Estructura de ácidos nucleicos

5) Usted le ha pedido a unos de sus colaboradores que realice, en una muestra

de DNA genómico, la determinación de la Tm y de la complejidad del DNA
(ensayo de Cot). Su colaborador realiza los ensayos pertinentes y le envía los

A B

resultados vía mail. Al abrir el correo se encuentra con lo siguiente:

Su colaborador se olvidó por completo de rotular los ejes de los gráficos

de los resultados solicitados. De acuerdo a sus conocimientos y a la
interpretación de cada gráfico:
a) Indique cual grafico (A ó B) corresponde al resultado que muestra una
curva de Tm y cual corresponde al del ensayo de Cot (2p c/u)
b) En base a su elección anterior, asocie cada número con alguno de los
siguientes términos: Secuencias repetidas, DNA doble hebra,
secuencias únicas, DNA simple hebra. (1p c/u).
c) Usted tiene un DNA que presenta la siguiente estructura con zonas de
doble hebra y de simple hebra: ¿Este DNA cumplirá las reglas de
Chargaff? Explique su respuesta (4p)

Respuestas: a) Curva de Tm: Gráfico B; Curva de Cot: Gráfico A

b) 1: Secuencias repetidas
2: DNA simple hebra
3: Secuencias únicas
4; DNA doble hebra
c) No, este DNA no cumple con las reglas de Chargaff, pues
presenta en su estructura regiones de simple hebra, por lo cual
no se cumplirá que A=T y C=G
Replicación del DNA en eucariotas

6) La replicación del DNA en procariotas y eucariotas se lleva a cabo bajo los mismos
mecanismos moleculares, esto es que se requieren partidores para iniciar la síntesis, estabilizar
el DNA de simple hebra o síntesis continua y discontinua del DNA entre otros. Y esto se lleva a
cabo en cada modelo por enzimas/proteínas propias de cada organismo. Al respecto, para las
proteínas/enzimas procariotas indicadas, mencione su contrapartida en eucariotas, explicando
la función de cada una de ellas.
a) DNaG, SSB, βClamp, DNaB y complejo τ (2 pt c/u)

Respuestas:

DNaG: En bacterias corresponde a la primasa, la enzima responsable de sintetizar los

partidores para iniciar la replicación. Su contrapartida en eucariota, que cumple la misma
función es la DNA polα/primasa.

SSB: En bacterias son conocidas como las proteínas “single strand binding”, que tienen
la función de unirse al DNA de simple hebra producido por la acción de la helicasa y, de
esta manera perimitir que el DNA este con sus dos hebras sin aparearse, perimitiendo
que la DNA polimerasa, pueda usar cada hebra como molde para la síntesis de nuevo
DNA. En eucariotas, su contrapartida que cumple idéntica función es la proteína
denominada RPA (replication protein A).

βClamp: También conocida como abrazadera deslizante, es una proteína que aumenta
la procesividad de la DNA polimerasa III en bacterias, previniendo su disociación del
DNA templado. En eucariotas, su contrapartida que cumple idéntica función es la
proteína PCNA, antígeno nuclear de proliferación celular.

DNaB: En bacterias, corresponde a la helicasa replicativa, responsable de abrir la

horquilla de replicación durante la síntesis de DNA. Su contrapartida en eucariotas, que
cumple idéntica función corresponde al complejo CMG: Cdc45:MCM2-7:GINS

Complejo Tau: Corresponde a la actividad responsable de cargar en el DNA a la

abrazadera deslizante en bacterias. Su contrapartida en eucariotas es la proteína RF-
C.
Replicación en eucariotas.

7) Según su conocimiento del reclutamiento de las proteínas necesarias

para formar el doble hexámero, y considerando como punto de inicio que
el ORC se encuentra unido al origen de replicación (ver esquema).
Coloque en cada cuadrado el nombre de la o las proteínas que se unen
de manera secuencial al ORC hasta formar el doble hexamero (2p c/u)
Estructura ácidos nucleicos

8) Usted aisla el DNA de un nuevo organismo eucariota descubierto en el

fondo del mar, en condiciones de hipoxia, a baja temperatura y en medio
ácido. Procede a aislar el DNA para llevar a cabo una caraterización
molecular. Usa como referencia, células de hongo que viven en
condiciones normales. Con los DNAs aislados realiza la determinación de
varios parametros (ver tabla).
Pregunta: De la interpretación de cada uno de los datos obtenidos para cada
DNA. Explique que diferencias existe entre el DNA del hongo marino y el
terrestre. (15 p totales). Se considera 3 pt por la interpretación de cada parametro
indicado)

Sensible a Valor medio Diametro

Tm de Cot
Razon 260/280
fosfatasa del DNA
DNA hongo marino 89°C NO 10exp-3M 1,5 3,5 nm
DNA terrestre 70°C SI 10exp4 M 1,9 2nm
Nota: La fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres

Resp: A partir de cada característica se puede inferir que:

El DNA aislado desde el hongo marino, posee un mayor %de GC que su

contrapartida terrestre, reflejado esto en su valor de Tm de 89°C v/s 70°C.

El mismo DNA no es sensible a la fosfatasa, que elimina grupos fosfatos,

lo que indica que este DNA es circular en vez de lineal, como lo es el DNA
aislado del hongo terrestre.

El bajo valor medio de Cot del DNA aislado del hongo marino, indica que
no posee secuencias complejas y más bien sería rico en secuencias
repetidas que se hibridan a bajo valro de Cot. No es el caso del DNA aislado
del hongo terrestre, que tiene un alto valor promedio de Cot, lo que indica
que tiene secuencias complejas, preferentemente presencia de secuencias
medianamente repetidas y de secuencia única.

El indicativo de pureza (razón 260/280), sugiere que el DNA aislado desde

el hongo marino presenta contaminación con proteínas, no asi el DNA
aislado del hongo terrestre, cuyo razón es cercana a 2.

En referencia al diámetro determinado, el DNA aislado del hongo terrestre

tiene el diámetro típico del DNA-B. sin embargo, el DNA aislado del hongo
marino posee un diámetro no observado en ningún tipo de DNA (A, B ó Z),
por lo cual constituiría una nueva variante de DNA.
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NOMBRE:

1. Pregunta Técnicas de ADN

Usted se encuentra determinando la presencia y número de copias de un gen de

resistencia a antibióticos en una muestra de un paciente infectado con Staphylococcus
aureus.

En el siguiente panel se muestran las curvas de amplificación por qPCR (usando la

tecnología SYBR Green) de 3 reacciones para la detección del gen de resistencia.
También se muestran los 3 perfiles de absorbancia de la muestra de ADN usada como
templado para la amplificación.

A) ¿Cual(es) muestra(s) de los pacientes tendrían un ADN lo suficientemente puro?.

Explique y fundamente su respuesta. 5 puntos

Sólo el ADN extraído del paciente 2 tiene una razón 260/280 cercana a 1.8, por lo
tanto es el único de una pureza aceptable.

B) En el caso hipotético que todos los perfiles de absorbancia fueran adecuados.

¿Cuál paciente tendría la menor y cual tendría la mayor cantidad de ADN templado
según la curva de amplificación? Explique y fundamente su respuesta. 5 puntos

A mayor cantidad de ADN templado menor será el ciclo donde la intensidad de

fluorescencia será mayor al background. Por lo tanto el Ct será menor. De esta forma
el paciente 1 tiene la mayor cantidad de ADN templado y el paciente 3 la menor.

Curvas de amplificación Curva melting Paciente 1

Paciente 1

Paciente 2 Paciente 3
Curva melting Paciente 3
Curva melting Paciente 2
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2. Pregunta Técnicas de ADN

En su laboratorio 2 personas prepararon reacciones de secuenciación por Sanger para

secuenciar un fragmento de su gen de interés. De acuerdo a lo que conoce de la
técnica responda las siguientes preguntas:

A. De las siguientes moléculas (A, B y C), ¿Cuál(es) se ocupan en la preparación

de las reacciones de secuenciación por Sanger? Fundamente su respuesta. 5
puntos

Una reacción de Sanger tendrá una mezcla de nucleótidos A y B. La molécula A

corresonde al didesoxi (ddNTP) que genera el termino de la síntesis de AN, mientras
que la molécula B es un desoxi (dNTP) el cual permite la síntesis de ADN.

B. A continuación se muestra el gel de secuenciación que preparó una de las

personas. Escriba la secuencia 5´a 3´del ADN sintetizado. 5 puntos

La secuencia es 5´ATATTGTCGTAG 3`

C. A continuación se muestra el gel de secuenciación preparado por la otra

persona de su laboratorio. ¿Que pudo haber pasado en la reacción preparada
por esta persona? 5 puntos

En cada pocillo se puede ver una banda de alto peso molecular

del mismo tamaño. A diferencia el gel anterior, lo más probable
que pasó es que la persona no agregó los ddNTPs razón por la
cual no hubo término de la síntesis de ADN en ningún carril.
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NOMBRE:

3. Preguntas Replicación de ADN

Usted se encuentra estudiando una cepa mutante de Escherichia coli que como efecto
de la mutación se produce un re-inicio desregulado de la replicación del ADN,
causando la sobre-iniciación y la muerte de la bacteria por un colapso de las horquillas
de replicación (ver figura).

Sobre-iniciación

Replicación Colapso de horquillas

Normal Y muerte celular

¿Qué mutación(es) podrían explicar dicho fenotipo? Explique en detalle y fundamente

su respuesta. 8 puntos totales

Un inicio desregulado se puede deber a una mutación que inactive a la proteína SeqA
(y no pueda secuetrar el ADN hemimetilado). Otras opciones validas son mutaciones
que hagan que la metilasa Dam sea hiper-reactiva y logre metilar rápidamente el ADN
antes que SeqA pueda secuestrar el ADN hemimetilado.
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NOMBRE:

4. Preguntas Replicación de ADN

Usted se encuentra estudiando el proceso de replicación del ADN in vitro en especial

el comportamiento de 3 cepas mutantes de Escherichia coli (A, B y C). Para esto,
usted replica el experimento de Reiji y Tuneko Okazaki para estudiar el la sintesis de
nuevas hebras de ADN en el tiempo, usando un gradiente de sacarosa y marcando la
síntesis de nuevo ADN mediante marcaje radioactivo. Una cepa Escherichia coli
silvestre (normal) tiene el comportamiento de la figura.

Tomando eso en (cuenta dibuje el perfil tanto a 5 segundos como 2 minutos de:
A) Cepa mutante para DNA ligasa (8 puntos), B) Cepa mutante para la DNA
polimerasa III (6 puntos), C) Cepa mutante para la DNA polimerasa I (6 puntos).

Explique y fundamente cada respuesta.

B C
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NOMBRE:

Los graficos A y C deberían ser parecidos a lo siguiente:

Esto debido a que en (A) no estaría la DNA ligasa y no se podrían ligar los fragmentos
de Okazaki. En C, al no poder remover el partidor y polimerizar la región dejada por el
primer tampoco podría la DNA ligasa ligar los fragmentos de Okazaki. Por eso A y C
son parecidos.

El grafico en B debería estar en blanco (o una línea basal cerca del 0). Sin DNA
polimerasa III no hay síntesis de ADN nuevo.