“AÑO DEL FORTALECIMIENTO DE LA SOBERANÍA”

UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA”

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ADN FORENSE. HISTORIA.

CONCEPTOS BÁSICOS (EXTRACCIÓN,

CUANTIFICACIÓN POR PCR,

ELECTROFORESIS CAPILAR)
MARCADORES GENÉTICOS (STRS, MINISTRS,

KITS STRS COMERCIALES)

ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
(SANGRE, SALIVA, PELOS, HUESOS, ETC.)

INTEGRANTES:

Sayritupac Corilla, Evelyn

Serveleon Yucra, Yesica
Villagaray Perez, Guadalupe

 Investigación biológica de la paternidad

Pericias de criminalística biológica (estudio de vestigios

ADN FORENSE biológicos de interés criminal como manchas de sangre,
esperma, pelos, etc.)

Problemas de identificación.

 Análisis y comparación de Muestras

Muestras Dubitadas Muestras Indubitadas

pueden ser:

Muestras de Muestras de origen

origen humano no humano
 HISTORIA DE LAS PRUEBAS DE ADN
EN EL CAMPO FORENSE
1985
Mediante la identificación del ADN logro obtener un
patrón de bandas parecido a un código de barras al
que denominó huella genética o huella digital del ADN.
A esta técnica se le denominó RFLPs oor el uso de
enzimas de restricción o MLPs, por emplear múltiples
sondas para detectar varias secuencias del genoma.
Posteriormente, se utilizaron marcadores VNTRs,
aunque estos marcadores fueron ampliamente usados,
al poco tiempo fueron sustituidos por las sondas de
locus único
1983
desarrollo de la técnica de PCR, cambió
el complicado panorama de ese
entonces para obtener huellas
genéticas, ya que esta técnica permitía
que en poco tiempo y con poca
cantidad de ADN molde se pudiesen
amplificar o generar millones de copias
de fragmentos de interés.
El siguiente paso importante fue el
descubrimiento e implementación de
secuencias variables de menor tamaño los
microsatélites o STRs, por su tamaño
pequeño, los marcadores STRs se podían
amplificar fácilmente ofreciendo mayor
robustez y sensibilidad ya que permitían
obtener resultados a partir de cantidades
mínimas de ADN molde (0.5 a 1 ng), lo
cual es crucial en investigaciones
criminales y desastres masivos.
 CONCEPTOS BÁSICOS
EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN POR PCR,

ELECTROFORESIS CAPILAR
Para entender el origen y lo que significa un perfil genético, es necesario
comprender las herramientas que ofrece el genoma para llevar a cabo la
identificación humana, los llamados marcadores genéticos o moleculares,
Se denominan genéticos por su herencia mendeliana simple, y moleculares por
localizarse en la molécula del ADN.
Dichas secuencias se caracterizan por ser variables, es decir, polimórficas, lo que
significa que en los cromosomas de una población la misma secuencia presenta al
menos dos formas alternas o alelos,, lo que eventualmente permitirá diferenciar
cromosomas con alelos diferentes.
 MARCADOR GENETICO
En identificación humana se puede definir un marcador genético como un polimorfismo que permite diferenciar
cromosomas e individuos, así como establecer sus relaciones biológicas de parentesco.
los marcadores genéticos usados en identificación humana (con muchos alelos) generan un número aún mayor de
genotipos que permiten hacer cada vez más único a cada individuo en una prueba de ADN.
Los marcadores más empleados para realizar una prueba de ADN son :

Los microsatélites, repeticiones cortas en tándem o STRs.

 Se define como el genotipo para varios STRs formando un código, el cual permite
diferenciarlo o relacionarlo biológicamente con otras personas.

Por ejemplo, una pareja de heterocigotos para alelos diferentes puede tener hijos con cuatro
genotipos distintos, lo que permite diferenciar individuos estrechamente relacionados como
los hermanos, ya que la probabilidad de que dos hermanos tengan el mismo genotipo es sólo
0.25 (1/4). Esto significa que en una prueba de ADN estándar con 15 STRs la probabilidad de
que dos hermanos compartan el mismo perfil es de (0.25)15= 9.3 E-12, es decir
aproximadamente uno en más de mil millones. Cabe mencionar las excepciones, en este caso
PERFIL GENETICO los gemelos monocigotos que compartirían un mismo perfil de ADN.

EXTRACCIÓN DE ADN
Los médicos forenses obtienen ADN de una infinidad de fuentes
biológicas muchas veces no imaginadas, como chicle, manchas,
pintalabios, una tasa, una botella con agua, un pasamontaña,
restos calcinados, un rastrillo, cepillo de dientes, etc.
Principales pasos de una extracción de ADN estándar:
a) Lisis celular, la destrucción de las células, ya sea epiteliales
(por ejemplo, mucosa oral en saliva, fluidos vaginales,
leucocitos en sangre, etc.). Este paso en muchos casos requiere
un paso previo para obtener las células.
b) Purificación, para separar al ADN de las proteínas y los
restos celulares que dejó la lisis celular previa.
c) Precipitación, que consiste en separar al ADN mediante su
deshidratación en alcohol absoluto y dejarlo secar.
d) Resuspensión, para rehidratar el ADN con una solución que
lo protege de la posible degradación.

CUANTIFICACIÓN DE ADN
Una de las técnicas más sencillas es la espectrofotometría,
la cual se puede realizar con cantidades mínimas de
muestra
Se estima también la pureza del ADN en cuanto a la
presencia de sales o proteínas que pudieran interferir
posteriormente para obtener un perfil genético.
Sin embargo, para los genetistas forenses esta técnica
puede no ser suficiente ya que además del contexto
criminal del que se trate, hay que considerar que pueden
ser mínimas lo que limita los ensayos o repeticiones que
se pueden hacer. Por ese motivo, las muestras forenses
suelen cuantificarse por medio de PCR en tiempo real.
La PCR es una técnica de amplificación in vitro de pequeños
segmentos de ADN con la que a partir de una cadena única se
pueden hacer millones de copias, de modo que el producto
amplificado puede ser fácilmente analizado, incluso sin
recurrir al uso de sondas.
LA CUANTIFICACIÓN POR PCR EN
TIEMPO REAL

Consiste en amplificar la muestra de interés en presencia de muestras a

diferentes concentraciones de ADN que sirven como referencia (0.5, 3, 5, 10,
20 ng/#L, etc.). Los equipos de PCR tiempo real detectan con gran
sensibilidad la amplificación de las muestras de referencias con relación a la
muestra de interés. De manera que la PCR tiempo real en realidad no
cuantifica la cantidad de ADN, sino la capacidad de la muestra de interés
para ser amplificada. Con base en ello, se estima su concentración
comparando con las muestras de referencia, lo cual prácticamente garantiza
el éxito del siguiente proceso; la amplificación.
 Amplificación por PCR.

La PCR consiste en 25-30 ciclos en los que suceden los

siguientes tres pasos en cada ciclo:

Desnaturalización

Alineamiento de los iniciadores o primers

Extensión
ELECTROFORESIS CAPILAR (EC).
Los alelos STRs se diferencian por el número de
veces que se repite una secuencia corta, esto significa
que el tamaño va a ser diferente entre un alelo y otro.
Para ver estas diferencias se emplea la EC, donde el
producto de PCR de cada muestra se separa a través
de un capilar relleno de polímero por acción de un
campo eléctrico, proceso que dura alrededor de 30
minutos por muestra.
Como parte de la EC, también se detectan los
productos para ofrecernos una representación
gráfica de la corrida llamada electroferograma.

 MARCADORES GENÉTICOS
(STRs, MiniSTRs, Kits STRs comerciales)

 Marcadores STRs.

Los marcadores de elección en genética forense son los

STRs tetranucleótidos, es decir, que su unidad de repetición
mide cuatro pares de bases (p. ejem. GCTG). Éstos tienen la
ventaja, respecto a los dinucleótidos (p. ejem. GA) o
trinucleótidos (p. ejem. GCT), por generar menos artefactos
durante la amplificación conocidos por su nombre en inglés
como stutter
Estos stutter resultan del deslizamiento de la polimerasa
durante la PCR, amplificando un fragmento adicional que
mide una unidad de repetición menos que el alelo real. En
los electroferogramas se ve como un pico de menor tamaño
a la izquierda del pico que representa al alelo
En las últimas generaciones las químicas de amplificación
de los kits comerciales de identificación humana han
incluido DNA polimerasas que generan menos stutter, por
lo que ha disminuido su impacto como artefacto.
 Características de los STRs

Alelos discretos y distinguibles

La amplificación del locus debe de ser robusta y reproducible
cuando se amplifican conjuntamente con otros marcadores.
Alto poder de discriminación, usualmente >0.9, con una
heterocigosidad observada >70%.
Ausencia de ligamiento genético con otros loci que se analizan.
Separada localización cromosómica para asegurar que los loci
estrechamente vinculados no sean elegidos.
Bajo nivel de producción de stutter y bajos niveles de formación
de artefactos durante la amplificación.
Baja tasa de mutación.
La longitud prevista de los alelos se debe de encontrar en el
rango de 90-500 pb.

 MiniSTRs.

Los kits basados en STRs suelen fallar o no amplificar cuando se trata

de muestras antiguas o degradadas.
Se ha observado que es posible hacer amplificaciones exitosas por PCR
simplemente disminuyendo el tamaño de los amplificados (< 100pb),
para ello la estrategia es sencilla, rediseñar los primers para que
hibriden en el sitio más cercano posible al STR, lo que dio origen a los
mini-STRs.
Sin embargo, posiblemente el uso global o más común en casos
forenses a partir de miniSTRs se desarrolla usando el kit comercial
AmpFlSTR®miniFiler kit de Applied Biosystems. Este kit amplifica ocho
STRs: D13S317, D16S539, D7S820, D21S11, D2S441, FGA, D18S51
CSF1PO, más la amelogenina. Desgraciadamente, durante la selección
de los STRs del CODIS no se tomó en cuenta el tamaño, por lo que no
todos los miniSTRS son parte de éste núcleo básico de marcadores.

 Kits STRS comerciales.

Durante más de una década predominaron dos kits, ambos amplificaban 16

loci: 15 STRs y Amelogenina para definir el sexo de la muestra.
AmpFlSTR® Identifiler® kit de Applied Biosystems (Foster City, CA),
PowerPlex 16 ® de Promega Corp. (Madison, CA).
Ambos kits incluyen los STRs del CODIS, pero el Identifiler incluye a los STRs
europeos D2S1338 y D19S433, mientras el Powerplex 16 incluye dos
pentanucleótidos, Penta D y Penta E.
Sin embargo, los STRs del núcleo expandido del CODIS ya están siendo
integrados en los nuevos kits comerciales16.
En los últimos años se integró a la competencia la empresa QIAGEN®, quién
junto con thermoFisher Scientific (antes Applied Biosystems) y Promega Corp.
ofrecen diferentes kits de nueva generación.
Sin embargo, QIAGEN y thermoFisher Scientific analizan los mismos STRs
apegándose al núcleo expandido del CODIS y requiriendo nuevos sistemas de
EC como el ABI 3500. Por el contrario, los nuevos kits de Promega pueden
analizarse en sistemas de EC tradicional e incluyen los Pentas D y E, los cuales
quedaron fuera del núcleo extendido del CODIS por no compartir el diseño de
sus primers.

Análisis de muestras biológicas (sangre, saliva, pelos,

huesos, etc.)

 Esta labor la realizan los Médicos Forenses y la Policía Judicial, Dicho personal
PERSONAL ENCARGADO DE LA RECOGIDA DE
debe tener la formación, conocimientos técnicos y experiencia adecuada para
MUESTRAS el desempeño de estas funciones, por lo que es recomendable el desarrollo de
programas de formación y entrenamiento en esta área, que deberían ir
adaptándose a los avances técnicos que se vayan produciendo.

Cuando se lleva a cabo la recogida de muestras, tanto dubitadas como

PRECAUCIONES DURANTE EL PROCESO DE RECOGIDA
de referencia, deben mantenerse una serie de precauciones
Y ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO encaminadas a proteger tanto al personal que realiza dicha recogida
como a la propia muestra.

IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS En todos los formularios debe aparecer un listado donde se identifiquen
y describan brevemente las muestras.

Listado de las muestras de referencia

Donde debe especificarse:
número de referencia de la muestra.
- Tipo de muestra (sangre, saliva, pelos...). Si la muestra elegida es sangre

líquida, describir el tipo de anticoagulante utilizado en el envío.

- Nombre de la persona a la que se realiza la toma o código elegido para

identificarla.
- Relación con el caso (víctima, sospechoso...)
 LISTADO DE LOS INDICIOS BIOLÓGICOS
donde debe especificarse:
- Nº de referencia de la muestra.
- Tipo de muestra con una descripción breve (p.e., toma vaginal, camisa azul, cuchillo con mango
de madera...).
- A quien pertenece (víctima, sospechoso...) y donde se ha localizado (p.e., coche, garaje, cuerpo
víctima...).
Tipo de indicio en concreto que debe estudiarse (semen, sangre, saliva...

En todos los formularios debe aparecer un apartado dedicado a la cadena de custodia

donde debe constar:
- Nombre o identificación y firma de la/s persona/s responsable/s de la recogida de
CADENA DE CUSTODIA muestras.
- Fecha y hora de la recogida.
- Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío al laboratorio.

La toma de muestras de indubitadas en personas vivas debe hacerse con autorización

judicial y luego de llenar el formulario de consentimiento informado de la persona. Se
TOMA DE MUESTRAS DE REFERENCIA realiza un registro fotográfico y dactilar de los comparecientes. Esta información debe
ser adjuntada al expediente de cada caso. Se debe verificar que la información
suministrada sea la correcta.
 MUESTRAS INDUBITADAS EN PERSONAS VIVAS

a. Sangre:
Es la muestra indubitada clásica, utilizada para la obtención de ADN, y se obtiene
por punción dactilar sobre un papel secante.
Regularmente depositar de 3 a 4 gotas de sangre y dejarlas secar a temperatura
ambiente en un lugar protegido.

b. Células epiteliales bucales (saliva): obtenidas frotando la parte interna de los

carrillos con hisopos estériles en seco, se realizan dos tomas con un hisopo, se
frota la cara interna del carrillo derecho y con el otro la cara interna del carrillo
izquierdo. Los hisopos, correctamente identificados, deben dejarse secar a
temperatura ambiente en un lugar protegido.

c. Pelos con raíz: de 10 a 15 cabellos arrancados con raíz.

Muestras indubitadas en personas que hayan sido sujetas a transfusión sanguínea
Si una persona ha recibido una transfusión de sangre, se debe utilizar como muestra
de referencia, saliva o pelos con raíz, puesto que en la sangre se podría detectar la
presencia del ADN constitucional en mezcla con el procedente del material
transfundido

Muestras indubitadas en cadáveres
en buen estado de conservación
Muestras indubitadas en cadáveres en
avanzado estado de putrefacción o
esqueletizados
b. Dientes: Seleccionar al menos cuatro piezas dentales, de
a. Sangre post mórtem: se recoge una muestra de unos 10 mL de
sangre que debe introducirse en un tubo que contenga un
anticoagulante tipo EDTA e impregnarlo sobre un papel secante.
b. Músculo esquelético: se seleccionan dos fragmentos de
músculo esquelético de la zona mejor conservada, de unos 10
gramos de peso aproximadamente, mismo que se introduce en un
recipiente de plástico con boca ancha y tapa rosca. Se elige este
tipo de tejido por ser, junto con el músculo cardíaco, el más
resistente a la putrefacción
a. Huesos: Limpiar los restos de putrílago y siempre que sea
posible se seleccionará un hueso largo, preferiblemente
fémur. De no disponer de esta muestra, lo recomendable es
ponerse en contacto con el Laboratorio para valorar, en
función de las muestras disponibles y de su estado, cuáles
son las más adecuadas para el análisis.
preferencia molares, que no estén externamente dañados ni
hayan sido sometidos a endodoncias.
 En los cadáveres embalsamados (cadáveres conservados artificialmente
mediante la utilización de líquidos conservantes tipo formol) el ADN
sufre procesos de degradación que hacen, en la mayor parte de los casos,
muy difícil el análisis.
Para seleccionar las muestras más adecuadas, lo recomendable es
ponerse en contacto con el laboratorio y en función de la técnica de
embalsamamiento, antigüedad, etc., valorar que muestras son las más
Muestras indubitadas en idóneas para el análisis.
cadáveres embalsamados


RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS EN EL LUGAR DE

LOS HECHOS

Manchas secas en muestras pequeñas y de fácil transporte

En general, este tipo de muestras serán recogidas e introducidas
por separado en bolsas de papel o cajas de cartón.
A continuación, vamos a describir algunas de las muestras más
frecuentes:

-Colillas: Deben recogerse con pinzas limpias e introducirse por separado

en bolsas de papel o cajas de cartón pequeñas.
- Chicles: Deben recogerse con pinzas limpias e introducirse por separado
en envases de plástico duro.
-Sobres y sellos: Sin despegarse, se recogen con unas pinzas limpias y se
introducen en bolsas de papel o plástico.
- Armas blancas: Se deben recoger con mucho cuidado para no afectar al
estudio de huellas dactilares. Colocarlas por separado en cajas de cartón.
-Llaves, monedas, joyas... etc: Se recogen con unas pinzas limpias y se
introducen por separado en bolsas de papel.
-Piedras, ramas, hojas...etc: Se recogen e introducen por separado en bolsas
de papel.
-Billetes, papeles, cartones pequeños, se recogen e introducen por
separado en bolsas de papel.
 Ropas u otros objetos con indicios húmedos
INDICIOS HÚMEDOS Las ropas de vestir son las muestras que de forma más frecuente
pueden contener indicios húmedos, generalmente manchas de
sangre. No obstante, puede haber otras muestras como las ropas
de cama, toallas, cortinas, etc. En estos casos, las muestras
completas o las manchas objeto de estudio deben introducirse en
bolsas de plástico y trasladarse del lugar de los hechos a las
instalaciones del personal que lleva a cabo la recogida.
 INDICIOS LIQUIDOS

• Sangre • Orina u otros fluidos

• Semen • Líquido amniótico

biológicos

 Sangre en gran cantidad. Se debe recoger con  Los preservativos con semen Deben recogerse con una
Se recoge una muestra de
una pipeta de plástico desechable e introducir en un líquido se cogen, se atan bien para pipeta de plástico
unos 10 ml que se
tubo que contenga un anticoagulante tipo EDTA.. que no se derrame el contenido y desechable e introducirse
introduce en un tubo.
 Sangre en escasa cantidad. Se debe recoger se introducen en un frasco de en tubos o frascos.
con un hisopo estéril. plástico.
 Sangre coagulada. Se debe recoger con una  Semen en escasa cantidad. Se
cucharilla de plástico e introducir en un tubo o debe recoger con un hisopo estéril.
frasco de plástico.
• s.
• s.
 .Deben ser recogidos con unas pinzas limpias, colocando
·PELOS DUBITADOS
cada pelo o cada grupo de pelos en un papel pequeño que

debe ser doblado con cuidado e introducido en una bolsa de

papel pequeña.
 La recogida de restos cadavéricos va a estar condicionada,
RESTOS CADAVERICOS evidentemente, por el tipo de restos que aparezcan en el lugar de los
hechos. En general lo más frecuente es encontrar:

a) Restos cadavéricos en buen estado de conservación

b) Restos cadavéricos carbonizados

c) Restos cadavéricos en avanzado estado de

putrefacción o esqueletizados

d) Restos fetales y placentarios

 SISTEMAS DE EMPAQUETADO Y PRESERVACIÓN

DE MUESTRAS

Los indicios tales como prendas, telas, hisopados, etc., tendrán que secarse previamente
antes del envío.
La adecuada preservación de las muestras biológicas desde su recogida hasta su llegada al
laboratorio es fundamental, ya que los mismos, especialmente los húmedos y los líquidos
son vulnerables a la degradación del ADN en pocas horas. Por lo que se debe aplicar cadena
de frío y realizar un correcto, embalado sellado y etiquetado.
Es imprescindible que todos los recipientes, ya sean tubos, bolsas, cajas, etc., estén
correctamente identificados y precintados, garantizando la autenticidad e integridad de las
muestras.

Gracias