INTERPRETANDO PERFILES

DE ADN

Sinthia Pagano Siepierski PhD

ISHI 25 - GCLAITH Special Workshop
Phoenix, AZ
September 28, 2014
Figure 2: Mark A et al (2004) Nature Reviews Genetics 5, 739-751
¿Qué esperamos?
 Objetivos de este taller
• Explicar los picos falsos, pull up, picos stutter,
microvariantes, degradación, efectos
estocásticos, pérdida alélica, mutaciones y dar
posibles soluciones.
• Establecer los distintos umbrales y parámetros
del instrumento.
• Influencia de factores externos a los resultados.
• Comprender como afectan los puntos anteriores
en la interpretación de una mezcla.
• Requerimientos para una correcta interpretación
de perfiles STR.
 Validación

• Sensibilidad
• Reproducibilidad
• Precisión
• Heterocigosidad
• Valoración de mezclas
 Ilustración esquemética de la separación y detección de los alelos STRs
en un Analizador Genético ABI Prism 310, 3100 u otro instrumento
multicapilar.

Figure 9.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
cátodo
capilar

ADN
Figure 6.3, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
 Ventana de
detección
Laser

ADN
Fluorocromo
Capilar Laser

Life(2012) DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis

Figure 13.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
 Calibración espectral ABI 310
Antes de la calibración espectral:

Después de la calibración espectral:

En ABI 3500
Picos falsos (artefactos)

• Ruido de fondo
• Spikes
• Burbujas
Ruido

• Picos a lo largo de la
línea de base no
reproducibles
• Consecuencia de:
• Fluctuaciones de
corriente
• Burbujas de aire
• Cristales de urea
• Contaminación en la
muestra
 Spikes
• Generalmente aparecen en todos
los colores y son más afilados que
los picos corrientes
• Son consecuencia de la aplicación
de altos voltajes en la
electroforesis
• Resultan de la utilización de agua
de baja calidad para la
preparación del buffer y
muestras. El problema
desaparece cuando se utiliza
agua de calidad HPLC
 Burbujas dye blob

Ocurren por problemas de disociación del fluorocromo

del primer.
 Picos Pull-up
• Se forman por un solapamiento
en el espectro de emisión de los
fluorocromos que se utilizan en el
marcaje sobre todo si la muestra
está sobreamplificada
• Altura menor que un alelo real y
coinciden con los pares de bases
de éste
• Se producen principalmente entre
los fluorocromos que están más
cercanos en el espectro de
emisión
• Si el problema persiste hacer
nueva matriz
Figure 15.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
 Bioquímica de los STRs
• Formación de stutters
• Adición de nucleótidos
• Microvariantes
• Degradación
• Inhibidores
• Efectos estocásticos
• Alelos nulos
• Mutaciones
• Patrones trialélicos
 Bandas stutters
Picos que aparecen primordialmente una repetición menos que el
alelo verdadero como resultado de ‘deslizamiento' de la cadena
durante la síntesis de ADN

Figure 6.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
 Formación de stutters

Deleción causada por Inserción causada por

deslizamiento en la cadena deslizamiento en la cadena
copia inferior copia superior

n-4
n+4
producto
producto
stutter
stutter
 Formación de stutters
• Son más pronunciados cuanto menor es la unidad de
repetición Di>Tri>Tetra>Pentanucleótidos
• Menores a un 10% del pico alélico al que están
asociadas
• Regiones de repeticiones largas generan más 'stutter'
• Cada producto de 'stutter' consecutivo es menos intenso
(alelo > repetición-1 > repetición-2)
• Picos de 'stutter' hacen más difíciles el análisis de las
mezclas
Bandas N y N + 1
• Taq polimerasa suele añadir una
A al extremo 3’ (adenilación).
• Para favorecer la adición se
añade una etapa final de
extensión (15 a 45 min a 60 ó
72ºC)
• Artefacto dependiente de
secuencia y en especial de
cantidad de ADN molde
• Especial atención en aquellos loci
que tengan microvariantes como
TH01 (9.3 y 10)
Concentraciones altas de ADN llevan a
la adenilación incompleta
 Microvariantes alélicas
• Definidos como alelos que no son múltiplos exactos de la
repetición básica o variantes de secuencia de la repetición o
ambos
• Alelos con unidades de repetición parciales designadas por el
número de repeticiones completas y luego un punto decimal
seguido del número de bases en la repetición parcial (Bar et
al. Int. J. Legal Med. 1994, 107:159-160)
• Ejemplo: Alelo TH01 9.3: [TCAT]4 -CAT [TCAT]5

Deletion of T
Alelos off-ladder (OL)
 Variantes alélicas
http://www.cstl.nist.gov/strbase/var_tab.htm
Reporte de OL
Los alelos que son de menor
tamaño que el alelo más bajo del
ladder son reportados como
“menor que X”

Los alelos que son de mayoar

tamaño que el alelo más alto del
ladder son reportados como
“mayor que X”
 Degradación
Pérdida de alelos de mayor tamaño
Muestra de referencia

Muestra de la evidencia
Muestras no degradadas
también pueden dar
electroferogramas con
pendientes negativas
¿Cuán negativa tiene que ser una pendiente para
indicar degradación?

– Experiencia, entrenamiento y práctica

Los controles positivos no

deben estar degradados
 Inhibidores de la PCR

• Telas
• Colorantes
• Hemoglobina
• Ácido húmico
• melanina
• ………
Efecto de inhibición del ácido húmico
 Inhibidores de la PCR

El inhibidor se une
al primer

El inhibidor se une
a la Taq

El inhibidor se une
al ADN
 Inhibidores
• Los más preocupantes son lo que se coextraen
con el ADN
• El mecanismo puede variar de acuerdo al tipo de
inhibidor y a la secuencia del amplicón
• Efecto menos predictivo que la degradación
• Producen:
– Desbalance de alelos
– Perdida alélica
– Pérdica del locus
– Baja sensibilidad
An Investigation of the Effect of DNA Degradation and
Inhibition on PCR Amplification of Single Source and
Mixed Forensic Samples
Bruce McCord ; Kerry Opel ; Maribel Funes ; Silvia Zoppis ; Lee Meadows Jantz
Https://www.ncjrs.gov/App/Publications/abstract.aspx?ID=258707
Efectos estocásticos

?
 Efectos estocásticos
Muestra de referencia

Muestra de la evidencia
 Allelic Dropout
Muestra de referencia
1500

evidencia
150

?
• Alturas de pico en evidencia muy bajas
– Mayoría por debajo de 150 rfu
• Alturas de pico en referencia mucho más altas
– Todas encima de 800 rfu
• Locus D13S317:
– Muestra de referencia: 8, 14
– evidencia: 8, 8
• Alelo 14: se perdió o no estaba?
 Desbalance alélico
En un individuo heterocigoto los alelos tienden a ser
amplificados aproximadamente en iguales proporciones

¿individuo heterocigoto o mezcla?

 Por falta de ADN

 Por mutaciones en la zona de

anillamiento de los primers
 Alelos nulos
• El alelo está presente en muestra de ADN pero no es
amplificado debido a un cambio nucleotídico en el
lugar de enlace del primer
• Decaimiento alélico: puede llevar a confusiones porque
las muestras heterocigotas aparecen como falsos
homocigotos
• Dos grupos de primers de PCR pueden producir
diferentes resultados en muestras que se originan de la
misma fuente, fenómeno que debe tenerse en cuenta
al utilizar bases de datos de ADN
• Se recomienda realizar estudios de concordancia antes
del uso de nuevos kits de STR
 Mutaciones en la zona de unión de los
primers

No mutación

Mutaciones en el
centro del lugar de
enlace del primer

Mutaciones en el
extremo 3’ del lugar de
enlace del primer
ALELO NULO

Box 10.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
Mutaciones en la zona de unión de los
primers

• Baja incidencia: 0,01 a 0,001% por locus

• Muy improbable que un mismo individuo presente

este fenómeno en dos loci distintos

• Si no hay mutación somática: los diferentes fluidos

de un mismo individuo se comportarán igual
Importancia de los alelos nulos
Pplex 16

BASE DE
12 14
DATOS DE
Identifiler ADN

12
Figure 7.2, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
Impacto de la concentración de ADN en la
amplificación de los STRs
Demasiado ADN:
• Picos fuera de escala
• Picos divididos (+/-A)
• Desbalance entre locus

Muy poco ADN:

• Desbalance de
heterocigotos
• Pérdida alélica
• Desbalance entre locus

Rango donde mejor trabajan kits

STRs
• 0,5 a 2,0 ng
 Importancia de cuantificar ADN
humano
• La amplificación de multiplex STR es más
eficiente en un rango estrecho de
concentración (0,5 a 2,0 ng)
• Todo el ADN es extraído al tratar una muestra
biológica,
• por lo tanto el ADN no humano (bacteriano,
fúngico, animales y plantas) es extraído
conjuntamente con el ADN humano de interés
 Métodos disponibles
• UV 280/254: baja sensibilidad y no es específico para
ADN humano
• Semicuantificación en gel: no es específico para ADN
humano, poco sensible, se aprecia más la calidad que la
cantidad del ADN
• Fluorescencia: no es específico para ADN humano, es
sensible pero no provee información de la calidad del
ADN
• Slot blot: específico para ADN humano, subjetivo, lleva
mucho tiempo de trabajo manual
• Aluquant: poco sensible
• RtPCR: específico para ADN humano, muy sensible, buen
rango dinámico
Real time: concepto general

Plot fluorescencia vs
ciclos de PCR

Real time Activador de Detector de

emisión de luz Grupo óptico
instrumento Emisión de luz

Reacción de PCR

Bloque térmico
Que se ve …
 Cinética de Amplificación

Eficiencia de amplificación del 100%

Fase Geométrica
Cinética de amplificación= 2n

Plateau

P= T*(1 +Fase
E Lineal
)n

Fase
FaseGeometrica
GeometricaE=1
E=1
 P= T*(1 + E )n

Fase Geometrica E=1

Pn= Ti*2n
P = cantidad de producto generado a n ciclos
T = cantidad de templado inicial
E = eficiencia de la amplificación
 ¿Por qué qPCR por real time?

• Reducción de la contaminación: no hay

manipulación post PCR
• Alta sensibilidad
• Amplio rango dinámico (aprox 30pg a 100ng)
• Ensayos específicos
• Posibilidad de multiplex
Curva Standard de cuantificación absoluta

CT
CT

0 1 2 3 4 5 6 7

Log n° cópias
CT es directamente proporcional al log de
cantidad inicial de DNA / RNA
Sistemas de detección
Incremento en la fluorescencia por
SYBR green
Características de SYBR Green

● Versátil
● Bajo costo
● Alta sensibilidad
● Ideal para ensayos de discriminación (screening)
● Desventaja: Fluorescencia inespecífica, ajustar muy bien el
sistema de amplificación, evitar fragmentos inespecíficos y
dímeros de primer.
 Sondas TaqMan
R Quencher
Características del sistema TaqMan

• Detección de productos de
manera específica
• Detección simultánea de múltiples
productos de amplificación
(Multiplex)
• Diseño de sondas para cada
sistema de análisis en particular
• Mayor número de aplicaciones,
análisis de punto final
Beacons moleculares
 Características de los beacons
moleculares
• Aumento de la especificidad
• Capacidad de multiplex
• El diseño puede ser engorroso
• La sonda debe ser desnaturalizada del templado por
debajo de 72º para que la Taq no la digiera durante la
extensión
T annealing < Tm < T extensión
Cebadores Scorpions
Plexor
 Bajo número de copias (LCN)

• Cuando se trabaja con menos de 100pg de

ADN genómico
• Cuando se trabaja por debajo del umbral
estocástico donde el producto de PCR no es
seguro ( 150-250 pg)
• Cuando hay que mejorar la sensibilidad de
detección (34 ciclos en vez de 28 ciclos)
• Cuando hay muy pocas copias de ADN para
asegurar una amplificación confiable
 Otros términos para LCN

• Bajo nivel de ADN

• Trazas de ADN
• ADN de contacto
 Estrategias para aumentar la
sensibilidad

1. Aumentar el número de ciclos de PCR

 Aumento del número de ciclos de PCR

Figure 11.1, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
 Estrategias para aumentar la
sensibilidad

1. Aumentar el número de ciclos de PCR

2. Purificación post PCR
3. Aumentar inyección capilar
4. Reducir el volumen de PCR
5. Nested PCR
6. Mejoramiento de los reactivos de PCR
 Utilización de amplicones reducidos:
mini STRs

Primer Mini
convencional primer

Mini Primer
primer convencional
 Mutaciones

16, 21 18, 20 16, 21 18, 20

16, 18 17, 18

Transmisión normal de alelos Mutación paterna

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm
 Mutaciones
• Frecuencia de 1 en aproximadamente 1000 meiosis
• Mayor frecuencia de mutaciones paternas que
maternas
• Frecuencias más altas de mutación: vWA, FGA,
D18S51
• Frecuencias más bajas de mutación: TH01, TPOX,
D16S539
Buffers y componentes
de la muestra
¿Qué afecta la separación de los
alelos?

• Recubrimiento del capilar

• Temperatura de corrida
• Formamida
• Buffer de electroforesis
• Polímero
 Flujo electroforético y flujo
electroosmótico

Figure 6.4, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
 Movilidad
• Es el tiempo que le lleva al fragmento de ADN
moverse del punto de inyección al punto de
detección.
 Factores a tener en cuenta en la
preparación de la muestra

• Utilizar formamida de buena calidad para no

afectar la conductividad
• Desnaturalización
• Artefactos de la síntesis de los primers “dye blobs”
• Prevenir el exceso de sales en la muestra debido a
la evaporación
• Contaminación con iones metálicos
• Purificación post PCR para reducir las sales
 La descomposición de la formamida
altera la conductividad de la misma

• Hidrólisis produce formiato de amonio

• El aire ioniza el formiato produciendo hidróxido de
amonio y ácido fórmico
• Impurezas como el ácido fórmico (iones negativos más
pequeños), amonio, y otras impurezas:
• Compiten con los fragmentos de ADN reduciendo la cantidad
de ADN inyectada
• Baja la señal y aumenta el ruido
• Degrada y descompone los fragmentos de ADN reduciendo
resolución y selectividad
Porque utilizar formamida y no agua

• El ADN se puede descomponer en el agua

• La formamida es más efectiva cuando se trabaja
con fragmentos grandes y altas concentraciones
de ADN
• La formamida se evapora menos que el agua
• La formamida a diferencia del agua mantiene el
ADN desnaturalizado
Muestra preparada con
formamida de mala
calidad

Misma muestra
preparada con
formamida de buena
calidad
Efecto “Golden Gate”
 Reannealing: produce picos
fantasmas
• Son consecuencia de la desnaturalización
incompleta o de la rehibridación
• El ADN de doble cadena migra más rápido que
el ADN de cadena simple por lo que el pico
extra aparece delante del pico principal
• Comúnmente se visualizan en el estándar de
tamaño pero pueden aparecer en otros
colores
La variación de la temperatura de
corrida puede producir la
rehibridización
Desnaturalización incompleta del
estándar
 Procesamientos post PCR
• La purificación post PCR reduce los niveles
salinos permitiendo que más ADN sea
inyectado al capilar
• Reprocesar una muestra luego de la PCR para
concentrarla puede mejorar la señal
• También se remueven las burbujas dye blobs
• Disponibilidad en el mercado de distintos kits
con columnas purificadoras
Factores externos
• Temperatura ambiente
– Pueden causar variaciones en la movilidad
(excepto ABI3500)
– Ambientes muy húmedos: la temperatura afecta
la conductividad eléctrica
• Limpieza
– Polvo
– La cristalización de la urea en el bloque puede
causar obstrucciones, spikes, etc.
– La cristalización del polímero también puede
causar obstrucciones
 Efecto de la temperatura

• Afecta la viscosidad del polímero y la separación de los

fragmentos de ADN causando OL
• Puede afectar la conformación de estructuras
secundarias en el ADN
• Se recomienda que la T no fluctúe en + 2ºC
 Limpieza
• La urea sublima generando compuestos iónicos
que forman un camino a tierra
• De la misma manera si queda buffer o humedad
bajo los viales forman un camino a tierra
• La ventana del capilar debe estar limpia para no
afectar la lectura
• Los viales deben estar limpios porque podrían
transferir ADN al capilar
 Factores instrumentales
• Sistema óptico
• Sistema capilar
• Derrames de la jeringa
 Sistema óptico

• La sensibilidad varía con el uso, con el diámetro

del capilar, la limpieza del capilar y con la
calibración del instrumento
• Monitorear la intensidad del laser ya que pierde
intensidad con el tiempo
• Observar la relación señal ruido
 Ventana de detección

• Verificar limpieza de
ventana
• Verificar alineación
del capilar con la
ventana
 Fluídos
• Efectos de burbujas, polvo, cristales de urea,
derrames en la jeringa y en las férulas
• Cambios de viscosidad
• Agua en el bloque
• Burbujas
• temperatura
• Obstrucciones en el capilar
 • Remover las burbujas de los canales

Esta imagen es cortesía de John Butler

http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
Cristales de urea

• Se forman al
sublimarse la urea
cuando hay
derrames en las
válvulas del bloque
 Matrices
• Cambios en el buffer, sistema óptico, fluorocromos,
pueden afectar las calibraciones del software
• Una matriz de baja calidad puede dar una línea de
base elevada asignándose demasiados picos
 Problemas con el capilar

• Materiales en la superficie capilar pueden

producir flujo osmótico, ensanchamiento de
las bandas de ADN e inconsistencias en la
resolución
Decaimiento alélicos causados por:

• Formamida de mala calidad

• Conductividad causada por degradación de la urea
• Agua en el polímero
• Derrames de la jeringa
• Excesos de sales que provocan renaturalización
• Presencia de iones (detergentes o metales)
• Capilar dañado
• Daños en la ventana del capilar
Si la baja resolución es permanente
entonces:

• Problemas de adsorción en el capilar

• Iniciación de flujo electroosmótico
• Mala composición del buffer causa cambios en
la conductividad
• Cambios de concentración en el polímero
causan cambios en la viscosidad
 ¿Qué se requiere para la correcta
tipificación de los STRs?
Electrophoresis 2004, 25, 1397–1412. STR typing with ABI 310 and 3100

• Alta resolución espectral para distinguir los

diferentes productos de PCR y que la
detección de las microvariantes sea confiable
• Asignación de tamaño correcta en el rango de
pares de bases estudiada
• Alta precisión entre corridas para permitir la
comparación de perfiles
 Recolección de datos

Identificar los picos

Matriz Separación de colores GeneScan

Estándar Medida de los picos

interno GeneMapper
Muestra de Comparación con
escalera
escalera alélica
alélica Genotyper

Asignación genotípica

Revisión de datos
EXPERIENCIA
Confirmación de
resultados
¿Qué nos cuestionamos más
frecuentemente en la
interpretación de los datos?
• ¿Es un pico o ruido?
• ¿Es un alelo o un artefacto?
• ¿Homocigoto verdadero o heterocigoto
con pérdida alélica?
• ¿Mezcla?
• ¿Es un perfil interpretable?
 150-200 RFU Umbral estocástico
Por encima de este valor es
razonable asumir que no ha
habido pérdida alélica de un
alelo hermano heterocigoto

30-50 RFU Umbral analítico

Debajo de este valor

los picos observados
no pueden distinguirse
fehacientemente del
ruido del instrumento

Figure 10.2, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
¿Se puede utilizar este locus para la
interpretación de resultados?
¿Cómo determinar estos umbrales?
• Primero determinar el umbral analítico (límite de
detección) para el laboratorio y para cada
instrumento utilizando la intensidad de señal
(depende del instrumento)
• Generalmente 3 veces la desviación estándar del
ruido o 2x Np-p

Línea de base en un blanco

Otros métodos
¿Es necesario especificar umbrales
para cada fluorocromo?
 Límite de cuantificación

• 10 veces la desviación estándar del ruido

• Se estima utilizando 7xNp-p (150-200 RFU)
• Por debajo de este valor las estimaciones de
área o altura no son confiables
 Umbral estocástico
• Depende de la sensibilidad biológica
• Por encima de este valor se puede asumir que
en este locus no ha habido pérdida alélica de
un heterocigoto; un solo alelo en este locus
puede considerarse homocigoto
• Es la intensidad de señal por debajo de la cual
una cantidad particular de ADN no puede
detectarse con certeza
• El umbral estocástico debe ser superior que el
límite de cuantificación
 Determinación del umbral
estocástico
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by
Forensic DNA Testing Laboratories

• Se establece en base a datos empíricos derivados del

laboratorio y es específico para los sistemas de
cuantificación, amplificación (kits) y detección
empleados.
• Se evalúa las relaciones de alturas de picos en múltiples
loci en una serie de diluciones
• El umbral estocástico es el valor de RFU por encima del
cual es razonable suponer que, en un locus dado, no se
ha producido la pérdida alélica de un alelo hermano
Relación de alturas: por encima de este valor, dos alelos
heterocigotos pueden agruparse como posible genotipo

El umbral estocástico también puede ser definido como la

concentración en la cual un conjunto de relaciones de alturas cae por
debajo del 60%
¿Qué sucede con los datos que están
por debajo del límite estocástico?
• Artefactos de la PCR y stutters adquieren
importancia
• Aumenta el número de spikes
• Pueden aparecer picos –A
• Las burbujas de fluorocromos son más
significativas
• Pueden aparecer picos de un segundo
contribuyente
Por debajo del umbral estocástico:
los artefactos de la PCR, spikes y burbujas adquieren importancia

Figura 9: Thompson et al. Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defense review
 Determinación del PHR
(equilibrio de heterocigotos Hb)
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR
Typing by Forensic DNA Testing Laboratories
• El PHR para un locus determinado se calcula dividiendo
la altura del pico del alelo de menor RFU entre la altura
del pico del alelo de mayor RFU, multiplicando este valor
por 100 para expresarlo como porcentaje
• Pueden aplicarse distintos PHR para loci individuales o
un solo PHR para todos los loci
2
1
altura pico 1 (RFU)
PHR = x 100
altura pico 2 (RFU)
Un individuo heterocigota para cierto locus
teóricamente debería :

• Amplificar igualmente ambos alelos ya que se

encuentran en la misma cantidad en el
genoma
• Igual inyección capilar
• Relación de alturas de picos similares (100%)
¿Qué puede causar desbalance?

• Poca cantidad de ADN

• Inhibición
• Degradación
• Amplificación preferencial
• Stutter elevado
• MEZCLA DE ADN: hay presentes más de un
contribuyente
 Límite de linealidad

• Punto de saturación del detector del

instrumento por lo que cantidades mayores del
analito no producen una respuesta linear de la
señal
• La cámara CCD al saturarse produce picos
aplanados
Efecto en la matriz de una muestra
sobrecargada
Rango dinámico comparativo de
equipos ABI
Diferencias entre instrumentos
• Diferencias de sensibilidad entre instrumentos
debidas a:
– Parámetros de inyección
– Iluminación del capilar (un capilar vs multicapilar)
– Intensidad del lazer

• Las diferencias de sensibilidad afectan los datos

de cualquier sistema

• Estas diferencias deben ser corregidas

estableciendo los umbrales correspondientes.
 Picos stutter
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR
Typing by Forensic DNA Testing Laboratories

• En general, el criterio empírico está basado en las

características cualitativas y/o cuantitativas de los picos.
Por ejemplo, artefactos y spikes se distinguen de los
picos alélicos por su morfología y/o reproducibilidad.
• Los stutters deben ser caracterizados por su medida
relativa al pico del alelo al que están asociados.
 Cálculo del stutter

alelo altura pico N-4 (RFU)

Stutter % = x 100
altura pico alelo (RFU)

Stutter N-4
 Umbral stutter

• Aproximadamente 15%
• Por debajo de este valor un pico en posición
stutter puede considerarse como tal en
muestras de origen único o en determinados
tipos de mezclas
Interpretación de potenciales picos
stutter en una mezcla
Alelos del componente mayoritario

Stutter
componente
Alelo del
minoritario o
componente
ambos
minoritario
?
Recomendación 6: si el perfil genético es una mezcla
mayor/menor, donde los alelos menores son de la misma
medida (altura o área) que los stutters de los alelos
mayores, entonces los stutters y los alelos menores son
indistinguibles. Bajo estas circunstancias los alelos en
posisición stutter que no soportan la hipótesis Hp deben
ser incluídos en la interpretación.
 Conclusión
• Los picos stutters son problemáticos cuando
se trabaja con mezclas con bajas cantidades
de ADN
• Los laboratorios deben decidir cuando es
apropiado quitar los filtros para stutters en los
análisis, principalmente si el componente
minoritario tiene una altura similar que los
picos stutters
¿Cómo determinamos el número
de contribuyentes a la muestra?
 Desbalance de los
heterocigotos

Más de 2 alelos
 Extra bandas: ¿alelos reales o
artefactos?
• Artefactos de la amplificación: bandas N + 1
• Artefactos de la detección: «pull-up»
• Artefactos producidos por la amplificación
inespecífica de ADN no humano
• Contaminaciones extra/intra-laboratorio
• Fenómenos genéticos: trisomías,
duplicaciones, traslocaciones, mutaciones
somáticas, etc.
Anomalías cromosómicas
• Traslocaciones, duplicaciones,
trisomías, fenómenos de
inestabilidad genética (cáncer)
• Fenómeno muy infrecuente que
aparece en un solo locus
• Problemático si se da un
fenómeno de mosaicismo
 Patrones trialélicos

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm
 Si tenemos un patrón
trialélico:
• Amplificar con un kit diferente; re inyectar la
misma muestra no cambiará el resultado
Bandas inespecíficas de ADN no
humano
• Asociadas a muestras con contaminación
bacteriana o animal (toma vaginales, restos
óseos, …)
• Tienen una secuencia diferente a los alelos y
por ello migran diferente, son picos únicos y
normalmente tiene un pico fuera del rango
alélico del locus donde se detectan.
Los datos a tener en cuenta al momento de identificar el
número de contribuyentes a una mezcla son:

– Número de alelos por locus

– Circunstancias del caso
– Posibilidad de individuos relacionados biológicamente en la
mezcla
– Generalmente si son 2, 3 ó 4 alelos por locus, entonces
serían 2 contribuyentes
– Si son 5 ó 6, entonces 3 contribuyentes
– Si son > 6 alelos por locus, entonces > 4 contribuyentes

Muy importante para realizar los cálculos

estadísticos
 ¿Puede utilizarse la relación X/Y en la
amelogenina como indicador del número
de contribuyentes?
• En casos de agresiones sexuales con mezclas
de 2 personas femenino/masculino
• Poca utilidad en mezclas masculino/masculino
o mezcla mujer/varios masculinos
• Tener en cuenta que mutaciones en la zona de
inserción de primers puede causar deleciones
de X o Y
 Estimar la proporción relativa de los
individuos que componen la mezcla

• Si dos templados de ADN son mezclados entonces se

espera que la razón/proporción de contribuyentes será
preservada en la mezcla en cada locus

• Por lo tanto se puede suponer que el área de los picos

en el electroferograma está relacionada con la
cantidad inicial de los componentes
 ¿Podemos reducir el
volumen de las reacciones
de PCR?
 Ventajas

• Se reduce el costo
• Aumento en la sensibilidad
• Aumento en la eficiencia
Figura 8: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the
AmpFlSTR Profiler Plus kit
Figura 10: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the
AmpFlSTR Profiler Plus kit
 Desventajas

• Limita el volumen de muestra en la reacción

• Potencial pérdida alélica en muestras con muy
poco ADN
• Muestra con inhibidores: menos diluído al
reducir volumen de PCR
http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf

Burbujas de
colorante

Esta imagen es cortesía de John Butler

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 Sobreamplificación de
un alelo

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 Ladders mal
alineados

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 Contaminación

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 Desbalance de picos,
artefactos en bajo número de
copias

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 Sobreamplificación

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 pico debajo de
burbuja “dye blob”

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 Problemas de
separación, burbujas en
el capilar

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 Picos de corriente
Current Spikes
“spikes”

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