Introducción a los Métodos Microbiológicos Rápidos

José E. Martínez

Un Método Microbiológico Rápido (MMR), es en general, cualquier método que sea más rápido
que los métodos tradicionales de detección y/o identificación de microorganismos. Estos
métodos vienen en diferentes tecnologías y aplicaciones. Muchos requieren la compra de equipo
por parte del usuario e incluso algunos requieren el uso de una computadora. Otros son muy
simples.

Hay un número de blancos potenciales para detectar microorganismos con métodos rápidos, por
ejemplo, la estructura física del organismo, los metabolitos que el organismo excreta o produce,
proteínas, ADN y ARN. El método de referencia que se utiliza para la comparación con los
MMRs es el método de cultivo tradicional. Sin embargo, los métodos microbiológicos
tradicionales no permiten el control en-proceso.

Hay dos tipos de MMRs, cualitativos y cuantitativos. Con los métodos cualitativos estamos
buscando una respuesta de positivo o negativo. ¿Está presente o no? En los métodos
cuantitativos intentamos medir cuántos microorganismos están presenten o la cantidad de
analitos en una muestra. Enumeramos generalmente microorganismos.

Muchos MMRs tienen una sensibilidad, exactitud, precisión y reproducibilidad superior a los
métodos tradicionales, y algunos pueden detectar una célula sin la necesidad del crecimiento
microbiano. Los RMMs se pueden usar para realizar análisis de riesgo y para mejorar las
estrategias microbianas de control ofreciendo una mejor comprensión de la carga microbiana en
los procesos de fabricación.

Los métodos tradicionales de detección y cuantificación están a menudo separados y solamente

las células cultivables son contadas. En los MMRs otras características de los microorganismos
son determinadas. Estas otras características para los métodos de detección están basadas en
luminiscencia por trifosfato de adenosina (ATP), reducción de tinte, resistencia eléctrica,
producción de gas, micro-calorimetría, presencia de enzimas específicas, análisis para los
componentes de la célula ("huella dactilar"), y tecnología de bacteriofagos, entre otros.

Las tecnologías basadas en el crecimiento microbiano se basan en la medida de parámetros

bioquímicos o fisiológicos que reflejan el crecimiento de microorganismos. Estos tipos de
sistemas requieren que los organismos en una muestra proliferen en un medio sólido o líquido
para ser detectados y/o cuantificados. Los métodos por cultivo incluyen la formación de
colonias (usando bio-fotometría), microscopia, conteo electrónico y etiquetado con fluorescencia

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y análisis de imagen. Las tecnologías basadas en el crecimiento microbiano actualmente
disponibles para la detección, enumeración e identificación de microorganismos incluyen:
• Sistemas “VITEK 2” y “Bactometer” de bioMérieux
• Sistema “Biolog” de Omnilog
• “Growth Direct” de Genomic Profiling Systems

Systemas de bio-luminescencia por ATP: En bioluminiscencia por ATP, el ATP microbiano es

extraído de la célula y reaccionado con luciferaza. Luego, el análisis lumino-métrico es
realizado. Este método es rápido (30 minutos a 2 horas) y podría determinar viabilidad.
• “Milliflex Rapid System” de Millipore
• “Advance Luminometer” de Celsis
• “PallChek Microbiology System” de Pall

Las tecnologías basadas en viabilidad utilizan tintes de viabilidad y/o marcadores celulares para
detectar y para cuantificar microorganismos sin la necesidad de crecimiento celular. Las
tecnologías disponibles hoy incluyen:
• Sistema de citometría de estado sólido: los contaminantes son recogidos en un filtro de
membrana y los microorganismos son teñidos usando fluoróforos indicativos de
viabilidad. La detección esta basado por microscopia de fluorescencia, con la
exploración de un laser para inducir la excitación del fluoróforo, y análisis
discriminatorio de imagen. Este método es rápido (aprox. 2 horas) y se podría utilizar
para la identificación.
o «ScanRDI» de Chemunex
• Sistema de citometría de flujo: es parecida a la citometría de estado sólido. Todo el
proceso se ejecuta en un sistema automatizado donde la muestra es diluida en un medio
líquido donde los microorganismos son teñidos usando fluoróforos indicativos de
viabilidad. La detección también se basa por microscopia de fluorescencia, con la
exploración de un laser para inducir la excitación del fluoróforo y análisis discriminatorio
de imagen. Este método también es rápido y es apto para la identificación.
o “D-Count” de Chemunex,
o “BactiFlow”
o “RBD 3000” de Advanced Analytical Technologies

Las tecnologías basadas en artefactos o en huellas dactilares metabólicas se basan en el análisis

de componentes celulares, el uso de sondas que son específicas para los blancos microbianos de
interés o en la reacción de un substrato con un reactivo del color. Algunos sistemas son:
• “Sherlock Microbial Identification System” de MIDI
• “MicrobeLynx” de Waters - este sistema utiliza espectrofotometría de masa por tiempo
de vuelo (MALDI)

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 • “ProteinChip Arrays” de SELDI - este sistema utiliza espectrofotometría de masa por
tiempo de vuelo
• “Endosafe PTS” - sistema para la deteccion de endotoxina y bacterias gram-negativas
bacteria por Charles River Laboratories
• “PyroSense” de Cambrex - sistema para la detección de endotoxina en-línea para
sistemas de agua purificada

Las tecnologías a base de ácido nucleicos utilizan la amplificación del ADN por PCR,
tipificación del rRNA-16S, y secuencia de genes. En la amplificación del ácido nucleico el ADN
es extraído o la célula es lisada, el cual es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), los nucleótidos seleccionados son concentrados y sondas fluorescentes son utilizadas para
la cuantificación. Los resultados se obtienen en 1 - 3 horas con una alta sensibilidad. Muchos de
estos sistemas se utilizan para la detección rápida y exacta de un microorganismo en específico o
para la identificación de un microorganismo desconocido. Las tecnologías comercialmente
disponibles que utilizan tecnologías a base de ácido nucleicos incluyen:
• Sistemas “RiboPrinter” y “BAX” de DuPont Qualicon
• “MicroSeq” de Applied Biosystems
• “MassARRAY” de Sequenom
• Sistema “DiversiLab” de Bacterial BarCodes
• Sistema TIGER” de Ibis - usando tecnología de PCR y espectrofotometría de masa

La cromatografía de gas se puede utilizar después del aislamiento de subcultivos y de la

extracción por multi-etapas para aislar los ácidos grasos. El resultado se compara con una base
de datos para la identificación. Pero este método no es rápido, ni sensible.

Hay muchas oportunidades para los MMRs que con aplicaciones en la industria farmacéutica,
incluyendo:
1. Pruebas de eficacia anti-microbiana
2. Estudios para la supervivencia de indicadores biológicos
3. Pruebas de esterilidad
4. Investigación de fallas en el llenado de medio
5. evaluación de incidentes de contaminación.
6. Materia prima y pruebas de componentes
7. Carga microbiana de producto en-proceso, pre-esterilización y filtración
8. Supervisión de cultivos de fermentación y de células
9. Pruebas para agua purificada y de inyección
10. Control del medio ambiente (e.g., superficie, aire, gases comprimidos y personal)
11. Pruebas de endotoxina
12. Límites microbianos

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