RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO POR

EL MÉTODO DE BREED

INTEGRANTES
- Castañeda Bulnes Claudia romina
- Corra Soto José Ángel
- Herna Castro Victor Augusto
- Rojas Cruz Emerson Andres
- Valencia Ugaz Johan Jose
 INTRODUCCIÓN

- Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células

microbianas, por observación directa en el microscopio. Se basa en contar
microorganismos en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados y
se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES).

- El método de Breed es un método de recuento directo bastante simple, fácil y eficaz a

pesar de ser un método antiguo (1911). Este método de Conteo Directo al Microscopio
(CMD) es usado mayoritariamente para el diagnóstico microbiológico de la leche y se
lo considera un método rápido para estimar el grado de contaminación bacteriano de
la leche.

- El método de Breed también es usado para diagnóstico de mastitis bovina

(diagnóstico subclínico).
 ENTEROBACTERIAS

Cada vez es más frecuente recurrir a la determinación de microorganismos indicadores para determinar la
inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una serie de requisitos:
❖ fácil y rápido de detectar
❖ fácilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento
❖ tener antecedentes de asociación con el patógeno del que es indicador
❖ ser un microorganismos con cifras, que en teoría coincidan con las del patógeno a indicar
❖ tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patógeno
❖ tener una tasa de muerte paralela a del patógeno y que persista algún tiempo más que este
❖ no existir en alimentos exentos del patógeno, salvo en cantidades mínimas
Actualmente se reconocen 29 géneros de enterobacterias, que incluyen más de 100 especies diferentes. El 99% de los
aislamientos clínicos pertenecen únicamente a 23 especies.

E. coli Shigella Salmonella

El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación fecal, y como uno de los
indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza como indicador de la calidad microbiológica de
alimentos procesados, y recuentos elevados señalan una elaboración inadecuada o una contaminación posterior,
o ambas cosas a la vez; siempre implica un riesgo higiénico-sanitario
 Métodos normalizados
ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificación, de las Enterobacteriaceae. Técnica del
NMP y método por recuento de colonias

Esta directiva expone dos métodos para el recuento de enterobacterias:

❖ El primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminación baja
(1 – 100 por mililitro o gramo de muestra).
❖ Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentración, una cantidad determinada de la muestra
problema si la muestra es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos.
❖ Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de concentración simple con la primera
dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre.
❖ Los tubos se incuban a 35º C ó 37º C (según acuerdo) durante 24 horas.
❖ A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de Enterobacteriaceae por
mililitro o por gramo de muestra de ensayo mediante la tabla NMP.
El segundo método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta
glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el
producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros
productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la
muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C ó 37º C durante 24
horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de
muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de
Petri
 MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular

contiene quitina y βglucanos. Son unicelulares o filamentosos,
de reproducción sexual o asexual, saprófitos mutualistas o
parásitos.

En función de la temperatura de crecimiento se dividen en:

- termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C)

- termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C

- mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C) - psicrófilos: por debajo de

10º C (por debajo de 20º C)
 MOHOS Y LEVADURAS HABITUALMENTE TRANSMITIDO POR
ALIMENTOS

Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre e incluso reacciones alérgicas. Además, muchos mohos
producen gran número de toxinas a las que el hombre es susceptible.
El estudio de los mohos productores de
micotoxinas ha sido bastante completo debido a:
- la ubicuidad de sus esporas - que pueden estar
presentes en alimentos organolepticamente
aceptables - que los alimentos constituyen un
sustrato orgánico adecuado para su crecimiento.
Estos mohos producen micotoxinas que al ser
ingeridas por los animales originan metabolitos
tóxicos secundarios, que pasan a la leche, carne o
huevos y son absorbidos indirectamente por el
hombre - al riesgo cancerígeno, sobre todo de las
aflatoxinas
 Métodos normalizados
ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enumeración de las
colonias a 25º C

▪ Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo determinado,

en dos placas de Petri.
▪ En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la
suspensión madre.
▪ Incubación de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días.
▪ Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra a partir del
número de colonias obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un
resultado significativo.
 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO TOTAL DE BACTERIAS

El procedimiento del contaje del número total de bacterias en placas provee un método normalizado para la determinación de
la densidad de bacterias heterotróficas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. Este es un método aproximado debido a
que las bacterias se presentan en forma: unitaria, en pares, cadenas, racimos, o en paquetes; además, el medio o el conjunto
de condiciones físicas y químicas no pueden satisfacer los requerimientos de todas las bacterias en una muestra de agua,
consecuentemente, el número de colonias que se desarrollan por cm3 de muestra puede ser sustancialmente más bajo que el
número real de bacterias viables presentes.
Además, algunas bacterias, a causa de daños, requerimiento de nutrientes especiales, reacción con el oxígeno, temperaturas
desfavorables de incubación u otros factores, son incapaces de formar colonias visibles bajo las condiciones

empleadas.

Para facilitar la toma de datos reales para el control de calidad del agua, especialmente con fines de compa- ración y
propósitos legales, es esencial contar con un método normalizado para la "determinación del número total de bacterias en
placa". El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por
diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o
mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa
pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad
celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana). Existen muchos
medios diferenciales, en la práctica rutinaria se usan los siguientes:
a) Cuando se desea cuantificar el número de
bacterias presentes en múltiples muestras, los
procedimientos de rutina suelen consumir mucho
tiempo.
En ese periodo las muestras podrían sufrir
modificaciones en su población.
En el presente trabajo se evaluó una metodología
alternativa para cuantificar bacterias cultivables de
forma masiva, rápida y económica en la que se
implica el sellado, estampado o impresión de
diluciones seriadas de muestras de diversa
procedencia.
El tiempo requerido para preparar 22 muestras para
su sellado en placa es de 15 minutos. El método se
basó en realizar diluciones seriadas (base 10) de las
muestras líquidas originales contenidas en una placa
multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal.
Después, con un replicador se tomó un volumen
(aproximadamente 1,65 µl) de muestra de cada
pozo, que se inoculó por sellado en un medio de
crecimiento gelificado de interés.
Las placas se incubaron el tiempo necesario, se
contó el número de colonias presentes en la
dilución contable y se calculó el número de
Unidades Formadoras de Colonia por mililitro
(UFC/ ml) para cada muestra.
La metodología se denominó “Goteo por Sellado en
Placa Masivo” (GSPM) y ha sido aplicada para
cuantificar exitosamente bacterias provenientes de
diferentes muestras de laboratorio, por ejemplo, de
cultivos líquidos, muestras clínicas (como
exudados y secreciones) y bacterias presentes en la
rizósfera de plantas de maíz. Sin embargo, la
metodología GSPM podría aplicarse para
contabilizar masivamente a bacterias de cualquier
otra procedencia.
b) Distintas han sido las estrategias para
contabilizar a los microorganismos cultivables en
muestras ambientales y de laboratorio; las cuales
presentan ventajas y desventajas.
El conteo de bacterias podría realizarse mediante el
método del Número Más Probable (NPM), éste es
útil para contabilizar bacterias que son difíciles de
aislar de una muestra, pero que pueden ser
detectadas por la actividad de alguna característica
metabólica.
Por ejemplo el conteo de las especies bacterianas
que son capaces de captar nitrógeno atmosférico,
bajo condiciones microaerofílicas (Cabildante y
Döbereiner, 1988) se ha realizado mediante el
método NPM usando medios semigelificados
carentes de nitrógeno; las tablas de Mac Grady son
útiles en estos casos.
c) Cuando se desea cuantificar el número de
bacterias presentes en múltiples muestras, los
procedimientos de rutina suelen consumir mucho
tiempo. En ese periodo las muestras podrían sufrir
modificaciones en su población. Una metodología
más económica que el recuento por goteo en placa
y que puede manejar mayor cantidad de muestras
es la metodología de goteo en placa 6X6 (Chen et
al., 2003). En este método se realizan diluciones
seriadas (base 10) de las muestras líquidas
originales contenidas en una placa multipozos con
la ayuda de una pipeta multicanal, por lo que se
trabajan 6 muestras a la vez.
Las diluciones realizadas son dispensadas con la
misma pipeta multicanal en una misma placa; razón
por la que se ha designado a esta metodología
como cuantificación simultánea .
d) El procedimiento del contaje del número total de bacterias en placas provee un método
normalizado para la determinación de la densidad de bacterias heterotróficas aerobias y anaerobias
facultativas en el agua. Este es un método aproximado, debido a que las bacterias se presentan en
forma: unitaria, en pares, cadenas, racimos, o en paquetes; además, el medio o el conjunto de
condiciones físicas y químicas no pueden satisfacer los requerimientos de todas las bacterias en una
muestra de agua, consecuentemente, el número de colonias que se desarrollan por cm3 puede ser
sustancialmente más bajo que el número real de bacterias viables presentes. Además, algunas
bacterias, a causa de daños, requerimiento de nutrientes especiales, reacción con el oxígeno,
temperaturas desfavorables de incubación u otros factores, son incapaces de formar colonias
visibles bajo las condiciones empleadas. Para facilitar la toma de datos reales para el control de
calidad de agua, especialmente con fines de comparación y propósitos legales, es esencial contar
con método normalizado para la “determinación del número total de bacterias en placa”.
 MATERIALES

Láminas Portaobjetos
Microscopio
Lámina patrón de Breed
 Asa en anillo calibrado
Xilol
Azul de metileno
Muestra (leche)
 PROCEDIMIENTO
1.Estandarización del equipo:

● Se coloca la lámina patrón que tiene una tabla macrométrica marcada, que tiene
divisiones de 0.1 a 0.01 µm; con el objetivo de inmersión, proceder así:
○ Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal.
○ Determinar el área del campo en mm2; aplicando la fórmula de superficie del
círculo:

● Cálculo de factor microscópico:

○ Se mide con exactitud el área del microscopio en mm2.
○ Luego se divide 100 entre el área encontrada (X=100 x A campo).
○ Luego, para hallar el factor microscópico se multiplica este valor hallado por 100
(FM=X x 100).
○ Se indica que los microscopios tienen un factor de microscopio de 300,000 a
600,000.
 2. PREPARACIÓN DE LA PELÍCULA:

●Se lava la lámina, desengrasándola. Una vez hecho se coloca sobre la

lámina patrón, en este caso al carecer de ella se coloca una lámina de
cartón que tenga una
• cuadrado de 1 cm2.

● Enseguida colocar la muestra de leche previamente homogenizada (20

veces).
● Con el asa calibrada se coloca 0.01 ml. de la muestra en la lámina. Esta se
extiende por toda el área del cuadrado de la lámina patrón.
● Luego debe hacerse el secado lento para evitar el resquebrajamiento de
la película; en especial cuando la muestra se trata de leche.
● En algunas muestras es necesario desengrasar la película con Xilol.
● Teñir la película por el Método de Gram o tinción simple con azul de
metileno.
 3. EXAMEN MICROSCÓPICO:

● Contar en el microscopio los microorganismos por campo utilizando lente de

inmersión. Se cuenta a lo largo de toda la película.
● Se cuenta como mínimo 20 campos y un máximo 100 campos.
● Cuando se cuentan los microorganismos se deben de contar como uno solo: aquellas
bacterias que están solas, los agregados, los grupos, los cocos o bacilos en cadenas.
 4. CÓMPUTO Y CÁLCULO DEL MICROORGANISMO:

● Se cuenta un mínimo de 20 campos..

● Luego se saca un promedio del número de microorganismos por campo y se
multiplica por el factor microscópico.
● Después como la muestra usada fue de 0.01 mL, se multiplica el resultado anterior
obtenido por 100 para pasarlo a la misma unidad (mL).
 BIBLIOGRAFIA

• ANALIZA CALIDAD (s.f). Métodos de análisis microbiológico.

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2021II/MICROBIOLOG%C3%8DA%20DE%20ALIMENTOS/SEMANA%203/metodos-
de-anc3a1lisis-microbiologicos-determ-mesofilicos-homngos-y-coliformes-2-normas-
iso-une.pdf
• Anónimo (s.f.). ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS. Innotec laboratorios.
https://www.innotec-laboratorios.es/analisis-de-alimentos/analisis-microbiologico/