PROBLEMAS EN EL

GENOTIPADO DE
MUESTRAS FORENSES
Lourdes Prieto
Instituto de Ciencias Forenses. Universidad de Santiago de Compostela.
Problemas en el genotipado de
muestras forenses
 Características de los STRs

 Problemas en la analítica (artefactos): spikes, stutters,

picos +/-A, dye blobs, pull-ups, influencia de la
cantidad y calidad de ADN en la PCR (efectos
estocásticos), estudios de validación

 Problemas biológicos: Variantes alélicas, patrones

trialélicos, drop-out alélico, drop-in alélico, mutaciones
 Característcas de los STRs
 Los STRs son pequeñas regiones de ADN que contienen secuencias repetitivas cortas y en
tándem

 Se emplean como marcadores genéticos para rastrear la herencia familiar o mapear

enfermedades en el genoma.

 Se han caracterizado más de 20,000 de loci de STR tetra- (Collins et al. An exhaustive DNA
micro-satellite map of the human genome using high performance computing. Genomics,
2003;82:10-19)

 Las secuencias tipo STR explican aproximadamente 3% del total del genoma humano (Lander et
al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921).

Lectura recomendada características STRs: Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics
of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51(2):253-265.
Tipos STRs
 Según la longitud del repeat

CTGTCTCAAT ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA AATAAAATTT
Triméricos (D9S2157). Cromosoma 9. Alelo 8

ACCCTCACTG AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG TTTGGGCAAA

Tetraméricos (TPOX, Thyroid peroxidase). Cromosoma 2. Alelo 7

GAAAAAAAAG AAAGA AAAGA AAAGA AAAGA AAAGA AAAAACGAAG

Pentaméricos (Penta D). Cromosoma 21. Alelo 5
 Tipos STRs
 Según el nivel de complejidad
6x incompleto 3x
CTCCATGGTG AATG ATG AATG AGGGAAATAA
STR simple STR con alelo no-consenso (TH01). Cromosoma 11. Alelo 9.3

3x 10x
AACTCTACGA CTGT CTAT CCATCCATCC
STR compuesto (D14S1434). Cromosoma 14. Alelo 13

4x 6x 3x 3x 2x 11x
TGAATTGCCT TCTA TCTG TCTA TA TCTA TCA TCTA TCCATA TCTA TCGTCTATCT
STR complejo (D21S11). Cromosoma 21. Alelo 29.
Importancia en el campo forense
¿Por qué se eligieron los STRs como marcadores genéticos en el campo
forense?
• Proceso de análisis rápido
• Abundantes a lo largo del genoma
• Muy variables intra-poblacionalmente
• Rango de tamaño pequeño (permite el desarrollo de multiplexes)
• Alelos discretos (facilita el análisis de los datos)
• Ladders alélicos (simplifican la interpretación)
• Buenos resultados a partir de poca cantidad de ADN
• Compatibles con ADN degradado
• Fácil estandarización (intercambio datos entre labs)
 Análisis en multiplex
 La PCR se utiliza para copiar (amplificar) regiones de STR y marcar los fragmentos
con moléculas fluorescentes utilizando primers específicos de cada STR
 De esta forma podemos detectar a la vez varios STRs del mismo rango de tamaño, si
están marcados de forma diferente

STR 1

STR 2
 Electroforesis capilar
 Separación de los fragmentos amplificados según tamaño y color, mediante
electroforesis capilar (interacción del ADN con una «maraña» de polímero)
 El polímero se renueva tras cada carrera
 La longitud del capilar y la concentración del polímero determinan las características
de la separación

ADN -
- ADN
- +
ADN -
ADN-
ADN-
Electroforesis capilar
Electroferograma
Lectura epgs
 ¿Qué es un alelo? ¿Qué es un heterocigoto?
¿Qué es un stutter? ¿Qué otros artefactos
podemos encontrar? ¿Qué fenómenos
genéticos nos pueden aparecer?
 Gill et al (1997) Development of
guidelines...Forensic Sci Int. 89:185-197
Lectura epgs: ¿qué es un alelo?
 Ejemplo: 3 veces la desviación estándar del
ruido de fondo
Cada laboratorio debe realizar su propia validación
Algunos ejemplos:
Umbral analítico (límite de detección): un
alelo es un pico por encima de 50 RFUs
Umbral estocástico: un pico de 150 RFUs
es un resultado fiable
Establecimiento de los umbrales por canal
Problemas en el genotipado de
muestras forenses
 Características de los STRs

 Problemas en la analítica (artefactos): spikes, stutters,

picos +/-A, dye blobs, pull-ups, influencia de la
cantidad y calidad de ADN en la PCR (efectos
estocásticos), estudios de validación

 Problemas biológicos: Variantes alélicas, patrones

trialélicos, drop-out alélico, drop-in alélico, mutaciones
Artefactos

Stutter
D3S1358

Adenilación
incompleta
Artefactos: spikes
 Picos muy estrechos debidos a:
 fluctuaciones del voltaje
 la presencia de burbujas minúsculas en el polímero
 cristales de urea en el polímero
 material fluorescente en el polímero o la formamida
 Fáciles de identificar: se observan en la misma
posición, en todos los colores
 Se evitan con un buen mantenimiento de los equipos,
siguiendo las recomendaciones del fabricante en cuanto
a reactivos y manejos de muestras
 Stutters
 los stutters son productos alélicos, por lo que su identificación como artefactos es más complicada

Deleción causada por slippage en la

hebra copiada (abajo)
Alelo real
1 2 3 5 (tetranucleotide repeat)
5’ GATA GATA GATA GATA

3’ CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT

Inserción causada por slippage de la
1 2 3 C 5 6 hebra copia (arriba)
T AT
4 2’
n-1 n+1
stutter stutter 1 2
5’ GATA GATA
product product
3’ CTAT CTAT CTAT

John Butler 1 2 3
Artefactos: productos stutter n-1
 Picos que tienen un repeat menos que el alelo real y que son
el resultado del “slippage” durante la síntesis1
 Los stutter son menores cuanto mayores son las unidades de
repetición
 (STRs diméricos > tri- > tetra- > penta-)
 Cada producto stutter sucesivo es menos intenso
 (alelo > repeat-1 > repeat-2)
 Los picos stutter hacen más difícil el análisis de mezclas
1 Walsh, P. S., N. J. Fildes, and R. Reynolds. 1996. Sequence analysis and
characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA.Nucleic
Acids Res 24 (14): 2807–12.
 Artefactos: productos stutter n-1
YCAII
% de stutter
~45%
• Dinucleotido (CA)(CA)(CA)(CA)
High stutter • Trinucleotido (GCC)(GCC)(GCC)
Low stutter
• Tetranucleotido (AATG)(AATG)(AATG)
DYS448
• Pentanucleotido (AGAAA)(AGAAA)
<2%
• Hexanucleotido (AGTACA)(AGTACA)
Artefactos: productos stutter n-1
 La cantidad de stutter producido varía según el marcador,
pero también según el alelo dentro de un marcador

 Los porcentajes aumentan

con el número de repeats
idénticos
 Artefactos: productos stutter
 Porcentajes de stutter
por alelo
 Dependen de la longitud
del alelo y de su
composición

 Holt CL, Buoncristiani M, Wallin

JM, Nguyen T, Lazaruk KD,
Walsh PS. TWGDAM validation
of AmpFlSTR PCR amplification
kits for forensic DNA casework.
J Forensic Sci 2002; 47(1): 66-
96.
 Artefactos: adenilación
Adenilación  También llamados picos split o +/-A
incompleta
+A +A
 La Taq polimerasa añade frecuentemente un nucleótido
extra en el extremo del producto PCR; suele ser una “A”1
-A -A  Se puede aumentar este efecto con una extensión final tras
los ciclos PCR (15-45 min a 60-72 oC)
 Lo mejor es conseguir que no exista mezcla de picos “+/- A”

D8S1179
1
A
Clark, J. M. 1988. Novel non-templated nucleotide
addition reactions catalyzed by procaryotic and A
eucaryotic DNA polymerases.Nucleic Acids Res 16
(20): 9677–86.
Artefactos: adenilación
El exceso de ADN en la PCR produce adenilación
incompleta
DNA Size (bp)
Relative Fluorescence (RFUs)

-A off-
scale
+A 10 ng
template
(exceso)

D3S1358 VWA FGA

2 ng
template
(correcto)
Artefactos: dye blobs
 Los primers se sintetizan en dirección 3' a 5'
 La molécula fluorescente se añade al final,
en el extremo 5'
 La adición de la molécula fluorescente no
ocurre en el 100% de los primers
 Las moléculas fluorescentes no
incorporadas al primer producen dye blobs
si los primers no se purifican tras su síntesis
 A lo largo del tiempo, los enlaces entre las
moléculas fluorescentes y el primer acaban
rompiéndose
Artefactos: dye blobs
 Características:
 Más anchos que los alelos reales
 No se ven en todos los colores
 Se evitan siguiendo las
recomendaciones del fabricante en
cuanto a las condiciones de
almacenamiento de los kits
 En multiplexes manuales se evitan
purificando los primers o
purificando el producto amplificado
Artefactos: pull-ups
 Reflejos de un canal en otro/s debidos a:
 Fallo del software a la hora de discriminar entre
colores en la generación de datos
 Sobre-saturación
 Se reconocen comparando el tamaño del pico
sospechoso en varios canales
 Pueden enmascarar alelos
 Se evitan:
 Realizando una nueva matriz
 Inyectando la muestra mas diluida o amplificando
con menos cantidad
Estudios de validación
 Deben incluir:
 % de los stutters respecto a su alelo
 Alturas de picos
 Altura mínima de picos (umbral de detección / analítico)
 Equilibrio entre loci
 Estos parámetros dependen de la cantidad de ADN
de partida:
 Si se analizan muestras del tipo low-level DNA, el % de
stutter puede ser mayor y las alturas de los picos menores
STRvalidator
 Software gratuito y open soruce para estudios de validación
interna de kits STR
 https://sites.google.com/site/forensicapps/strvalidator
 Con módulos de análisis para umbral analítico, stutter,
equilibrio entre loci, Hb, drop-out, concordancia entre kits,
mezclas, precisión, pull-up, drop-in.
 Facilita mucho los estudios de validación (los datos se
pueden importar directamente desde GeneMapper®
software, los umbrales se calculan automáticamente, se
obtiene un informe de validación…).
Impacto de la cantidad de ADN en la PCR
DNA Size (bp)
 La cuantificación de ADN antes de
la PCR es importante en ensayos

Relative Fluorescence (RFUs)

-A
multiplex
+A
10 ng template
• Demasiado ADN (exceso)

– Picos off-scale
– Picos split (+/-A) D3S1358

– Desbalance entre Loci

2 ng template
(correcto)
 Impacto de la cantidad de ADN en la PCR
DNA Size (bp)
 La cuantificación de ADN antes de
la PCR es importante en ensayos
multiplex 100 pg
template

• Poco ADN 5 pg
– Desbalance en template
heterocigotos
– Drop-out alélico
– Desbalance entre loci Efectos estocásticos en la amplificación
de bajas cantidades de ADN = drop-out
Equilibrio de heterocigotos
 Normalmente, en perfiles individuales, los heterocigotos presentan áreas o alturas
relativas de mas del 60% (un alelo respecto al otro)
 Cálculo de Hb:
 Altura (o área) de pico del alelo minoritario / altura (o área) de pico del alelo
mayoritario

John Butler
Impacto de la calidad del ADN en la PCR

 Las muestras sometidas a efectos ambientales

(calor, humedad, luz solar) pueden sufrir la
degradación de su ADN (rotura en fragmentos
más cortos)
 Si la rotura afecta a un locus STR, no
conseguiremos su amplificación
 La degradación se identifica en el epg por un
descenso en la altura de los picos de los
marcadores de mayor tamaño
 El exceso de muestra también puede producir un
perfil así, pero se suelen ver picos +/-A en los
marcadores de menor tamaño
 Efectos estocásticos: ¿qué son?

 Supongamos que tenemos un extracto de ADN con

volumen = 50 µl que contiene el ADN de sólo 7 células
 Supongamos que el donante es heterocigoto
 Habrá 7 copias del alelo A y otras 7 del alelo B.
 Tomamos una alícuota de 25µL
 ¿Cuántos alelos habremos capturado?

Peter Gill
 Efectos estocásticos: ¿qué son?
 Si repitiéramos la operación infinitas veces obtendríamos los
siguientes resultados:

Peter Gill
 Efectos estocásticos: ¿qué son?
 Tras la extracción:
 tomamos una alícuota para
cuantificar
 otra para diluir
 otra para la PCR
 La PCR no es 100% eficaz, pero
esto tiene menos efecto que la toma
de alícuotas
 Todo esto da lugar a diferentes
resultados:

Peter Gill
Efectos estocásticos: ¿cómo influyen?

Los efectos estocásticos producen:

 Drop-out de loci: no se observan alelos en un locus

 Desequilibrio de heterocigotos (diferencias en la altura de los dos alelos de un

heterocigoto)
 Drop-out alélico: no se observa uno de los alelos en un heterocigoto (es el
desbalance llevado al extremo)
 Aumento de stutters: el porcentaje (en altura o área) respecto al alelo real está
incrementado
 Drop-in alélico: 1 o 2 alelos extra procedentes del ambiente del lab, de
reactivos o de plásticos
 Diferencias entre duplicados de la misma muestra, debido a:
 Diferencias en el número de moléculas de partida en los replicados
 Diferencias inducidas por la variabilidad en la PCR
Problemas en el genotipado de
muestras forenses
 Características de los STRs

 Problemas en la analítica (artefactos): spikes, stutters,

picos +/-A, dye blobs, pull-ups, influencia de la
cantidad y calidad de ADN en la PCR (efectos
estocásticos), estudios de validación

 Problemas biológicos: Variantes alélicas, patrones

trialélicos, drop-out alélico, drop-in alélico, mutaciones
Variantes alélicas
MICROVARIANTES
 Son alelos que no son múltiplos del motivo de repetición básico o
alelos que presentan variaciones en la secuencia
 Pueden ser inserciones, deleciones, o sustituciones
 La variación de la secuencia puede aparecer dentro del repeat, en
la región flanqueante o en la zona de unión al primer
 Si la variación se encuentra en la zona de unión al primer se
pueden causar fallos en la PCR (“alelos nulos o silentes”)
 Listado de microvariantes en
http://www.cstl.nist.gov/strbase/var_tab.htm
Variantes alélicas
ALELOS INTERMEDIOS: nomenclatura
 nº de repeats completos . nº bases que contiene el repeat
incompleto
 Ejemplo: alelo 9.3 de TH01: [TCAT]4 -CAT [TCAT]5

Deleción de T
Variantes alélicas
[GATA]10[GATA][GATA][GATA][--TA][GATA][GATA]

Microvariante
alélica
Variantes alélicas
 Ejemplo de microvariante "off-ladder" en el locus DYS635

Bin alelo 22:

258,75 +/- 0,5 = 258,25 a 259,25

Alelo 21.3:
257,84 (a -0,41 del
bin)
Variantes alélicas

 SNP en el repeat de D8S1179

 Repeat: TCTA
 Las tres muestras se genotipan
como 13-13 mediante EC
 El análisis con MPS indica la
presencia de SNPs
 Confirmación de la existencia de 4
alelos diferentes en las tres
muestras mediante secuenciación
Variantes alélicas
 Alelos mayores o menores que el ladder
 Nomenclatura (si no se secuencia):
 Menor que «alelo menor del ladder»
 Mayor que «alelo mayor del ladder»
Variantes alélicas no descritas
 Se pueden enviar las nuevas variantes para su
secuenciación al NIST:
 http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/STRseq.htm

 Se requiere un mínimo de 10ng para secuenciación

 STRbase tiene tablas resúmen de alelos que se han
enviado y secuenciado (si el laboratorio que envía la
muestra está de acuerdo en compartir la información)
Variantes alélicas entre dos loci
 Usar otro kit con
combinaciones de loci distintas
 Hacer singleplex de cada loci
involucrado
 Butler (2006). Genetics and
genomics of core STR loci
used in human identity testing.
J. For. Sci. 51(2): 253-265
Variantes alélicas entre dos loci
 ¿A que locus pertenece el alelo fuera del ladder?
 Tener en cuenta la heterocigosidad de cada locus (Ej.: D16
= 0,766; D19 = 0,882)
 Recordar que los patrones tri-alélicos y los homocigotos
son menos comunes que los heterocigotos
 Buscar en STRbase si la variante alélica está descrita
Patrones trialélicos
 Clayton et al. (2004), A genetic basis for anomalous band patterns
encountered during DNA STR profiling. J. For. Sci. 49 (6): 1207-1214

Tipo 1: La suma de las alturas de Tipo 2: Alturas de pico

dos de los picos es igual al tercero balanceadas (común en TPOX y
(común en D18S51) D21S11)
Patrones trialélicos
 Tipo 1: Suelen ser el resultado de una mutación
somática en un locus heterocigoto durante el
desarrollo del individuo. Se produce una quimera con
algunas células con el alelo original y otras con el
mutado.

 Tipo 2: Suelen ser el resultado de un evento de

duplicación localizado, de una aneuploidia
cromosómica o de reordenamientos cromosómicos
Patrones trialélicos
 Frecuentes en algunas poblaciones
 Lane (2008), The nature of tri-allelic TPOX genotypes in
African populations. FSI:Genetics 2 (2): 134-137:
 El 2,4% de sud-africanos indígenas tienen tres alelos en
TPOX en lugar de dos.
 El alelo extra es casi siempre el 10 y segrega
independientemente de los otros dos alelos
 Las mujeres muestran patrones tria-lélicos el doble de veces
que los varones, lo cual sugiere que el alelo extra se
encuentra en el cromosoma X
Patrones trialélicos
 Patrones tri-alélicos en TPOX descritos en STRbase:
 http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_TPOX.htm#Tri

Sólo en 4 casos el alelo 10 no

está presente (78 casos
totales)
Patrones trialélicos
 ¿Patrón tri-alélico en FGA? (Identifiler)
h 12/10 = 0,48

h 19/24 = 0,55
h 25/24 = 0,89
Patrones trialélicos
 ¿o es un patrón tri-alélico en D13S317? (Powerplex16)

h 12/10 = 0,48

h 13/11 = 0,83
h 14.3/11 = 0,42
 Patrones trialélicos
 Realmente es un
patrón tri-alélico en
D5S818 (importancia
del uso de diferentes
kits)
Patrones trialélicos
 Resultados del análisis de D5S818 en monoplex
 Drop-out alélico por alelo silente
Mutación en la zona de anillamiento de uno
de los primers de D18 del kit Identifiler
Los heterocigotos aparecen como falsos
homocigotos
Los primers del kit PowerPlex 16 anillan en
otra zona
Problemas en la comparación de resultados
entre laboratorios
Porblemas en las bases de datos
Muy importantes los estudios de
concordancia entre kits
 Drop-out alélico por alelo silente
Impacto de la variación de la secuencia de ADN en la zona de anillamiento del
primer
Heterocigoto con alelos
equilibrados
6 8 No mutación

Altura de los picos alélicos

desequilibrada
Mutación en la mitad
6
de la zona de
8
* anillamiento del
primer
 Drop-out alélico por alelo silente
Impacto de la variación de la secuencia de ADN en la zona de anillamiento del
primer

8
Mutación en el
* extremo 3’ de la
zona de anillamiento
del primer (allele
El alelo 6 no se drop-out)
amplifica
Drop-in alélico
 Patrones trialélicos
 Duplicaciones
 Mutaciones somáticas
 Las alturas de los picos
dependen de la proporción de
células mutadas
 Si el nuevo alelo es distinto:
patrones trialélicos
 Si el nuevo alelo es igual:
patrones bialélicos
desequilibrados (ej.: XYY)
Problemas con locus amelogenina
 Varones con sólo X
 Santos et al. (1998)
 Deleción en amel del
cromosoma Y
 Perfil asignado a una
mujer erróneamente
 Analizar STRs del Y
(muestras indubitadas)
Nuevos kits incluyen más marcadores del crY (Yidel, DYS…)
 Varones con solo Y
 Shewale et al. (2000)
 Deleción en amel de
cromosoma X (3 en
7000)
 Sin problemas de
asignación de género
 Problemático en las
mezclas
 Mutaciones
Cambios en el número de repeats
Alelo 6

Expansiones: ganancias
Ganancia 1 step Alelo 7

Contracciones: pérdidas

Pérdida 1 step Alelo 5

 Mutaciones
 Afectan
principalmente a los
casos de paternidad
y de identificaciones
cadavéricas
 Habitualmente las
paternas son más
frecuentes que las
maternas
 Mutaciones
 Las deleciones de 4pb en zona flanqueante pueden dar lugar a
designaciones alélicas distintas según el kit usado

Identifiler Minifiler

Drabek et al. (2004), Concordance study between miniplex STR

assays and comercial STR typing kit. J. For. Sci. 49 (4): 859-860
 Mutaciones
 La deleción de 4pb en la zona falnqueante
causa esta variación de un repeat
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Mutaciones
 Tasas de
mutación
en
STRbase
Mutaciones en YSTR
Marcadores  Aparentemente dos mutaciones,
multiloci
pero en realidad sólo una