anaerobios o una y un ambiente anaerobio
jeringa cerrada
Recomendaciones especiales
Hongos Se pueden utilizar las muestras 1 ml o como se especificó previa- Contenedor estéril a prueba de fugas Obtención: la muestra debe ser
antes mencionadas. Cuando mente en el listado individual de con tarpón que ajuste bien transportada al laboratorio de
se cultiva orina o esputo en muestras. Para hongos en orina microbiología en la hora siguiente a
busca de hongos es preferible se utilizan grandes volúmenes su obtención. Debe evitarse la con-
utilizar la primera muestra de taminación con la flora normal de la
la mañana piel, recto, vagina u otras superficies
corporales
Mycobacterium (bacilos Esputo, tejidos, orina, líquidos 10 ml de líquido o un trozo pequeño Contenedor hermético estéril con La detección de Mycobacterium spp.
acidorresistentes) corporales de tejido. No se deben utilizar tapón que ajuste bien mejora usando técnicas de con-
escobillas centración. Las muestras y cultivos
de líquidos pleural, peritoneal y
pericárdico son con frecuencia
poco productivas. Se recomien-
dan cultivos múltiples del mismo
PARTE 7

paciente. Los cultivos en medios

líquidos acortan el tiempo hasta la
detección
Legionella Líquido pleural, biopsia pulmonar, 1 ml de líquido; una muestra de teji- — —
líquido de lavado bronco- do de cualquier tamaño, aunque
alveolar, biopsia bronquial o siempre que sea posible se debe
transbronquial. Es fundamen- obtener una muestra de 0.5 g
tal transportarla rápidamente al
laboratorio
Enfermedades infecciosas

Anaerobios Muestras aspiradas de abscesos o 1 ml de líquido aspirado, 1 g de Se necesita un dispositivo adecuado Las muestras cultivadas para anaero-
de líquidos corporales tejido o 2 escobillas para transporte de anaerobiose bios obligados también se deben
cultivar para bacterias facultativas.
Se prefieren líquidos o tejidos más
que escobillones
Virusf Secreciones respiratorias, aspi- 1 ml de líquido, 1 escobilla o 1 g de El líquido o las muestras de heces se La mayor parte de las muestras
rados de lavados de las vías heces fecales en cada medio de almacenan en contenedores es- para cultivo es transportada en
respiratorias, muestras nasales, transporte correspondiente tériles o sistemas de torunda para medios de mantenimiento que
muestras de sangre (incluso la virus (mantener en hielo, pero no contienen antibióticos para evitar el
capa leucocítica), muestras va- congelar). Las muestras de plasma crecimiento bacteriano excesivo y
ginales y rectales, muestras de y las capas leucocíticas en los tubos la inactivación vírica. Muchas mues-
lesiones cutáneas sospechosas, de obtención deben permanecer tras deben permanecer refrigeradas,
muestras de heces fecales (en a una temperatura de 4-8°C. Si las pero no congeladas, siempre que
algunos casos) muestras han de enviarse o con- se transporten rápidamente al
servarse durante mucho tiempo, se laboratorio. Los procedimientos y
recomienda congelarlas a –80°C. medios de transporte varían según
el microorganismo a cultivar y la
duración del transporte
a Para muestras de adultos se utilizan dos frascos (más pequeños para pacientes pediátricos): uno ción de Streptococcus spp hemolítico beta y otros microorganismos potencialmente patógenos.
con fosfato de dextrosa, soja tripticada u otro caldo apropiado y la otra con tioglicolato o con otro Si bien se les considera parte de la microflora normal, microorganismos como Staphylococcus
caldo que contenga sustancias reductoras adecuadas para el aislamiento de anaerobios obligados. aureus, Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, la mayor parte de los laboratorios los
En los niños que permiten la obtención de una cantidad pequeña de sangre, sólo se realiza un identifica si se solicita. Ante la sospecha de Neisseria gonorrhoeae o de Corynebacterium diphtheriae
cultivo para anaerobios, a menos que exista la sospecha específica de sepsis por anaerobios (p. ej., se recomienda solicitar un cultivo especial.
con infecciones abdominales). Para situaciones especiales (p. ej., sospecha de infecciones fúngicas, d 1) Muestras de orina obtenidas por toma limpia, muestras de mitad de la micción y muestras ob-
endocarditis con cultivos negativos o micobacteriemia) se pueden utilizar sistemas distintos para tenidas con sonda de Foley que dan ≥50 000 microorganismos/ml y en las que no se aíslan más de
obtener la sangre (sistemas Isolator; véase cuadro). tres especies, se deben identificar los microorganismos. No se deben cultivar las puntas de las son-
b Obtención: se debe utilizar una técnica desinfectante adecuada en el tapón del frasco y en el das ni la orina que se almacena en la bolsa de los pacientes con sonda. 2) Las muestras obtenidas
paciente. No se debe permitir que penetren burbujas de aire en los frascos con caldo para anae- por sonda, punción vesical y similares deben ser sometidas a un estudio completo (identificación y
robios. Consideraciones especiales: no existe prueba microbiológica clínica más importante que la estudio de la sensibilidad) de todos los microorganismos potencialmente patógenos, sin importar
detección de microorganismos patógenos en la sangre. La supervivencia del paciente depende de el recuento de colonias. 3) Algunos problemas clínicos (p. ej., disuria aguda en mujeres) justifican la
la identificación rápida de las bacterias y hongos. Las bacterias pueden permanecer en la sangre identificación y el estudio de la sensibilidad de las colonias presentes a concentraciones de
continuamente (como en la endocarditis, sepsis masiva y las fases iniciales de la salmonelosis y <50 000 microorganismos/mililitro.
brucelosis) o de forma intermitente (como en la mayor parte de las demás infecciones bacterianas e Las muestras obtenidas por medio de aspiración y contenidas en jeringas tapadas u otros disposi-
en las que las bacterias son liberadas hacia la sangre de manera esporádica). La mayor parte de los tivos para transporte diseñados para reducir su contacto con el oxígeno son adecuadas para el
sistemas de hemocultivo utiliza dos frascos con medio de caldo: uno se ventila en el laboratorio cultivo de anaerobios estrictos. Es posible utilizar diversos dispositivos comerciales para el
para el crecimiento de microorganismos aerobios y facultativos y otro permanece en condiciones transporte. Se debe evitar la contaminación de las muestras con la microflora normal de la piel,
anaerobias. Cuando existe sospecha de bacteriemia o fungemia continua se deben obtener dos o recto, vagina y otras zonas corporales. Asimismo es importante rechazar, por inapropiados, los con-
tres muestras antes de iniciar el tratamiento, tomando muestras adicionales si se cree que están im- tenedores para cultivo aerobio (como escobillones secos) y muestras inadecuadas (como muestras
plicados microorganismos de cultivo difícil. En caso de bacteriemia intermitente se deben obtener refrigeradas, esputo expectorado, heces, aspirados gástricos y escobillones con muestras vaginales,
dos o tres muestras a intervalos de 1 h durante las primeras 24 horas. faríngeas, nasales y rectales).
c La microflora normal comprende estreptococo hemolítico alfa, Neisseria spp. saprofita, difteroides f Los laboratorios suelen usar distintos métodos para la detección de virus y se deben comprobar
y Staphylococcus spp. El cultivo aerobio de faringe (“sistemático”) incluye el cribado y la identifica- los requisitos específicos para cada muestra antes de enviarla.

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 e101
Microorganismo infeccioso sospechoso Obténgase la muestra adecuada

Muestra bacteriológica para Muestra micológica: tinción Muestra para virología:

diagnóstico rápido o métodos con fluorocromo para cultivo celular o métodos
sistemáticos de cultivo para hongos en tejidos, cabellos y serológicos; las muestras
microorganismos comunes y raspados cutáneos; cultivo e comprenden capa leucocítica,
de cultivo difícil identificación de colonias de suero, sangre, lavado
hongos de sangre y LCR bronquial, heces, orina
Diagnóstico rápido: aglutinación Amplificación de DNA/RNA
con látex para Cryptococcus; para Chlamydia, GC, TB;
Preparación de la Examinar cultivos celulares en
sondas directas de DNA/RNA; tinción directa para microor-
muestra: cultivo en busca de CPE; serología para
tinción de Gram para exudados ganismos infecciosos como
medio de Sabouraud y detectar anticuerpos en los
bronquiales o vaginales Legionella o Pneumocystis
otros: tinción con azul sueros de casos agudos y de
algodón de lactofenol u convalecientes; DFA rápidos
Heces fecales: tinción de Sangre: especificar el otras; gota pendiente siempre que sea posible
Orina, heridas, tejidos o
Gram para leucocitos esputo: especificar el sitio sitio y momento de la
fecales; agar selectivo para y método de obtención; obtención; utilizar
Evaluar la morfología Inmunofluorescencia
microorganismos comunes; preparar muestra para cultivos de Isolator
microscópica; pruebas de para virus en cultivos;
medios especializados cultivo; utlizar agar para hongos y
asimilación de sustratos; otros métodos de
para otros gérmenes enriquecido y selectivo Mycobacterium

Evaluación de MacConkey,
HE, BAP, Tergitol para
microorganismos patógenos;
serogrupo de Salmonella,
Shigella; medios especiali-
zados para otros patógenos
Evaluación de MacConkey,
BAP y agar chocolate para
microorganismos patógenos;
medio líquido para
microorganismos difíciles de
cultivar; tinción de Gram u
otras pruebas rápidas
CAPÍTULO e14
examen de esporulación del identificación como
medio; utilizar otras pruebas sondas directas de
Medio líquido aeróbico según corresponda (serología) DNA/RNA
y anaeróbico; cultivar
en agar chocolate o
7H10 para TB; otros Pruebas de Pruebas de carga
medios enriquecidos sensibilidad para vírica: para CMV, VIH,
para HACEK hongos cuando sea HepC; amplificación
necesario detectar de DNA/RNA para
resistencia genotipo

Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas

C. difficile: Aislamiento e Anaerobios: tinción Aislamiento a partir de un
cultivo identificación de los de Gram, prueba subcultivo; identificación de
celular o EIA microorganismos de esporas y GLC; microorganismos patógenos;
para toxinas patógenos; pruebas de perfil de fermen- realización de pruebas de
AyB sensibilidad; notificar tación para la sensibilidad; notificar MRSA,
MRSA, VREF, ESBL identificación VREF, ESBL

FIGURA e14-2. Algoritmo utilizado en los laboratorios de microbiología clí-
nica para examinar las muestras más comunes. Abreviaturas: BAP, placa de
agar en sangre (blood agar plate); CMV, citomegalovirus; CPE, efectos citopáticos
(cytopathic effects); LCR, líquido cefalorraquídeo; DFA, anticuerpo de fluorescencia
directa (direct fluorescent antibody); EIA, inmunoanálisis enzimático; ESBL, lactamasa
beta de amplio espectro (extended-spectrum β-lactamase); GBS, Streptococcus del
grupo B (group B Streptococcus); GC, Neisseria gonorrhoeae; GLC, cromatografía gas-
líquido (gas-liquid chromatography); HACEK, Haemophilus aphrophilus/parainfluen-
zae/paraphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium homi-
nis, Eikenella corrodens y Kingella kingae; HE, medio intestinal de Hektoen (Hektoen
enteric medium); HepC, virus de la hepatitis C; VIH, virus de la inmunodeficiencia
humana; MRSA, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (methicillin-resistant
Staphylococcus aureus); TB, Mycobacterium tuberculosis; VREF, Enterococcus faecium
resistente a vancomicina (vancomycin-resistant Enterococcus faecium).

Existen fundamentalmente dos estrategias para aislar las bacterias pató-
genas. En la primera se utilizan medios enriquecidos que favorecen la pro-
liferación de cualquier bacteria que pueda contener la muestra de sangre o
LCR, que normalmente no contienen bacterias. Los caldos que permiten la
proliferación de unos cuantos microorganismos se transfieren a un medio só-
lido en cuanto se observa que existe proliferación. La segunda estrategia se
aplica para aislar (amplificar) ciertas especies bacterianas en las heces fecales,
las secreciones del aparato genital o los esputos, que en circunstancias norma-
les contienen numerosas bacterias. Para ello se añaden al agar antimicrobia-
nos u otras sustancias inhibidoras que impiden la proliferación de todas las
bacterias, salvo la que interesa. Tras la incubación, los microorganismos que
han proliferado en esos medios se clasifican para averiguar si son patógenos
o no. La separación de los microorganismos potencialmente patógenos de los
que forman parte de la microflora normal abrevia el tiempo necesario para
establecer el diagnóstico (fig. e14-2).
SEPARACIÓN DE LOS VIRUS
(Véase también el cap. 170.) Los virus patógenos a menudo se cultivan cuan-
do la presencia de anticuerpos séricos no constituye un criterio de infección
activa o cuando no se detecta elevación de los anticuerpos séricos durante la
infección. La señal biológica, es decir, el virus, se amplifica de tal manera que
permita su detección. Aunque existen varias técnicas, el elemento esencial es
un cultivo en una sola capa de células de mamífero sensibles a la infección
por el virus patógeno sospechoso. Estas células sirven como sistema de am-
plificación para que proliferen las partículas víricas. Los virus se detectan por
observación directa de las células cultivadas, buscando los efectos citopáti-
cos o por la detección inmunofluorescente de los antígenos víricos después
de la incubación. El cultivo convencional de virus es útil para identificar a
los microorganismos que se propagan rápidamente, como el virus del herpes
simple. Los virus que crecen más lentamente (p. ej., citomegalovirus y virus de
varicela-zoster) se identifican con rapidez por el método de centrifugación y
cultivo, en el que la muestra es centrifugada en una sola capa de células que
luego es incubada durante uno o dos días y, por último, teñida con anticuerpos
conjugados con fluorocromo en busca de antígenos víricos.
AUTOMATIZACIÓN DE LA DETECCIÓN MICROBIANA EN SANGRE
En la sangre es difícil detectar la proliferación bacteriana puesto que el nú-
mero de microorganismos existentes es limitado y su integridad y potencial
reproductivo se alteran a causa de los mecanismos de defensa humoral o los
antimicrobianos. Con los años, los sistemas basados en la detección de gas
(por lo general CO2) producido por las bacterias y las levaduras en los medios
para hemocultivo han permitido automatizar el procedimiento de detección.
Los sistemas más utilizados comprenden: 1) medir la presión del gas en el es-
pacio libre superior que indica la producción o el consumo de gas bacteriano o
2) el uso de reflectancia óptica con un diodo que emite luz y un fotodiodo que
se utiliza para detectar un cambio en el color de un indicador sensible al CO2
construido en el fondo del recipiente para cultivo. Estos sistemas miden la con-
centración del CO2 como indicador de la proliferación microbiana. Estos mé-
todos no son más sensibles que el ojo humano para descubrir un cultivo posi-
tivo pero, puesto que los recipientes de los sistemas automatizados se vigilan
con más frecuencia, permiten descubrir con más rapidez que las técnicas ma-
nuales los cultivos positivos y, por consiguiente, obtener más pronto la infor-
mación importante, como el resultado de la tinción de Gram y de las pruebas
de sensibilidad preliminares. Una de las ventajas de los sistemas automatiza-
dos para el hemocultivo es que los recipientes se someten continuamente a

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e102 un rastreo incruento, reduciendo así la probabilidad de contaminación en el
laboratorio.
Varios factores repercuten sobre el rendimiento del hemocultivo en los pa-
cientes bacteriémicos. Aumentando el volumen de sangre analizada aumenta
la probabilidad de un cultivo positivo. Un aumento de 10 a 20 ml de sangre
aumenta la proporción de cultivos positivos aproximadamente 30%; sin em-
bargo, este efecto es menos pronunciado en pacientes con endocarditis bacte-
riana. La obtención de múltiples cultivos (hasta tres en 24 h) también aumenta
la probabilidad de detectar un patógeno bacteriano. Con los sistemas automa-
tizados de hemocultivo no se necesitan cultivos prolongados ni subcultivos a
ciegas para detectar las bacterias más difíciles de cultivar (p. ej., Haemophilus,
Actinobacillus, Cardiobacterium, Eikenella y especies de Kingella).
Los sistemas automatizados también han servido para detectar la prolife-
ración de los microorganismos en muestras distintas de la sangre, como el
líquido peritoneal y otros líquidos que normalmente son estériles. Las espe-
cies de Mycobacterium también pueden detectarse en ciertos sistemas auto-
matizados usando métodos líquidos adecuados para su cultivo. Aunque los
sistemas automatizados de hemocultivo son más sensibles que los métodos
de lisis-centrifugación (Isolator) para hongos y para la mayoría de las bacte-
rias, se recomienda cultivo de lisis-centrifugación para hongos filamentosos,
Histoplasma capsulatum y para bacterias de difícil cultivo (Legionella y Bar-
tonella).
PARTE 7
DETECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS PATÓGENOS
POR MÉTODOS SEROLÓGICOS
La determinación de los anticuerpos séricos es un marcador indirecto de una
infección, anterior o presente, por virus específicos o por otros microorganis-
mos patógenos como Brucella, Legionella, Rickettsia y Helicobacter pylori. La
Enfermedades infecciosas
señal biológica suele ser el anticuerpo IgM o IgG dirigido contra los antígenos
expresados en las superficies de los microorganismos. Los sistemas de detec-
ción son iguales a los utilizados para los antígenos bacterianos (reacciones de
aglutinación, inmunofluorescencia y EIA), además de otros sistemas de de-
tección exclusivos, como son la inhibición de la hemólisis y la fijación del
complemento. Los métodos serológicos se dividen, en general, en dos grupos:
las pruebas para determinar las concentraciones de anticuerpos protectores
y las pruebas para medir los cambios de los títulos de anticuerpos, durante
la infección. La comprobación de una respuesta de anticuerpos como medi-
da de la inmunidad actual es importante en las infecciones por ciertos virus
para los que existen vacunas, como los de la rubéola o el herpes zoster; con
esta finalidad, suelen utilizarse una o dos diluciones del suero para la determi-
nación cualitativa de la concentración de anticuerpos protectores. Los análisis
serológicos cuantitativos que detectan una elevación del título de anticuerpos
suelen emplear parejas de sueros extraídas con 10 a 14 días de diferencia (fase
aguda y fase de convalecencia). Como el periodo de incubación previo a la
aparición de los síntomas puede ser lo bastante largo como para que la res-
puesta de anticuerpos haya tenido lugar, la demostración de anticuerpos so-
lamente en la fase aguda no suele ser suficiente para confirmar el diagnóstico
de infección activa frente a una exposición anterior. En esos casos, puede ser
útil el hallazgo de IgM como signo de una respuesta de anticuerpos precoz.
Una cuadruplicación del título total de anticuerpos o de la actividad de la EIA
entre las muestras de la fase aguda y de la convalecencia también se considera
prueba de infección activa.
Los anticuerpos que se producen contra ciertos virus, como el virus de Eps-
tein-Barr, pueden dirigirse contra distintos antígenos en las diferentes fases
de la infección. Por esta razón, casi todos los laboratorios realizan pruebas o
análisis de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la cápside vírica y
contra los antígenos asociados a las células del hospedador infectadas recien-
temente, con el fin de determinar la fase de la infección.
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
Una vez que se ha aislado una bacteria, las características fácilmente detecta-
bles tras el crecimiento en medio de agar (tamaño de las colonias, color, reac-
ciones hemolíticas, olor, aspecto microscópico) pueden sugerir una especie,
pero la identificación definitiva necesita pruebas adicionales. Los métodos de
identificación incluyen la determinación del fenotipo bioquímico clásico, que
sigue siendo el más común, y métodos más sofisticados, como la cromatogra-
fía de gases y las sondas de ácidos nucleicos.
FENOTIPIFICACIÓN CLÁSICA
La identificación fenotípica clásica de las bacterias implica pruebas de antíge-
nos proteicos o de hidratos de carbono, la producción de enzimas específicas,
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la capacidad de metabolizar sustratos específicos y fuentes de carbono (como
hidratos de carbono) o la producción de determinados metabolitos. Se dispo-
ne de versiones rápidas de algunas de estas pruebas y muchos microorganis-
mos frecuentes pueden ser identificados el primer día de cultivo. Otros micro-
organismos, en especial las bacterias gramnegativas, necesitan un análisis más
extenso, manual o automatizado.
Los sistemas automatizados permiten realizar una identificación fenotípica
rápida de las bacterias patógenas. Casi todos estos sistemas se basan en téc-
nicas de biotipificación, en las que los microorganismos aislados se cultivan
en diversos sustratos y el patrón de sus reacciones se compara con el patrón
conocido de varias especies bacterianas. Es un procedimiento bastante rápido
y los sistemas comercializados comprenden un sistema de fermentación en
miniatura, un sistema de codificación que simplifica el registro de los resul-
tados y los cálculos de probabilidad de los microorganismos patógenos más
probables. Si la biotipificación es automatizada y el proceso de lectura se co-
necta con un análisis de datos realizado por ordenador es posible identificar a
los microorganismos de proliferación rápida, como Enterobacteriaceae, a las
pocas horas de su detección en las placas de agar.
Existen varios sistemas que utilizan enzimas preformadas para acelerar la
identificación y realizarla en un plazo de 2 o 3 h. Estos sistemas no se basan
en la proliferación bacteriana propiamente dicha para averiguar si se ha utili-
zado o no un sustrato. En su lugar, emplean un inóculo abundante en el que
existen enzimas bacterianas específicas en cantidad suficiente para convertir
rápidamente al sustrato en otro producto final. Además, algunos sistemas usan
métodos de detección que producen fluorescencia del sustrato/producto final
y que aumentan así la sensibilidad (mediante amplificación de la señal).
CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO
La cromatografía gas-líquido se utiliza para detectar los productos metabólicos
finales de las fermentaciones bacterianas. Esta técnica se usa a menudo para
identificar los ácidos grasos de cadena corta producidos por los anaerobios
estrictos durante la fermentación de la glucosa. Puesto que las clases de ácidos
volátiles y sus concentraciones relativas difieren según los distintos géneros
y especies que componen a este grupo de microorganismos, esta información
es como una “huella dactilar” de su metabolismo y permite identificar a un
determinado microorganismo o especie microbiana.
La cromatografía gas-líquido también se puede conectar a un ordenador
que analiza la señal y permite identificar y medir la cantidad de ácidos gra-
sos de cadena larga (long-chain fatty acids, LCFA) de las membranas externas
y las paredes celulares de las bacterias y hongos. La clase y la concentración
relativa de LCFA es lo suficientemente específica como para permitir identifi-
car especies incluso muy afines. La identificación definitiva se logra en pocas
horas después de conseguir que el microorganismo prolifere en los medios
adecuados. El análisis de los LCFA es una de las técnicas más avanzadas de
caracterización fenotípica que existen en la actualidad.
SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Las técnicas para detectar y medir las secuencias de bases específicas de DNA
y de RNA se han convertido en un potente instrumento para el diagnóstico
de las infecciones bacterianas, víricas, parasitarias y fúngicas. Las sondas de
ácidos nucleicos se utilizan para cuatro fines. Primero, para detectar y a ve-
ces computar, microorganismos patógenos específicos en muestras clínicas.
Segundo, para identificar microorganismos (por lo general bacterias) que son
difíciles de reconocer con los métodos convencionales. Tercero, para deter-
minar si dos o más colonias del mismo microorganismo están íntimamente
relacionadas (pertenecen al mismo “clon” o “cepa”). Por último se utilizan
para predecir la sensibilidad de los microorganismos (típicamente virus) a los
fármacos. La tecnología actual abarca una amplia variedad de métodos para
amplificar y detectar señales, algunos de los cuales han sido aprobados por la
Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos para su aplicación en
el diagnóstico clínico.
Las pruebas de ácidos nucleicos implican la lisis de células o virus íntegros
y la desnaturalización del DNA o RNA para hacerlos monocatenarios. Las
sondas o cebadores complementarios a la secuencia diana específica del mi-
croorganismo patógeno pueden ser hibridados con la secuencia diana en una
solución o en un soporte sólido, dependiendo del sistema empleado. También
es posible realizar la hibridación in situ de una sonda a un blanco o diana y
permite el uso de sondas con microorganismos presentes en muestras de teji-
dos. Una vez que la sonda o el cebador ha sido hibridado con la diana (señal
biológica) se pueden utilizar diversas estrategias para detectar, amplificar o
medir el complejo diana-sonda (fig. e14-3).
5/30/08 5:58:01 PM

Lisis
Extracción
Residuos
Calor
Detección Amplificación
directa de la diana
ssDNA/RNA ssDNA/RNA
Hibridar
Sonda
Sonda
e indicador
Calor
Hibridar
Extensión de
la cadena
complementaria
20-30 ciclos
Detección
Detección
FIGURA e14-3. Estrategias para la amplificación o detección del complejo
diana-sonda. El DNA o el RNA extraído de los microorganismos se calienta para
crear cadenas únicas (single strand, ss) de DNA/RNA que contienen las secuencias
diana adecuadas. Estas secuencias diana pueden hibridarse directamente (detec-
ción directa) con sondas unidas a moléculas indicadoras; también se pueden am-
plificar por medio de ciclos repetidos de extensión de la cadena complementaria
(reacción en cadena de la polimerasa) antes de unirse a la sonda indicadora; o la
Sondas para la detección de microorganismos patógenos en muestras clíni-
cas Las sondas de ácidos nucleicos se utilizan para la detección directa de
microorganismos patógenos en muestras clínicas sin amplificación de la ca-
dena diana de DNA o RNA. Tales pruebas detectan una secuencia relativa-
mente corta de bases específicas para determinado microorganismo en DNA
o RNA monocatenarios por hibridación de una secuencia complementaria de
bases (sonda) unida a un sistema “indicador” que sirve como señal de detec-
ción. Existen sondas de ácidos nucleicos disponibles en el comercio para la
detección directa de varias bacterias y parásitos como Chlamydia trachomatis,
N. gonorrhoeae y Streptococcus del grupo A. También se ha autorizado una
prueba combinada para la detección y diferenciación de microorganismos que
causan vaginitis o vaginosis (Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis y
especies de Candida). Se dispone de una variedad de sondas para confirmar
la identidad de microorganismos patógenos cultivados, incluyendo algunos
hongos dimórficos, especies de Mycobacterium y otras bacterias (p. ej., espe-
cies de Campylobacter, Streptococcus y Staphylococcus aureus). Las sondas para
la detección directa de las bacterias patógenas suelen estar dirigidas a secuen-
cias de RNA ribosómico de 16S muy conservadas, de las que existen muchas
más copias que de cualquier secuencia aislada de DNA genómico en una cé-
lula bacteriana. La sensibilidad y la especificidad del análisis con sondas para
la detección directa son comparables a las de los métodos más tradicionales,
como el EIA y los cultivos.
En otro análisis de sondas llamado captura de híbridos, una sonda de RNA
se templa con una diana de DNA y el híbrido DNA/RNA resultante es cap-
turado sobre un soporte sólido por anticuerpos específicos para los híbridos
DNA/RNA (concentración/amplificación) y detectado por anticuerpos es-
pecíficos para los híbridos DNA/RNA marcados con quimioluminiscencia.
Existen pruebas de captura de híbridos para C. trachomatis, N. gonorrhoeae,
citomegalovirus y papilomavirus humano.
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Célula intacta e103
(como DNA/RNA)
DNA/RNA
ss
DNA/RNA
Amplificación Captura
de la señal híbrida
ssDNA/RNA ssRNA
Sonda de DNA
Sonda (bDNA)
Hibridar
Hibridar
Híbrido DNA/RNA
Soporte sólido
CAPÍTULO e14
Captura de anticuerpos
Indicador
Anticuerpo
e indicador
Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas
Detección Detección
señal diana-sonda original puede amplificarse por medio de hibridación con una
sonda adicional que contenga múltiples copias de una secuencia diana indicadora
secundaria (DNA de cadena ramificada o bDNA). Los híbridos de DNA/RNA también
pueden ser “capturados” en un soporte sólido (captura de híbridos) con anticuerpos
dirigidos contra los híbridos de DNA/RNA para concentrarlos y un segundo anti-
cuerpo unido a una molécula indicadora fijada al híbrido capturado.
Muchos laboratorios preparan sus propias sondas para detectar microor-
ganismos patógenos; sin embargo, salvo que se haya establecido un protocolo
de validación del método que justifique su uso diagnóstico, la legislación de
Estados Unidos limita la utilización de estas sondas al campo de la investi-
gación.
Estrategias con pruebas de amplificación de ácidos nucleicos En teoría, una
sola secuencia del ácido nucleico diana puede ser amplificada a niveles identi-
ficables. Existen varias estrategias para las pruebas de amplificación de ácidos
nucleicos (nucleic acid amplification tests, NAAT), como PCR, LCR, amplifi-
cación y desplazamiento de cadena y multiplicación autosostenida de secuen-
cias. En cada caso, la amplificación exponencial de una secuencia de DNA o
RNA específica para el microorganismo patógeno depende de cebadores que
se templan a la secuencia diana. El ácido nucleico amplificado se detecta una
vez que la reacción concluye (detección de tiempo real) a medida que la am-
plificación avanza. La PCR, que es la primera y más utilizada NAAT, requiere
del calentamiento repetido del DNA para separar las dos cadenas comple-
mentarias de la doble hélice, la hibridación de una secuencia cebadora a la
secuencia diana adecuada, la amplificación de la diana usando la PCR para
la extensión complementaria de la cadena y la detección de la señal por medio
de una sonda marcada. Los métodos para vigilar la PCR después de cada ciclo
de amplificación (incorporando colorantes fluorescentes en el DNA durante la
extensión del cebador o utilizando sondas fluorescentes capaces de transferir
energía de resonancia fluorescente) han reducido el periodo necesario para
detectar una diana específica. La sensibilidad de estos análisis es muy superior
a la de los métodos tradicionales como el cultivo. Sin embargo, es importante
llevar a cabo los estudios con detalle puesto que la contaminación cruzada
(incluso a un nivel muy bajo) del material clínico con DNA o RNA de otras
fuentes origina resultados positivos falsos. Un método alternativo consiste en
5/30/08 5:58:02 PM
e104 utilizar la amplificación a través de la transcripción, en la cual una secuencia
diana de RNA es convertida a DNA, el cual posteriormente se transcribe ex-
ponencialmente al RNA diana. La ventaja de este método es que para realizar
la amplificación sólo se necesita un paso de calentamiento/alineación. Actual-
mente existen en el mercado pruebas de amplificación para Mycobacterium
tuberculosis, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, Mycoplasma hominis, Streptococ-
cus del grupo B y S. aureus resistente a la meticilina. Una vez más, muchos
laboratorios han utilizado polimerasa taq comercial, secuencias con sondas y
reactivos específicos para cada analito (analyte-specific reagents, ASR) para de-
sarrollar análisis de desarrollo interno con fines de diagnóstico. Los aspectos
relacionados con el control de calidad, la interpretación de los resultados, la
transformación de las muestras y los requisitos de regulación han retrasado el
desarrollo comercial de muchos equipos de análisis diagnósticos.
La identificación de bacterias por lo demás difíciles de cultivar implica la
amplificación inicial de una región del rDNA 16S por medio de una PCR. Pos-
teriormente se lleva a cabo la secuenciación automatizada de varios cientos de
bases y la información de la secuencia se compara con grandes bases de datos
que contienen información de la secuencia de miles de microorganismos dife-
rentes. Aunque la secuenciación de 16S no es tan rápida como otros métodos
y todavía es relativamente cara como para utilizarla en forma sistemática en el
laboratorio de microbiología clínica, se está convirtiendo en el método defini-
tivo para identificar microorganismos raros o difíciles de cultivar.
PARTE 7
Estrategias con pruebas cuantitativas de ácidos nucleicos Con la llegada de
nuevas pautas terapéuticas para las enfermedades que causa el VIH, la infec-
ción por citomegalovirus y las hepatitis B y C, se ha vigilado la respuesta al
tratamiento determinando el genotipo y la “carga vírica” en varios momentos
después del inicio del tratamiento. Se dispone de NAAT cuantitativos para
Enfermedades infecciosas
VIH (PCR), citomegalovirus (PCR), hepatitis B (PCR) y hepatitis C (PCR y
amplificación mediada por la transcripción [transcription-mediated amplifi-
cation, TMA]). Muchos laboratorios han validado y realizan pruebas cuanti-
tativas para esos microorganismos y para otros (p. ej., virus de Epstein-Barr)
utilizando ASR para la prueba de amplificación de ácido nucleico.
La prueba del DNA de cadena ramificada (branched-chain DNA, bDNA) es
una alternativa a las NAAT para el análisis cuantitativo de los ácidos nucleicos.
En estas pruebas el bDNA se une a un sitio diferente de la secuencia desti-
nataria de unión de la sonda original. Posteriormente, los oligonucleótidos
marcados por medio de quimioluminiscencia se unen a múltiples secuencias
repetidas en el bDNA. La señal amplificada del bDNA es detectada por qui-
mioluminiscencia. La FDA ya autorizó las pruebas de bDNA para la carga
vírica de VIH, virus de hepatitis B y virus de hepatitis C. La ventaja del bDNA
sobre la PCR es que sólo se necesita un paso de calentamiento/templado para
hibridar la sonda con la secuencia diana para la amplificación.
Aplicación de las pruebas de ácidos nucleicos Además de las aplicaciones ya
comentadas, las pruebas de ácidos nucleicos se utilizan para detectar e identi-
ficar bacterias patógenas de crecimiento difícil o imposibles de cultivar, como
Mycobacterium, Legionella, Ehrlichia, Rickettsia, Babesia, Borrelia y Trophery-
ma whippelii. Además, se han elaborado métodos para la detección rápida de
microorganismos importantes para la salud pública, como Bacillus anthracis,
virus de la viruela y Yersinia pestis.
Las pruebas de ácidos nucleicos también se utilizan para definir la relación
existente entre diferentes colonias de la misma especie de microorganismo.
El hecho de demostrar que bacterias de un solo clon han infectado a múlti-
ples pacientes en el contexto de un posible medio de transmisión (p. ej., un
profesional médico) ofrece evidencia confirmatoria de un brote. La electro-
foresis en gel de campo pulsado sigue siendo el método de referencia habi-
tual para analizar las cepas bacterianas. En este método se utilizan enzimas
de restricción que reconocen secuencias raras de nucleótidos para digerir el
DNA bacteriano, produciendo grandes fragmentos de DNA. Estos fragmentos
son separados por electroforesis en gel con polaridad variable de la corriente
electroforética y posteriormente se observan. Las bandas con patrones simi-
lares (diferencias de tres bandas o menos) sugieren que diferentes colonias
bacterianas están íntimamente relacionadas o son clonales. Otros métodos
más sencillos para tipificar las cepas son la secuenciación de uno o múltiples
genes y la amplificación basada en PCR de las secuencias repetitivas de DNA
del cromosoma bacteriano.
Las aplicaciones futuras del estudio de los ácidos nucleicos probablemente
comprenderán la sustitución del cultivo para identificar a muchos microor-
ganismos por medio de técnicas que utilizan chips de DNA/RNA en estado
sólido en las que es posible detectar miles de secuencias únicas de ácidos nu-
cleicos en un solo chip de silicio.
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD BACTERIANA
Una de las principales responsabilidades del laboratorio de microbiología es
descubrir los antimicrobianos que inhiben a una bacteria específica aislada.
Estas pruebas se utilizan para identificar en forma sistemática los problemas
para moderar las infecciones, como las producidas por Staphylococcus aureus
resistente a la meticilina o Enterococcus faecium resistente a la vancomicina.
Para ello se utilizan dos métodos. El primero consiste en aplicar una técnica
cualitativa de sensibilidad que permite clasificar al microorganismo en sensible,
resistente o intermedio. Este método se lleva a cabo colocando discos de papel
impregnados con antibióticos en una superficie de agar donde se ha inoculado
la cepa bacteriana cuya sensibilidad se investiga (método de Kirby-Bauer o
de la difusión en disco/agar) y midiendo la zona de proliferación inhibida tras
un periodo de incubación o utilizando tubos que contienen caldo y una serie
de concentraciones del antibiótico (método del punto de ruptura). Estos mé-
todos han sido cuidadosamente calibrados frente a los métodos cuantitativos
y a la experiencia clínica obtenida con cada antibiótico y se han calculado las
zonas de inhibición y los puntos de ruptura para cada especie.
El segundo método consiste en inocular la cepa bacteriana de prueba en
una serie de tubos con caldo (o en placas con agar) con concentraciones cre-
cientes de antibiótico. La concentración menor del antibiótico que inhibe la
proliferación bacteriana en este sistema se conoce como concentración inhi-
bitoria mínima (minimum inhibitory concentration, MIC). Si los tubos en los
que no se observa crecimiento se cultivan de nuevo también es posible definir
la concentración mínima necesaria de antibiótico para aniquilar a 99.9% del
inóculo inicial (concentración bactericida mínima [minimum bactericidal con-
centration, MBC]). Los valores de la MIC permiten clasificar al microorganis-
mo como sensible, resistente o intermedio, por lo que es mucho más usada que
la MBC. Las pruebas cuantitativas de sensibilidad que emplean las técnicas de
dilución en microcaldo, una versión en miniatura de la dilución en caldo utili-
zando microplacas, se prestan a la automatización y habitualmente se utilizan
en los grandes laboratorios clínicos.
Una nueva versión del método de difusión en disco/agar que emplea un
gradiente de difusión cuantitativa, o epsilómetro (prueba E), es la que utiliza
una tira absorbente con un gradiente conocido de concentraciones de anti-
biótico a lo largo de ella. Cuando esta tira se coloca en la superficie de una
placa de agar en la que se siembra la cepa bacteriana que se desea investigar, el
antibiótico difunde en el medio e inhibe el crecimiento bacteriano. La MIC se
calcula como la menor concentración que inhibe el crecimiento.
Las pruebas sistemáticas de sensibilidad no suelen llevarse a cabo para al-
gunos microorganismos, como los anaerobios estrictos, a causa de la dificul-
tad que plantea la proliferación de estos microorganismos y a que la sensi-
bilidad de la mayor parte de estos gérmenes a determinados antibióticos es
predecible.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD DE HONGOS
Gracias al advenimiento de numerosos fármacos nuevos para el tratamien-
to de las infecciones generalizadas por levaduras y hongos, ha aumentado la
necesidad de analizar las cepas individuales para definir su sensibilidad a los
antimicóticos específicos. En el pasado, pocos laboratorios participaban en
este tipo de análisis por la falta de métodos estándar como los que se utilizan
para los análisis bacterianos. Sin embargo, actualmente existen varios méto-
dos para analizar la sensibilidad de los hongos. Estos métodos, que definen
la concentración fungicida mínima (minimal fungicidal concentration, MFC),
son similares a los métodos de microdilución en caldo utilizados para definir
la MIC de las bacterias. El método de la prueba E está aprobado para anali-
zar la sensibilidad de los hongos a fluconazol, itraconazol y flucitosina y la di-
fusión en disco se utiliza para probar la sensibilidad de las especies de Candida
al fluconazol y voriconazol. Los métodos para definir la MFC contra hongos
como las especies de Aspergillus son técnicamente difíciles y la mayor parte de
los laboratorios envía estos estudios a los laboratorios de referencia.
PRUEBAS ANTIVÍRICAS
Véase el capítulo 170.
LECTURAS ADICIONALES
Aires de Sousa M, de Lencastre H: Bridges from hospitals to the labora-
tory: Genetic portraits of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clo-
nes. FEMS Immunol Med Microbiol 40:101, 2004
Baron EJ et al: Prolonged incubation and extensive subculturing do not in-
crease recovery of clinically significant microorganisms from standard au-
tomated blood cultures. Clin Infect Dis 41:1677, 2005
5/30/08 5:58:03 PM
 Caliendo AM et al: Distinguishing cytomegalovirus (CMV) infection and
disease with CMV nucleic acid assays. J Clin Microbiol 40:1581, 2002
Cockerhill FR et al: Optimal testing parameters for blood cultures. Clin In-
fect Dis 38:1724, 2004
Domiati-Saad R, Scheuermann RH: Nucleic acid testing for viral burden
and viral genotyping. Clin Chim Acta 363:197, 2005
Magiorakos AP, Hadley S: Impact of real-time fungal susceptibility on cli-
nical practices. Curr Opin Infect Dis 17:511, 2004
Pancholi P et al: Rapid detection of cytomegalovirus infection in transplant
patients. Expert Rev Mol Diagn 4:231, 2004
Copyright © 2008 The McGraw-Hill Companies. Todos los derechos reservados.
Harr-e_14.indd 105
Pfaller MA et al: Clinical evaluation of a frozen commercially prepared mi- e105
crodilution panel for antifungal susceptibility testing of seven antifungal
agents, including the new triazoles posaconazole, ravuconazole and vorico-
nazole. J Clin Microbiol 40:1694, 2002
Servoss JC, Friedman LS: Serologic and molecular diagnosis of hepatitis B
virus. Clin Liver Dis 8:267, 2004
Yeghiazarian T et al: Quantitation of human immunodeficiency virus type
1 RNA levels in plasma by using small-volume-format branched-DNA
assays. J Clin Microbiol 36:2096, 1998
CAPÍTULO e14
Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas
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