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Guia de Problemas de Genetica 2007

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Genética 1 Guía de Problemas

Segundo Cuatrimestre de 2007

Profesores responsables: Dres. Esteban Hopp, Beatriz Saidman y Liliana Mola

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1. CONCEPTOS Y TÉCNICAS BÁSICOS DE GENÉTICA MOLECULAR
Bibliografía: Repaso IBMyC, Alberts, Griffiths Cap 1 y Recombinant DNA (Watson et al.).
secuenciación masiva de genes y genomas posibilitando el advenimiento de la genómica y proyectos como el genoma humano. La técnica de M&G es un método degradativo y tiene 2 reacciones “de terminaciones de nucleótidos” inespecíficas (revela 2 nucleótidos y el verdadero se saca por comparación con otra calle del gel). Esta razón dificulta, además, la automatización. Por otro lado resultan más difíciles de controlar las condiciones. 3) ¿En qué consiste la PCR de punto final? ¿Es una técnica cualitativa o cuantitativa? ¿Qué diferencias existen entre PCR de punto final y PCR de tiempo real? ¿Es posible hacer una PCR a partir de RNA? ¿Cómo? ¿Puede utilizarse para diagnóstico (la detección de HIV, por ejemplo)? ¿Qué ventajas o desventajas tendría respecto a otras técnicas diagnósticas como el ELISA? R: PCR: polymerase chain reaction (esquema del Recombinant DNA de Watson et al.) - Utiliza la Taq polimerasa: Thermus aquaticus - Permite amplificar segmentos específicos de ADN. - No requiere digestión del ADN. - No requiere clonar el segmento - Se requiere poca cantidad de ADN. Es una técnica fundamentalmente cualitativa, debido a que llega a una meseta de amplificación por limitantes que no suelen ser la concentración del templado. La PCR en tiempo real va siguiendo la cinética de amplificación permitiendo comparar las fases logarítmicas de amplificación entre sí y así cuantificar con precisión los templados frente a una referencia o estándar. Para realizar una PCR a partir de RNA se debe hacer RT-PCR (se llama igual que la otra –una por RetroTranscriptasa y la otra por Real Time). Se realiza la primera reacción con retrotranscriptasa y después se continua con Taq pol. Es posible utilizar PCR para diagnóstico y tiene como ventaja que se trata de un método directo (detecta al virus y no los anticuerpos con los que reacciona el paciente). Por eso sirve para la detección en recién nacidos o personal médico de alto riesgo que trabaja con pacientes, antes de los 6 meses que tarda en detectarse una respuesta inmunológica. No da falsos positivos (salvo por contaminación de amplicones: un problema general de las PCRs). Desventajas: más complejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hay que purificar RNA e implica mayor exposición al virus por parte del personal que hace el diagnóstico. 4) ¿En qué consiste un Southern blot? ¿y el northern? ¿y el western? ¿Para qué se usan y qué tipo de moléculas se detectan en cada caso? ¿Qué relación tiene el Southern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones de los RFLPs. Compare la utilización de Southern vs. PCR, northern vs. RT-PCR y western vs. ELISA. R: Southern blotting:

Guía teórica:
1) ¿Qué son, de dónde se obtienen y para qué sirven las enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de restricción? ¿Cómo hacen las bacterias que producen ER para evitar que su genoma se vea afectado por las mismas? ¿Qué tipos de especificidad presentan? ¿Qué tipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato? R: Las endonucleasas de restricción son producidas por bacterias como mecanismo de defensa contra los fagos. El genoma se encuentra protegido por metilación específica del sitio de restricción mediante una metilasa con igual especificidad que la endonucleasa. Cortan el ADN en sitios específicos (secuencias definidas de ADN de 4 ó 6 bases, generalmente). Algunos dejan extremos cohesivos, otros dejan extremos romos. Siempre el sitio blanco (de reconocimiento) es un palíndrome, aunque el sitio de corte puede no coincidir con el sitio de reconocimiento. Los fragmentos generados se pueden separar fácilmente mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La velocidad de los fragmentos depende de su longitud: los más pequeños migran más rápido. 2) ¿En qué consiste la técnica de secuenciación de Sanger? ¿Qué trascendencia tuvo y tiene en Genética y Genómica? ¿Porqué desplazó a la técnica de Maxam & Gilbert? ¿Cuál es la ventaja de la secuenciación automática y en qué se diferencia de la manual? R: En la secuenciación manual, se suele marcar con radioisótopos y se corren 4 calles por secuencia (una para cada nucleótido). Se revela por autoradiografía. Secuenciación de Sanger (ver esquema de libro): secuenciación por dideoxinucleótidos - ADN simple cadena - Oligonucleótido iniciador (primer) - Incubación c/ 4 diferentes dideoxinucleótidos (uno para cada calle) - (Mono)deoxinucleótidos (uno de ellos marcado, usualmente α[32P]dCTP) - Electroforesis en gel de poliacrilamida Existen métodos no radiactivos (como tinción con nitrato de plata), pero son menos utilizados. En la secuenciación automática se marca con fluorocromos (aquí se marca el primer, con un color distinto para cada nucleótido a detectar) y se corren las cuatro reacciones en el mismo carril (que suele ser un capilar). Los fragmentos se detectan mediante un láser a la salida del gel que distingue los 4 fluorocromos. No requiere detener la corrida electroforética, por lo que revela un mayor número de nucleótidos. Permitió la

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- Se parte de ADN (genómico de alto peso molecular en el caso de los RFLP) y se lo digiere con enzimas de restricción. - Los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. - Se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa y se desnaturaliza el ADN. - Se incuba con una sonda marcada específica de la secuencia en estudio. - Lavado y exposición del filtro. - Detección autoradiográfica o fluorográfica. Esta técnica permite determinar: a) Presencia y número de sitios de corte con una determinada enzima de restricción en un fragmento de ADN dado y establecer la existencia de polimorfismos para fines diagnósticos o de estudio genético (RFLP). b) Número de copias (aproximado) del gen en el genoma, por ejemplo cuando se hacen transgénicos. Los RFLP surgen de comparar los patrones de restricción de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Aplicaciones de los RFLP: - mapeo genético - diagnóstico prenatal - diferenciación de individuos (fingerprinting) - estudios evolutivos Northern blotting: - El ARN celular total o mRNA se separa por tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa (en presencia de un agente desnaturalizante como el formaldeído para evitar la formación de estructuras secundarias en el ARN durante la corrida). - Se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a un papel tratado químicamente. - Hibridación con una sonda apropiada marcada seguida por autoradiografía. Se revelan bandas que indican el número y tamaño de los tipos de ARN complementarios a la sonda. Permite cuantificar aproximadamente y evaluar niveles de expresión de genes (para mejor precisión se usa RT-PCR en tiempo real). También es útil, entre otras cosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque el tamaño de un mRNA específico puede compararse con el tamaño de los cDNA copiados de ese mRNA, y revela si este cDNA está completo. En el Western blotting se transfieren proteínas corridas en un gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y luego se las visualiza por su reacción con anticuerpos específicos. La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern para varias de sus aplicaciones (por ser menos complejo, tener menos requerimientos de cantidad de templado, y porque puede automatizarse mejor) pero no en todos los casos (por ej., comparaciones evolutivas). Pero aún en este último caso, hoy en día empiezan a ser reemplazados por los SNPs o por comparación directa de la secuencia nucleotídica de genes dia-

gnósticos. En algunos casos, se puede tener una sonda pero no conocer la secuencia nucleotídica para diseñar los iniciadores, por lo que se puede hacer un Southern si no se tiene la información como para hacer PCR. Northern y RT-PCR, ídem que con Southern. La PCR “común” (denominada de punto final) no es cuantitativa, para ello se debe hacer PCR de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). El western es más específico que el ELISA (se identifica la banda). No da falsos positivos. Es más complejo y caro. Se utiliza para confirmación del HIV, por ej. 5) Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta: a) Un experimento de northern requiere desnaturalización de la doble cadena de ADN. b) En una reacción de PCR estándar se utilizan dos primers complementarios a la cadena codificante. c) La secuenciación por el método de Sanger no requiere, en ningún paso la desnaturalización de la doble cadena del ADN. d) Al leer una autoradiografía en una secuenciación de Sanger el extremo 5´ del fragmento secuenciado se encuentra más cerca del polo positivo y el extremo 3´ más cerca del polo negativo. R: a) FALSO. Se trata de ARN de simple cadena el que se somete a electroforesis. b) FALSO. Se utilizan dos primers complementarios a las dos cadenas. c) FALSO. En esta secuenciación se requiere la desnaturalización del ADN. d) VERDADERO: Dado que es un método de secuenciación por síntesis, los fragmentos más pequeños corresponderán a la región 5´ del fragmento a secuenciar. Estos fragmentos pequeños migran más y lo hacen hacia el polo positivo (ya que el ADN tiene carga negativa).

Problemas:
1) Suponiendo un alineamiento al azar de nucleótidos en un fragmento de ADN, ¿cuál es la probabilidad de que una endonucleasa de restricción cuyo sitio de reconocimiento consta de cuatro bases pueda cortar el ADN? ¿y para una enzima de seis bases? ¿y para una de ocho? R: A T C G 4 bases ¼ X ¼ X ¼ X ¼* ( ¼ )4 = 3.9 10-3 *(probabilidad de que c/base se encuentre y que al lado se encuentre una base cualquiera) 6 bases ( ¼ )6 = 2.4 10-4 8 bases ( ¼ )8 = 1.5 10-5 Fórmula general: (1/4)n, donde n = longitud de la secuencia que se busca. A medida que aumenta el número de bases disminuye la probabilidad de encontrar un sitio blanco de restricción. 2) Un fragmento de ADN clonado, con extremos cohesivos generados por EcoRI, lleva el gen que codifica para un polipéptido de la cápside de un virus que infecta a humanos, pero que enferma sólo a personas

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que tienen las defensas inmunológicas disminuidas. Ese fragmento de ADN, que tiene 8 kpb de longitud, se inserta en el plásmido bacteriano pBR322 en su único sitio para EcoRI. El plásmido recombinante es clivado por dos endonucleasas de restricción (por separado o juntas) y luego es sometido a electroforesis en un gel de agarosa y teñido con bromuro de etidio. En la figura se muestra el patrón de bandas (visualizadas por medio de luz UV) originado por cada uno de los tratamientos:
A) EcoRI B) BamHI C) E + B
8 kpb 6 kpb

a) ¿Cuál será el patrón de bandas del RFLP para un individuo A1A1 utilizando la sonda 1? ¿Y para uno A2A2? ¿Y para el heterocigota? b) ¿Y con la sonda 2? R:
Sonda 1
A1A1 A2A2 A1A2 6 kpb 4 kpb 6 kpb 4 kpb 2 kpb

Sonda 2
A1A1 A2A2 A1A2

5,5 kpb 4,5 kpb 4 kpb

4 kpb 3,5 kpb 3 kpb 2,5 kpb 1 kpb

Al realizar Southern blots de los geles "B" y "C", ¿qué fragmentos hibridarán con una sonda del gen de la cápside del virus? R:
EcoRI 3 2,5 BamHI 5,5 4 4,5 3,5 1 EcoRI BamHI 4 BamHI

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Aclaración: Las distancias que se encuentran dentro del círculo son las correspondientes a los sitios de cortes BamHI. Las subrayadas, más externas, marcan la distancia entre los dos sitios EcoR I y las que están en negrita corresponden a las distancias entre cada sitio de corte (representado por las flechas). Los fragmentos de 3, 4 y 1 kpb del gel C están dentro del segmento de 8 kpb, y estos hibridan con la sonda del gen de la cápside del virus. Dado que todos los fragmentos del gel B contienen una porción del gen viral todos los fragmentos de este gel hibridarán con la sonda. 3) Un investigador está estudiando un polimorfismo en el largo de los fragmentos de restricción (RFLP) ubicado en el cromosoma 7, que presenta dos alelos. El sitio de corte para EcoRI indicado con la flecha está presente en uno de los alelos (A1) y ausente en el otro (A2).
Sonda 1 Sonda 2 EcoRI EcoRI EcoRI

4 kpb

2 kpb

4) Un investigador está estudiando gen bacteriano que presenta tres dominios y desea introducirle mutaciones a dicho gen con el fin de estudiar su funcionalidad. Para ello parte del gen, del cual conoce su secuencia completa, clonado en un plásmido para su expresión en bacterias. a) ¿Cómo haría para delecionar el dominio intermedio del gen? b) ¿Cómo haría para verificar que el vector generado porta la deleción? c) ¿Qué elementos de secuencia debe tener el plásmido para poder mantenerse, amplificarse y expresarse en bacterias? R: a) Un método posible es cortando con una misma enzima de restricción (o dos enzimas distintas que dejen extremos compatibles) flanqueando el dominio intermedio. Luego se religa el vector al cual le faltará el domino intermedio. En caso de que no se encuentren dichos sitios de restricción se pueden generar mediante mutagénesis sitio dirigida. b) Para verificar que el vector porta la deleción se puede hacer una PCR con primers flanqueado la secuencia del dominio intermedio. Si está deletado dará un producto de PCR de menor tamaño. c) El vector deberá tener un origen de replicación para poder duplicarse en la bacteria y un marcador de selección (generalmente un gen de resistencia a antibiótico) de forma de poder seleccionar a las bacterias transformadas. En el caso de un vector cuya finalidad sea la expresión en bacterias, deberá tener además una secuencia promotora río arriba del sitio múltiple de clonado (región con sitios únicos de corte para muchas enzimas de restricción). 5) El interferón α está codificado por un gen que no contiene intrones. Por clivaje con BamHI, se genera un único fragmento de restricción conteniendo al gen completo, que puede ser identificado en un Southern blot con una sonda de cDNA marcada radiactivamente. Para determinar la posible causa de una inmunodeficiencia, muestras de sangre de pacientes y de personas no afectadas fueron utilizadas para estudiar el gen del interferón α y la expresión del mismo. Se muestran a continuación autorradiografías de Southern y northern de dichos experimentos, así como también un

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western blo representat ot tivo utilizand anticuerp ando pos ti-interferón α. Los indi n ividuos 1 y 2 no son afe ectados (sanos). En base a los resultados o n obtenidos en Soutn hern, northe y western ern n:
Southern Nort thern Western W

1 2

3 4

5

1 2

3 4

5

1 2

3 4

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a) ¿Cuál sería la posib causa de l inmunodeficienble la cia en los pa acientes 3, 4, y 5? b) ¿Qué ca aracterística particular ti iene el individuo 2 para el gen del interferó α? ón c) ¿Importa a partir de qué tejido s realizó el Souta se l hern? ¿Y el Northern y el Western? R: a) Pacie ente 3: En ba al northe notamos que el ase ern paciente 3 no present mensajero funcional. Esto ta o podría debe a una mu erse utación punt tual en el pro omotor del gen, qu inhibe su expresión. Dado que el frague mento de re estricción es de mayor t s tamaño (corr mere nos en el S Southern) po odría tratarse de una mu e utación puntual en el promotor perdiéndos un sitio b r se blanco para la enz zima de res stricción uti ilizada en p para el Southern. T También pue ser inser ede rción en la región promotora y por lo tant no dará m to mRNA. El hec de cho no presenta mensajero trae como consecuen ar o o ncia la

al servarse a pa artir ausencia de proteína lo cua puede obs del western. aciente 4: pre esenta el ale de tamañ normal en el elo ño n Pa So outhern, men nsajero de tam maño salvaje pero una p e, proteína defectuos de menor tamaño. Po sa r odría debers a se un mutación p na puntual que genera un codón Stop p c prema aturo y una p proteína de m menor tamaño o. Pa aciente 5: el t tamaño del fr fragmento de restricción, del e me ensajero y la proteína parecieran ser normales, sin a em mbargo, pres senta inmun nodeficiencia Esto pod a. dría exp plicarse por una mutació puntual que provoca un ón q cam mbio aminoa acídico y la p proteína pier su activid rde dad (ca ambio confo ormacional) o bien que el origen de la e enfermedad no tenga relac o ción con est proteína. Por ta eje emplo podría tratarse de u mutación en el recep a una ptor de interferón α lo cual dar un fenotip similar al de ría po l los otros pacie s entes. Habría que demostrar, en un sia gu uiente paso, s la proteína es o no fun si a ncional. ¿Se les ocu como ha urre acerlo? b) El individu 2 es heter uo rocigota para dos varian ntes alé élicas del gen del interfer α, mient que los r n rón tras restan son hom ntes mocigotas par uno (indiv ra viduos 1, 4 y 5) u otro alelo (in o ndividuo 3). c) Dado que e Southern se hace a partir de DN el NA gen nómico y to odas las célu ulas tienen el mismo DN e NA ent tonces no im mporta a par de qué tejido se ext rtir t trae mi ismo. En cam mbio en el n northern y en el western sí e n im mporta dado que se está evaluando la expresión de l n los genes, la cu puede ser tejido específica (como en s ual r o est caso). te

1. DIVIS SIÓN CEL LULAR
b) mitosis y meiosis II sis is c) meios I y meiosi II Co onsidere las d diferencias ta anto en el mecanismo co omo en los producto finales. os 3) El gráfico r representa la variación del contenido de o AD durante e ciclo vital de una célul DN el la:

Bibliograf fía:
• Alberts y col. Cap. 17. Seccione La estrate es: egia general del ciclo cel lular, Cap. 20 Células ger 0 rminales y fertilización Beneficios del sexo, Meiosis n: hs ompor• Griffith y col Cap.3: Mitosis y meiosis, Co tamient paralelo de genes auto to osómicos y c cromosomas, Genética me endeliana y c ciclo de vida. . # problemas opcionales s #1) ¿Cuáles son los mecanismos qu generan v s ue variabilidad en los organismos? 2) Enumere al menos 4 diferencias e e entre: a) mi itosis y meiosis I

¿Qué ocurr en el interv de tiemp de 2 a 3? re valo po ¿C Cómo se deno omina la fase que transcu entre 3 y 4? e urre ¿E gráfico c Este corresponde a un ciclo mi itótico o a un no me eiótico? ¿Si la cantidad de ADN no se ha modif d ficado al fina al del ciclo, ¿qué utilidad tien este proces ne so?. 4) Si “C” es la cantidad de ADN conte a e enida en un game eto, ¿cuál se la cantid de ADN (C, 2C, 4 erá dad N 4C),

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cromosomas y cromátidas en los siguientes períodos del ciclo celular en la especie humana? Marque con H ó D si la célula es haploide o diploide. valor Nºcromo- Nº cromá- H/D “C” somas tidas
G1 premitótica G2 premitótica Profase mitótica Metafase mitótica Telofase mitótica (en c/núcleo) Espermatozoide Profase meiótica I leptoteno Metafase meiótica I Anafase meiótica I Metafase meiótica II Telofase meiótica II (cada polo) Interfase premeiótica (antes S) Interfase premeiótica (después S)

#5) Albert y Swift (1953) encontraron las siguientes cantidades relativas de ADN (en unidades arbitrarias) por núcleo en varios tipos de células del anélido Sabellaria: a) Primer cuerpo polar: 127 + 3 b) Esperma: 61 + 1 c) Profase mitótica: 263 + 10 d) Telofase mitótica: 124 + 3 Explique estas diferencias. 6) Una especie animal tiene 2n cromosomas: ¿Qué proporción de las gametas formadas tendrán los centrómeros: i) de origen paterno únicamente; ii) de origen materno únicamente; iii) de origen materno y paterno simultáneamente? 7) Una cigota posee un 2n = 8; en el primer par de cromosomas homólogos uno de los miembros presenta un abultamiento ("knob") intersticial; en el segundo par uno de los miembros posee un satélite en posición terminal, en el tercero uno de los cromosomas presenta un segmento heterocromático terminal y el cuarto par es acrocéntrico. Realice un esquema de las siguientes etapas de la mitosis y meiosis. a) metafase mitótica b) metafase de meiosis I c) metafase de meiosis II d) anafase de mitosis e) anafase de meiosis I (dibuje los ordenamientos posibles en anafase I e indique qué probabilidad tiene cada uno de producirse). f) anafase de meiosis II

8) Otra cigota posee un complemento de dos pares de cromosomas homólogos A y a, B y b: a) ¿cuáles de los siguientes complementos cabría esperar en las células somáticas durante el crecimiento: AaBB, AABb, AABB o aabb? b) ¿Podría encontrarse más de una combinación? Cuando este individuo llegue a adulto: c) ¿cuáles de las siguientes combinaciones de cromosomas cabría esperar en las gametas?: Aa, AA, aa, Bb, BB, bb; Aa, Bb; A, a, B, b; AB, Ab, aB, ab; Aa, Ab, aB, Bb. 9) Dibuje la configuración de los bivalentes en Paquitene, *Diplotene, Diacinesis y Metafase I de una especie con 2n= 4, donde uno de los pares es metacéntrico y muestra regularmente durante toda la meiosis un quiasma intersticial a cada lado del centrómero; el otro es un acrocéntrico con un único quiasma intersticial en el brazo largo. Use lápices de colores para diferenciar a los dos homólogos. 10) Los conceptos de división reduccional o división ecuacional se refieren a: a) fenómenos citológicos o genéticos? b) ¿Hay paralelismo entre dichos aspectos citológicos y genéticos? Si se tiene un par de cromosomas homólogos acrocéntricos donde se ubican los genes A y a: c) ¿En qué estadio efectúa reducción el segmento que contiene el gen A si ocurre un intercambio en la región I? d) Realice el mismo razonamiento si el intercambio ocurre en II.

I II __________A____________ _______________________ A __________a____________ _______________________ I a II
#10) En qué organismos esperaría la mayor variabilidad: a) en los que se reproducen asexualmente ó en los que lo hacen sexualmente? b) Suponga que el proceso meiótico nunca hubiera aparecido en la evolución biológica: ¿cuál piensa Ud. que habría sido la consecuencia? c) En las especies animales que poseen una meiosis masculina aquiasmática, ¿hay recombinación genética en esas especies? 11) IMPORTANTE La dirección www.biologia.arizona.edu/cell/tutor/mitosis/01q.html contiene problemas relacionados al tema de división celular y cada uno de ellos trae cuatro opciones de respuesta siendo solo una la correcta. Es útil como método de ejercitación y de autoevaluación.

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2. LEYES DE MEND S DEL Y EXTENSIONES DEL ANÁLISIS M A MENDELI IANO I
Bibliografí Griffiths y col. Cap. 2 y 4 ía: Guía teóric ca 1) Señale la importan ncia del con ncepto de se egregación, por un lado, e ind n dependencia, por el otro, de la , herencia de caracteres d e derivada de las leyes de Mene del. ¿Cuál es la import tancia de la diploidía en todo n esto? ¿Sería lo mismo s las arvejas fueran mon a si s noploides en vez d diploides? de ? R: Además de repasar l leyes de Mendel, se resalta las que la segre egación e in ndependencia de la heren a ncia de los caracter es, valga la redundan res ncia, indepen ndiente de si los or rganismos so haploides o diploides y peron mite la reco ombinación, entendida c como nuevas coms binaciones de alelos d distintos genes. Se puede de hacer, como ejercicio, q hubiese p o qué pasado con l gelas neraciones p paternales, “ “F1” y “F2” si las arveja fueas ran haploides. Ahora bi ien, la segreg gación de ale se elos ve enmasca arada en los diploides po las interac or cciones de dominan ncia-recesivid dad. Por eso, antes de M Mendel, no se le enc contraba lógi a que 2 in ica ndividuos de fenoe tipo domina ante, tuviera descendie an entes con fe enotipo recesivo, por ejemplo. Destacar la importanc del cia análisis num mérico-estad dístico para e establecer es lestas yes y que po ocos aplicaro previamen on nte. 2) ¿Por qu procesos recombinan los genes en la ué n meiosis? R: Después de Mende se pudier el ron incorpor los rar conceptos d derivados de los avance en citoge e es enética (teoría crom mosómica de la herencia y reformu e a) ular, en su acepción moderna q “los gen situados sobre n que nes diferentes c cromosomas recombinan mediante la sen gregación a azar de los cromosom en la ana al mas afase y los genes si ituados en el mismo crom l mosoma se r recombinan por m medio del ent trecruzamien nto”. 3) a) ¿Qué es un monoh híbrido? ¿Qu es un híbr ué rido en ronómico o comercial (p ej. un h por híbrido sentido agr superrendid para Cla dor arín Rural)? b) ¿Qué sig gnifica hacer un cru uzamiento di ihíbrido o tri ihíbrido? R:a) Monohíbrido es s sinónimo de heterocigot para ta un único g gen. Un híbr rido comercial es tambi un ién heterocigota (pero con s a sobredomina ancia para el carácter rendimie ento). No se lo debe conf fundir con hí íbridos interespecíf ficos que so resultados de cruzam on s mientos interespecíf ficos y se ver en la guía de alteracio rán a ones. b) Hacer un cruzamiento dihíbrido o trihíbrido si n o ignifica analizar v varios pares de alelos, do (Aa Bb) o 3 (Aa os Bb Cc) resp pectivamente siempre he e, eterocigotas. 4) ¿Qué es r retrocruza? ¿ cruzamien prueba? ¿Y nto R: Un cruza amiento prue es un cru eba uzamiento en un ntre heterocigota y el padre recesivo pa las característia ara cas en estud dio AA x aa Aa A Se h hace Aa x aa (cruzamient prueba) to

La retrocruza e un cruzam a es miento entre el heterocigo e ota (F1) o cualquie de las sig era guientes gene eraciones y cualquiera de los padres originales. 5)¿ qué cons ¿En siste la prueb de comple ba ementación? R: Cruzamient entre dos mutantes ho to omocigotas c con fen notipo simila (por ejemp albino) para determi ar plo p inar si la F1 tiene fenotipo sal lvaje (indica ativa de que las mu utaciones est localizad en distintos genes). Es el tán das cas típico de una vía m so e metabólica de varios pas e sos. Ta anto si hay u mutación para el pri una n imer paso de la e vía como para el segundo, la consecue a, a encia es que no e se formará el producto fin (por ejem nal mplo antocia anas de color rojo, dando albinismo). Si se cruza una m mutan para el ge codificant para la prim enzima de nte en te mera a la vía metabóli con otro para la segu ica unda, la F1 s será het terocigota para ambos g genes. Como generalme o ente los alelos salv s vajes (enzima normal act a tiva) son dominan ntes, las en nzimas sintet tizadas se complementa c arán par restaurar la vía metab ra bólica, indep pendienteme ente de que los al lelos salvaje estén en repulsión (en es n ans). El 100% de la F1 es salvaje. Esta prueba se a tra con ntrasta con la prueba de recombinaci (lo que c ión confun a los alu nde umnos). En la prueba de recombinaci ión, pu uede ocurrir que las muta antes indepe endientes se corre espondan al mismo gen pero en nuc cleótidos dist tintos lo que pos s, sibilita que se produzca un entrecru uzami iento entre las 2 posicio ones mutadas generando un s rec combinante s salvaje. En e caso, la F1 será de fe este F enotip mutante en un 100% (los alelo mutados del po % os mi ismo gen no se pueden co omplementar salvo algunos r, cas muy exc sos cepcionales llamados de complemen e ntació intragénic En la F en una proporción m ón ca). F2, p muy pequeña (por ejemplo 1x1 -4) aparece salvajes por 10 en rec combinación Claramen n. nte, no son proporcio n ones me endelianas. E tipo de experimento le sirviero a Este os on

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Benzer para establecer las “distancias” mínimas o problemas que se refieren a estos ejemplos dado que, “unidades” de recombinación en sus experimentos con experimentalmente, cuando se obtiene una progenie fagos. Hoy sabemos que esta distancia o unidad es el segregante, normalmente no se sabe de antemano si el comportamiento es de tipo epistático y menos aún a nucleótido. 6) ¿Qué ventajas tiene el uso de caracteres, genes o qué variante de epístasis se corresponde. En este conmarcadores codominantes (respecto a los dominantes) texto, resulta útil disponer del cuadrito de abajo que muestra algunos ejemplos del tipo de proporciones en un análisis genético de segregación? R: Se puede distinguir los heterocigotas de los homo- fenotípicas posibles. cigotas, por lo que se dispone de mayor información Problemas: (estadística) en una Tipo de interacción génica 9 3 3 1 Razón F2, por ejemplo. ReA-B- A-bb aaB- aabb fenotípica trocruzar F1 con el Ninguna (cuatro fenotipos distintos) 9 3 3 1 9:3:3:1 doble recesivo (cruAcción génica complementaria 9 7 9:7 zamiento prueba), en Supresión dominante de A sobre el alelo dominante B 12 3 1 13:3 vez de autofecundar. Epístasis recesiva de aa sobre los alelos B y b 9 3 4 9:3:4 7) ¿Cuál es la base Epístasis dominante de A sobre los alelos B y b 12 3 1 12:3:1 molecular de las inGenes duplicados 15 1 15:1 teracciones génicas, 1) Si dispone de las siguientes cepas de Drosophila dominancia, semidominancia, codominancia, sobreii) salvaje y iii) bw_vg ; dominancia (=heterosis o vigor híbrido), y dominancia i) bw e ; bw e bw vg incompleta? R: Repasar concepto un gen-un polipéptido y qué im- y desea comprobar las leyes de Mendel, indique: plica a nivel de fenotipo (ej. grupos sanguíneos). Es a) Todos los cruzamientos que le permitirían hacerlo y la segregación de qué carácter (o caracteres) estudiaría decir, en la codominancia se expresan los dos alelos. La sobredominancia implica que la F1 supera en el en cada caso. carácter estudiado (usualmente rendimiento agronó- b) ¿Es equivalente el cruzamiento directo al recíproco? mico) a ambos padres. Dominancia incompleta: el heterocigota presenta ras- c) ¿Deben usarse hembras vírgenes en todos los cagos intermedios entre cada tipo de homocigota, no es sos? 2) Si dos pares de genes A:a y B:b se transmiten inigual a ninguno de ellos. dependientemente y se sabe que A es dominante sobre 8) Normalmente, de un carácter autosómico doa y B dominante sobre b, ¿cuál es la probabilidad de minante relacionado con alguna enfermedad se obtener: espera que cada individuo afectado tenga al menos un progenitor también afectado. Pero, ¿puede a) una gameta AB a partir de un individuo AaBb? b) una gameta Ab a partir de un individuo AA Bb? suceder que ambos padres no manifiesten la enc) una cigota AABB a partir de aabb X AABB? fermedad? d) un fenotipo AB a partir de AaBb X AaBb? R: Penetrancia (incompleta) e) un fenotipo AB a partir de AABB X aabb? f) un fenotipo aB a partir de AaBb X AaBB? 3) Considere el cruzamiento AaBbCcDdEe x aa aaBbccDdee. (a) ¿Qué proporción de la descendencia será fenotípicamente como: 1) el primer parental, 2) el segundo parental, 3) cualquiera de los dos parentales y Aa 4) ninguno de ellos? (b) ¿y genotípicamente? Suponga 9) ¿A qué se denomina “interacciones génicas”? que la segregación es independiente. R: Interacción entre dos o más genes de distintos loci 4) Enumere las proporciones genotípicas y fenotípicas en la que uno interfiere o modifica la expresión feque puede formar el trihíbrido AaBbDd cuando es notípica de otro. Generalmente se denomina hipostátiautofecundado (o cruzado por uno de constitución co al gen que sólo se manifiesta fenotípicamente genotípica similar) suponiendo que A y B son domicuando otro locus (epistático) presenta determinado nantes y que D tiene dominancia incompleta sobre d. genotipo. Epístasis = modificaciones de las proporciones fe- 5) Se sabe que existe una serie de 4 alelos en determinada especie diploide (2n); ¿cuántos estarían presentes notípicas debidas a interacción génica b) ¿un par cromosómico? Los casos de epístasis son muy numerosos en genéti- en: a) ¿un cromosoma? c) ¿un individuo de la especie? ca, muchos más de los que aparecen en los libros de texto. Sin embargo, varios textos tratan con detalle e d) sobre la misma base: ¿cuántas combinaciones difeincluso dan definiciones de algunos de estos ejemplos. rentes de alelos se espera que ocurran en la población No es de interés para esta materia que los estudiantes completa? memoricen estos ejemplos y mucho menos las defini- 6) En el ratón, el gen para el albinismo presenta una ciones de cada uno de ellos. Sin embargo, hay algunos serie de alelos múltiples. Cuatro de estos alelos (clasi-

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ficados de acuerdo con la disminución de intensidad del color de pelo de los homocigotas) son: C = color completo (tipo salvaje) cch= chinchilla cd = dilución extrema c = albino Las relaciones de dominancia son C> cch> cd> c. a) Haga un esquema de un cruzamiento entre un ratón salvaje heterocigota para dilución extrema y un ratón chinchilla heterocigota para el albinismo. b) Otro gen que afecta el color del pelo en el ratón tiene su locus en otro cromosoma, y presenta los alelos B para pelo negro (tipo salvaje) y b para castaño. Ampliar el esquema anterior incluyendo el dato de que los dos ratones que se cruzan son heterocigotas para ese gen. 7) Un fitopatólogo llamado Flor vio que algunas variedades de lino presentan diferente resistencia a distintas razas de un hongo, Melampsora lini. La variedad de lino 770B es resistente a la raza 24 y susceptible a la raza 22, mientras que la raza Bombay es resistente a la 22 y susceptible a la 24. Si se cruzan las variedades 770B y Bombay, el híbrido obtenido es resistente a ambas razas 22 y 24. Cuando autofecundó la F1 se produjo una F2 con las siguientes proporciones fenotípicas: RAZA 22 RAZA 24 Resistente Susceptible Resistente 110 43 Susceptible 32 9 a) Proponga una hipótesis para explicar la base genética de la resistencia del lino a estas razas particulares de hongos. b) En base a su hipótesis, ¿qué número de cada una de las cuatro categorías aparece en F2? c) Pruebe su hipótesis usando χ2. LEYES DE MENDEL Y EXTENSIONES DEL ANÁLISIS MENDELIANO II 8) Si el carácter antenas largas (a) está ligado al sexo (determinación XX-XY) en el mosquito Sinospica rascaremus, qué probabilidad hay de obtener un mosquito macho y con antenas largas en el cruce A/a x A/Y?. 9) Averiguar si el modelo de herencia del rasgo definido en el siguiente pedigrí, se corresponde con un tipo de herencia autosómica dominante, autosómica recesiva, dominante ligada a X, recesiva ligada a X o ligada a Y. ¿Podría ser válida más de una hipótesis?

fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas. Explique. 10) En el ratón hay un alelo mutante que causa encorvamiento de la cola. A partir de los resultados de los cruzamientos que se indican a continuación deduzca el tipo de herencia de este carácter: a) ¿Es recesivo o dominante? b) ¿Es autosómico o ligado al sexo? c) ¿Cuáles son los genotipos de los progenitores y de las progenies en cada uno de los cruzamientos? Cruza Progenitores Progenie 1 2 3 4 5 6
Madre Padre Normal Curva Curva Curva Norma Curva Curva Hijas Hijos Todas curvas Todas normales 0,5 curvas 0,5 curvas Normal 0,5 normales 0,5 normales Normal Todas curvas Todas curvas Normal Todas normales Todas normales Curva Todas curvas Todas curvas 0,5 curvas Curva Todas curvas 0,5 normales

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9) En una especie cultivada se realizó un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas. La progenie F1 fue roja. En la F2 los resultados

11) En Drosophila se aparearon 2 moscas de fenotipo "alas curvadas" (Curly) y "setas anormales" (Stubble). Se analizó un gran número de descendientes adultos y la proporción fue la siguiente: 4 CySb: 2 CySb+: 2 Cy+Sb: 1 Cy+Sb+. Explique estos resultados. 12) El color del pelaje en los perros depende de la acción de por lo menos 2 genes. En un locus, un inhibidor epistático dominante (I) de la pigmentación evita la expresión de los alelos del color que se ubican en otro locus de segregación independiente y en consecuencia produce pelaje blanco. Cuando se da la condición recesiva ii , los alelos del locus hipostástico pueden expresarse: iiN_ produce color negro, iinn produce color café. En un cruzamiento dihíbrido para ambos loci, determine: a) proporciones fenotípicas esperadas en la progenie. b) probabilidad de hallar, en la progenie de color blanco, un individuo que sea homocigota para ambos loci. 13) En una especie cultivada se realizó un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas. La totalidad de la F1 presentó flores rojas. En la F2 los resultados fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas. ¿Qué procesos explicarían estos resultados? 14) Se cruzaron dos cultivares de arveja con flores blancas y se obtuvo una F1 homogénea con flores moradas. El cruzamiento al azar entre individuos de la F1 produjo 96 plantas hijas, de las cuales 53 presentaron flores moradas y 43 presentaron flores blancas. En este ejemplo: a) ¿A qué proporción fenotípica se aproxima la F2? b) ¿Qué tipo de interacción participa? c) ¿Cuáles serían los genotipos probables de las cepas progenitoras? 15) Las gallinas Black Langshan tienen patas con plumas, mientras que las patas de las Buff Rock no son emplumadas. Del cruzamiento entre ambas se obtiene una F2 integrada por 15 individuos con patas

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emplumadas y sólo 1 sin plumas. Diagrame los cruzamientos y explique los resultados. 16) En la rata, dos parejas alélicas A:a y R:r interactúan de la siguiente forma: A_R_: pelaje gris. aaR_: pelaje negro. A_rr: pelaje amarillo. aarr: pelaje color crema. Estos genotipos sólo pueden expresarse en presencia de un alelo dominante de un tercer gen, D, mientras que su alelo recesivo d causa albinismo. Cuatro líneas albinas homocigotas diferentes fueron cruzadas con una línea pura de color gris, y estos cruzamientos produjeron las correspondientes F1 grises. Estas F1 produjeron las siguientes F2: Líneas Cantidad de individuos en las distintas F2 albinas Gris Amarillo Negro Crema Albino 174 0 65 0 80 1 48 0 0 0 16 2 104 33 0 0 44 3 292 87 88 32 171 4 a) ¿Cuál es el genotipo de cada línea albina? b) ¿Qué tipo de interacción -si la hay- está implicada en estos cruzamientos? IMPORTANTE: Una vez resueltos los problemas de la guía, las siguientes direcciones de Internet contienen problemas que, a manera de repaso, permiten incursionar en las técnicas de autoaprendizaje con autoevaluación. http://www.biologia.arizona.edu/mendel/sets/mono/m ono.html (cruza monohíbrida) http://www.biología.arizona.edu/mendel/sets/di/02Q.h tml (cruza dihíbrida)

3. MAPEO CROMOSÓMICO
Bibliografía: Griffiths o cualquier otro libro de genética. Guía Teórica: 1) ¿Cómo y cuando se encontró el fenómeno de ligamiento entre genes? ¿Por qué contradice las leyes de Mendel? R: A principios del siglo XX se encontraron genes que no respondían a la segunda ley de Mendel. En ese momento no se conocía la base física (teoría cromosómica de la herencia) pero el descubrimiento del ligamiento ayudó mucho a postular esta hipótesis, luego comprobada. Actualmente se sabe que, en los organismos diploides, hay 2 copias homólogas de cada cromosoma que pueden llevar alelos distintos del mismo gen. Estas copias segregan en igual proporción que las gametas, de acuerdo a la primera ley de Mendel. Si consideramos 2 genes ubicados en cromosomas diferentes, éstos segregarán al azar, obteniéndose proporciones similares de gametas parentales y recombinantes (primera ley de Mendel). Si, en cambio, los 2 genes se ubican en el mismo cromosoma, no segregan en forma independiente sino que tenderán a segregar juntos. Se dice, entonces, que estos genes se encuentran ligados. En este caso las gametas serán únicamente parentales, no formándose recombinantes. Es como

si los dos genes fueran en realidad uno sólo. Sin embargo, durante la primera fase de la meiosis, se producen entrecruzamientos entre cromosomas homólogos que resulta en un intercambio físico como lo demostraron Creighton y Mc Clintock en 1931 utilizando marcadores citológicos combinados con marcadores genéticos. Estos entrecruzamientos se visualizan como quiasmas a nivel citológico. Si imaginamos una distribución aleatoria de los entrecruzamientos a lo largo del cromosoma, la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento es aproximadamente proporcional a la distancia que separa a los genes en el cromosoma: cuanto más separados se encuentren, más probable es que ocurra un entrecruzamiento entre ellos. En consecuencia, determinando la frecuencia de recombinantes, podemos obtener una medida de la distancia entre los genes ligados. Esta es la base para la construcción de mapas genéticos. El mapeo genético se realiza mediante análisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y análisis de pedigrí. Es decir, mediante el análisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo físico se realiza mediante el análisis de clones genómicos (mediante mapeo de contigs de los cuales se conocen, por ejemplo, sus mapas de restricción), combinado con secuenciación nucleotídica, por hibridación in situ, u otros métodos que no involucran cruzamientos y análisis de recombinantes. En este caso, las distancias se calculan en nucleótidos o mediante medición de cromosomas. 2) ¿Cuándo se dice que 2 genes están en acoplamiento o en repulsión? R: Alelos mutantes ubicados en el mismo cromosoma o separados en los 2 cromosomas homólogos. Acoplamiento: AB ; Repulsión: Ab ab aB 3) ¿Qué relación existe entre ligamiento y mapeo? R: Establecer el ligamiento y calcular la distancia permite en base a las distancias relativas de muchos genes establecer un mapa genético. 4) ¿Cuál es la base física del mapeo genético? ¿Qué relación tienen los estudios de mapeo genético con los entrecruzamientos y quiasmas que se observan en las meiosis? ¿Qué similitutes, relaciones y diferencias existen entre el mapeo genético y el mapeo físico o genómico? R: Los genes son segmentos de ADN pertenecientes a una larga molécula que constituye un cromosoma. Los recombinantes para genes pertenecientes al mismo cromosoma surgen porque en la meiosis hay entrecruzamientos (que se pueden visualizar microscópicamente en la forma de quiasmas) entre cromosomas homólogos. El mapeo genético se realiza mediante análisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y análisis de pedigrí. Es decir, mediante el análisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo físico se realiza mediante el análisis de clones genómicos mediante mapeo de contigs (de los cuales se conocen, por ejem-

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plo, sus mapas de restricción), combinado con secuenciación nucleotídica, por hibridación in situ, u otros métodos que no involucran cruzamientos y análisis de recombinantes. Las distancias se calculan en nucleótidos o mediante medición de cromosomas. El orden físico de los genes en el cromosoma coincide con el orden que surge de su mapeo genético. Existe, además, una correspondencia proporcional relativa entre distancia genética y distancia calculada en nucleótidos, aunque la correspondencia no es absoluta y varía en distintas partes del cromosoma. Es decir, una unidad de mapa significa un número distinto de nucleótidos cerca del centrómero que cerca del telómero, porque las frecuencias de entrecruzamiento (formación de quiasmas) son distintas. La vecindad de regiones heterocromáticas también afecta la frecuencia de aparición de quiasmas y la relación absoluta entre distancia genética/distancia física. 5) ¿Qué es y cómo se hace una prueba de 2 puntos? ¿Qué significa la palabra punto en prueba de 2 puntos? ¿Implica ligamiento? R: Se estudia el ligamiento en cruzamientos de dobles heterocigotas por dobles recesivos (Ver libro para una explicación más completa) 6) ¿Qué es una unidad de mapa? ¿Es sinónimo de centiMorgan, frecuencia de recombinación o de unidad de recombinación? ¿A cuántos nucleótidos equivale una unidad de mapa? R: Se define como unidad de mapa a la distancia entre genes (o marcadores) para los cuales se observa un recombinante con una probabilidad de uno en 100 productos de la meiosis. Una unidad de mapa sería, entonces, equivalente a una frecuencia de recombinación del 1%. Es decir, que se calcula mediante la fórmula del % de recombinantes sobre totales y es sinónimo de unidad de recombinación. Los cM tienen otra fórmula de cálculo que toma en cuenta la posible existencia de dobles entrecruzamientos y la interferencia. No siempre coinciden. Como se mencionó, la unidad de mapa genético varía (en número de nucleótidos) según la especie, el cromosoma y localización dentro del mismo cromosoma. Groseramente, 1 cM equivale a 1 megabase (un millón de pares de bases) en humanos. 7) ¿Pueden 2 genes estar ligados a más de 50 u.m.? Por ejemplo, ¿pueden estar a una distancia de 200 u.m.? ¿Qué es un grupo de ligamiento y a qué se corresponde físicamente? R: Primero, hay que ver de dónde sale este límite de 50 u.m. Al momento de la meiosis, cada cromosoma del par de homólogos se halla conformado por 2 cromátides. Es decir, al momento del apareamiento en el que se produce el entrecruzamiento tenemos 4 cadenas de ADN vecinas. Sin embargo, sólo 2 de las 4 hebras participa en el entrecruzamiento, por lo que, como resultado, sólo la mitad de las gametas podrán ser recombinantes. O sea que entre 2 genes ubicados en el mismo cromosoma que están lo suficientemente

lejos como para que siempre exista un entrecruzamiento entre ellos, la máxima proporción de recombinantes será del 50%. Por lo tanto, 2 genes pueden estar ligados a más de 50 u.m., pero no lo puedo determinar mediante una simple prueba de 2 puntos entre ambos genes analizados, porque la máxima distancia determinable por este método es de 50 u.m. Necesito un gen “puente” (o varios) para poder integrar a los dos genes en el mismo grupo de ligamiento. Por lo tanto, un grupo de ligamiento está formado por el conjunto de genes (o marcadores genéticos) que se comportan como ligados entre sí en forma directa o a través de otros genes “puente”. El grupo de ligamiento se corresponde a todos los genes o marcadores genéticos localizados en el mismo cromosoma o molécula de ADN. Se llama desequilibrio de ligamiento al fenómeno que se da entre dos alelos de dos genes distintos que se heredan juntos con una probabilidad mayor que la dada por el azar. Esto se debe en general a que los genes están ligados. 8) ¿Qué es una prueba de 3 puntos? En una prueba de 2 puntos, ¿se puede establecer un orden de los genes? ¿y en una de 3? ¿hasta qué punto? R: Cuando se estudia el ligamiento simultáneo entre 3 genes (por ej. A, B y C), se puede establecer un orden ya que (suponiendo que el orden sea ABC), la distancia (prueba de 2 puntos) entre A y C es aproximadamente igual a la suma de la distancia entre A-B + B-C. En una prueba de 2 ptos. no se puede establecer un orden, sólo distancias relativas. En la de 3 sí, pero no se sabe si los 2 puntos extremos (A y C) están “a la derecha” o “a la izquierda”. 9) ¿Porqué no hacer 2 o 3 pruebas de 2 puntos? ¿Dan distintos resultados? ¿Por qué? ¿Qué es interferencia y cómo se calcula el coeficiente de coincidencia? R: Pueden dar resultados distintos por el fenómeno de subestimación de dobles entrecruzamientos y/o de interferencia. En el ejemplo de arriba, la distancia entre A y C (medida como prueba de dos puntos) suele ser menor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la presencia de de entrecruzamientos dobles entre Ay C cuyo resultado final es la formación de gametas parentales AC y ac para estos 2 genes que se computan como No recombinantes, cuando en realidad lo son. Si nosotros no hubiéramos mapeado el gen B nunca hubiéramos detectado estos dobles entrecruzamientos (ni triples, ni cuádruples). Si extendemos este pensamiento, en realidad tampoco sabemos si entre A-B hubo entrecruzamientos dobles y si también estamos subestimando la proporción de recombinantes entre A y B. Cuanto más grande la distancia entre 2 marcadores, más inexacta será la frecuencia de recombinantes como medida de la distancia entre los genes. Además, está el fenómeno de interferencia que se relaciona con un impedimento estérico o físico que reduce la probabilidad de que se produzcan Además, está el fenómeno de interferencia que se relaciona con un impedimento estérico o físico que reduce la probabilidad de

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que se produzcan quiasmas muy cercanos entre sí (se “interfieren”) por lo que el número de recombinantes entre genes muy cercanos entre sí es menor al probabilísticamente esperado. Algunas funciones de mapeo más refinadas, toman en cuenta este fenómeno. Estas funciones se derivan de la función de Poisson y son, fundamentalmente, dos: la de Haldane (que considera los dobles entrecruzamientos pero no considera la interferencia) y la de Kosambi (que considera ambas). Por lo general, todos los mapas que se publican se basan en la función de Kosambi. 10) ¿Por qué, en una prueba de 3 puntos, realizar un cruzamiento prueba facilita el análisis? R: Porque el cruzamiento con el homocigota recesivo permite concentrarse directamente en las gametas de la F1 permitiendo distinguir las gametas que portan alelos recesivos de dominantes mediante una sencilla relación de 1 a 1. Esto es particularmente útil para genes en los que no se puede distinguir el fenotipo heterocigota del homocigota dominante. Toda la progenie segregante será homocigota recesiva o heterocigota (no habrán homocigotas dominantes) 11) ¿Es sencillo aplicar los sistemas arriba mencionados para mapeo en humanos? ¿Por qué? ¿Es posible utilizar información de pedigrí para hacer estudios de ligamiento? ¿Existen otros métodos alternativos de mapeo? ¿En qué consiste el método de mapeo con híbridos somáticos (fusión interespecífica de células)? ¿En qué consiste la hibridación in situ? R: No se pueden “planificar” cruzamientos en humanos, obtener líneas puras (depresión por endocría) y las progenies son poco numerosas (estadísticamente problemáticas). El mapeo preciso y fino se realiza mediante técnicas físicas como la utilización de híbridos somáticos (libro). Lo que se utiliza es la información de pedigrí con funciones de mapeo basadas en Lod score. El índice Lod score es la medida estadística del ligamiento. Cuando las familias son numerosas y se encuentran individuos recombinantes en ellas, el análisis es simple. Pero esto no siempre es así. Las familias con enfermedades interesantes no suelen ser numerosas, y no sirven para realizar un análisis estadísticamente significativo. Por lo tanto, se deben tomar los datos de varias familias. El lod score, Z, es el logaritmo de la probabilidad de que dos loci estén ligados respecto de que no lo estén. La probabilidad general de ligamiento en un grupo de familias, es el producto de las probabilidades de cada familia individual, por lo que los lods scores al ser logaritmos permiten que se sumen los datos para esas familias. 12) ¿Qué significa índice Lod o Lod score? ¿En qué casos se utiliza?¿Por qué en los últimos años prácticamente todos los estudios de mapeo genético en todas las especies se realizan con marc. moleculares? R: Probabilidad de ligamiento (ver Griffitts). El Lod es el logaritmo en base 10 del cociente entre: Probabilidad de obtener los datos observados si los loci estuvieran ligados/ Probabilidad de obtener los datos observados si no estuviesen ligados. Por ej. un

Lod = 3 para un par de genes indica que es mil veces más probable que los genes estén ligados respecto a que no lo estén. Programas como el MapMaker también utiliza Lod Scores para comparar diferentes órdenes posibles entre varios genes. Al orden más probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos. Porque permiten una cobertura del genoma que no permiten los caracteres morfológicos. 13) ¿Qué similitudes y diferencias existen entre los cálculos de distancias usando las fórmulas vistas arriba y los algoritmos de programas como el Mapmaker? R: Las fórmulas son un distintas porque los algoritmos del Mapmaker están basados en Lod score (cálculo de probabilidades). Estos cálculos probabilísticos están basados, sin embargo, en el mismo concepto y la misma lógica que existe atrás de las funciones de mapeo en pruebas de dos o tres puntos. Sin embargo, son más poderosas, porque al tratarse de una prueba de “muchos” puntos simultáneamente, permite afinar mucho más el cálculo minimizando errores debidos a dobles entrecruzamientos e interferencias.

Problemas:
1) En el gusano de seda Bombix mori, el gen recesivo l produce color amarillo limón en la larva, mientras que el L da color blanco. El dominante B, produce bandas negras transversales, mientras que el recesivo b no las produce. Ambos loci están ligados y su distancia genética es de 30 unidades de recombinación. Se cruzó una hembra homocigota blanca y con bandas con un macho amarillo sin bandas negras. Los machos de la F1 se utilizaron para fecundar hembras amarillas y sin bandas negras. ¿Qué segregación fenotípica y genotípica se obtuvo? 2) a) En Drosophila y para caracteres autosómicos, cuando se quiere realizar un cruce de prueba se utilizan hembras heterocigotas y machos homocigotas recesivos. ¿Por qué no se hace el cruzamiento recíproco? b) En D. melanogaster se encuentra un gen letal a que produce, en homocigosis, la muerte de la larva, y está ligado con un 40% de sobrecruzamiento al locus B/b. El alelo B produce un abdomen deforme y el b un abdomen normal. Se pide la segregación fenotípica y genotípica observable en los adultos en un cruzamiento entre un macho heterocigota en fase de acoplamiento y una hembra heterocigota en fase de repulsión. 3) Una mosca de la fruta con genotipo B R/ b r es retrocruzada con una de genotipo b r/ b r. En el 84% de las meiosis no ocurren quiasmas entre los pares de genes ligados; en el 16% ocurre un solo quiasma entre ellos. ¿Qué porcentaje de la progenie será Bbrr? a) 50%; b) 4%; c) 84%; d) 25% ; e) 16%. Explique. 4) En Lathirus odoratus hay un locus que codifica para el color de las flores: P = púrpura, p = rosa, y otro locus para la forma de la semilla: R = semilla redonda, r = semilla alargada. En la polinización de una planta, resultado del cruce de líneas puras púrpura redonda por rosa alargada, con otra descendiente del

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cruce rosa redonda por púrpura alargada, se obtuvieron los resultados indicados: PR=99, Pr=44, pR=44, pr=3. ¿Existe ligamiento entre ambos loci? 5) En la descendencia de un cruzamiento prueba de un triheterocigota se obtuvieron los siguientes resultados: Fenotipos Frec. abs. ABD 50 ABd 32 AbD 538 aBd 600 abD 28 abd 62 Se desea saber: a) la fase del genotipo parental; b) el locus central; c) las distancias genéticas; d) el valor de la interferencia. 6) En los ovarios de plantas superiores se forman núcleos haploides que resultan de una meiosis y sucesivas mitosis sin citocinesis, formando una célula multinucleada llamada gametofito femenino (el núcleo masculino se fusiona con uno de estos núcleos, que actúa como óvulo). En algunas coníferas, el gametofito femenino puede ser bastante grande; este hecho permite que pueda ser extraído y analizado electroforéticamente. Un árbol de pino es heterocigota para los alelos electroforéticos "rápido" (r) y "lento" (l) de las enzimas alcohol dehidrogenasa (AdhF/AdhS) y fosfoglucomutasa (PgmF/PgmS). Se estudió electroforéticamente una muestra de 237 gametofitos femeninos y se encontraron los siguientes fenotipos: 23 AdhF PgmF, 24 AdhS PgmS, 93 AdhF PgmS y 97 AdhS PgmF. a) ¿Están estos genes ligados? b) Calcule la distancia entre los genes Adh y Pgm y en qué fase están. Otro gen que codifica para la enzima esterasa (Est) también presenta dos alelos: EstF y EstS; el mismo está ubicado entre los loci Adh y Pgm. De la misma muestra antes estudiada se obtuvieron los siguientes resultados. Calcule la distancia: AdhF EstF PgmF: 7 AdhS EstS PgmS: 10 AdhS EstF PgmS: 14 AdhF EstS PgmF: 16 1 AdhF EstS PgmS: AdhS EstF PgmF: 1 F F S Adh Est Pgm : 92 96 AdhS EstS PgmF: Total 237 c) ¿Coinciden las distancias calculadas para AdhPgm? Explique. d) ¿Cuál es el coeficiente de coincidencia y la interferencia? 7) El padre del Sr. Spock, segundo oficial de la nave Enterprise, proviene del planeta Vulcano y su madre del planeta Tierra. Los vulcaneños tienen sus orejas puntiagudas (P), ausencia de glándulas adrenales (A) y el corazón del lado derecho (R). Todos estos alelos son dominantes sobre los alelos terráqueos. Estos genes son autosómicos y están ligados, tal como se muestra en el mapa de ligamiento:

P/p A/a R/r _l___________l____________l__ l__15 um____l___20 um____l Si el Sr. Spock se casa con una terráquea y no existe interferencia (génica), ¿Qué proporción de sus hijos mostrarán: a) Apariencia vulcaneña para los tres caracteres? b) Apariencia terráquea para los tres caracteres? c) Orejas y corazón vulcaneños, pero adrenales terráqueas? d) Orejas vulcaneñas pero corazón y adrenales terráqueas? 9) Bridges y Morgan realizaron numerosos cruzamientos en Drosophila melanogaster. En cierto experimento cruzaron machos sin alas (apterous) con hembras de cuerpo negro (black). En la F2 obtuvieron 186 individuos salvajes, 85 apterous, 99 black y ninguno con ambos caracteres. ¿Qué se deduce de los resultados obtenidos?. Razone la respuesta. 10) Un genetista quiere mapear los genes A, B, J, D y E mediante dos cruzamientos de tres puntos. El primer cruzamiento lo realiza con líneas puras para los cinco genes. Después, el investigador cruza los individuos de la F1 con individuos homocigotas recesivos, y el fenotipo de la descendencia es como sigue: ABJDE 316 ABJdE 31 AbJdE 130 AbJDE 17 abJdE 314 abJDE 39 aBJDE 140 aBJdE 13 Las líneas puras utilizadas en el segundo cruzamiento son las siguientes: AABBJJDDEE x aaBBjjDDee. De nuevo, el investigador cruza los individuos de la F1 con homocigotas recesivos, obteniendo los siguientes fenotipos: ABJDE 243; ABJDe 155; aBjDe 237; aBjDE 165; ABjDe 62; aBJDe 46; aBJDE 58; ABjDE 34. Por trabajos previos el investigador sabe que los genes D y E tienen segregación independiente entre sí. a) Elaborar el mapa correspondiente a estos 5 genes y determinar, si es posible, la distancia entre ellos. b) ¿Existe interferencia? Mapeo II 11) El gen de resistencia al virus del mosaico del tabaco se ha tratado de mapear en tomate respecto a marcadores moleculares que detectan RFLP. Se supone que existe un alelo que confiere resistencia, dando un fenotipo totalmente resistente en homocigosis, y un fenotipo parcialmente resistente en heterocigosis. Existe una variedad de Lycopersicum peruvianum (especie emparentada al tomate) totalmente resistente al virus pero con otras características agronómicas indeseables; y otra que es totalmente susceptible al virus pero potencialmente atractiva agronómicamente. Al cruzar individuos de ambas variedades se obtuvieron plantas híbridas F1, parcialmente resistentes. Se presentan los resultados de RFLP, para tres marcadores moleculares diferentes, de los individuos parentales y de 20 individuos originados por autofecundación de la F1 (F2), acompañados de los resultados fenotípicos

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observados en los ensayos biológicos con el virus: R (totalmente resistente), P (parcialmente resistente) y S. Fenotipo Padres 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sonda R S P P R R P R R P R --- --- --- --- --- --- --- --PTG9 ----- --- ----- ----- --- ------PCD3 ----- --- --- --- --- --- --- --- ----------- --PXY ----- --- ----- --- ----Fenotipo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Sonda R P P R S R S R S P R --- --- --- --PTG9 --- --- --- --- --- --------- --- --- ----- --------- --PCD3 --- --- --- --------- ------- --- --- --- --- --PXY --- ----- ----- ----- ----a) Calcular el porcentaje de cosegregación del gen de resistencia junto a cada gen marcador e indicar cuál de estas 3 sondas (pTG9, pCD3, pXY) utilizaría Ud. como marcador de RFLP para seguir la herencia del gen de resistencia al virus en un proceso de mejoramiento a través de cruzamientos controlados. b) ¿Qué ventajas tendría usar el marcador elegido para testar resistencia al virus, en lugar de hacer el ensayo biológico correspondiente? c) ¿Cuántas generaciones de retrocruza (contra la variedad susceptible) llevaría, en promedio, tener una variedad resistente al virus pero con un 99% del genoma de la variedad agronómicamente interesante? d) ¿Qué individuos F2 elegiría para la primera retrocruza, para tratar de acortar el nº de generaciones calculado en c)? 12) Para ciertas enfermedades no se cuenta aún con una sonda del gen implicado, sin embargo es posible hacer el diagnóstico por un método indirecto. Siendo requisito contar con marcadores polimórficos ligados a la enfermedad.Indique el riesgo genético (probabilidad de estar afectado) para los individuos en gestación (diagnóstico prenatal) en el siguiente pedigrí, en el que se indican los fenotipos para el Síndrome de Marfan (enfermedad autosómica dominante) y un marcador situado a 10 cM del locus de la enfermedad (fenotipos A1; A1A2; A2). A1A1

su aplicación a este tipo de cuestiones, que tomaron importancia en la restitución de hijos de personas desaparecidas por la última dictadura (1976-1983) a sus legítimas familias. Existen seis niños de los cuales se sabe con seguridad que sólo tres pertenecen a dos familias que no guardan ninguna relación entre sí (son de distintas ciudades). De ambas familias sólo viven los abuelos probables. Utilizando una sonda para un gen con un alto polimorfismo para una enzima de restricción (existen 4 alelos en la población) se revelan los Southern blots de ADN genómico de los seis niños y de los posibles abuelos, que se muestran en el gráfico:

A1A2

A2A2

A1A2 ? A2A2 13) Antes que aparecieran los microsatélites, los RFLP se utilizaron, en el pasado, como marcadores genéticos para la identificación de parentesco. En ciertos casos, p.ej. verificación del vínculo abuelo-nieto en ausencia de los padres, este tipo de pruebas constituyen la única evidencia válida de que se dispone. El siguiente problema representa una simplificación de

A1A2

a) Definir los haplotipos para cada individuo analizado. ¿Cuáles niños pertenecen, con alta probabilidad, a cada familia? ¿Para cuáles esta experiencia no es suficiente para decidir a qué familia pertenecen? ¿Cuáles, con seguridad, no pertenecen a ninguna de las dos? b) ¿Cree Ud. que el hecho de no considerar la existencia de eventos de recombinación (entre cromosomas homólogos) dentro del gen marcador en las meiosis de los abuelos y padres puede llevar a conclusiones erróneas? 14) Una pareja afligida llega a Ud. para que le de asesoramiento genético. Su segundo hijo falleció poco después de nacer debido a una enfermedad genética y la madre esta nuevamente embarazada. El hijo fallecido ha sido el segundo en la familia afectado por la enfermedad (el primer afectado ha sido un hermano de su abuela paterna). Ud. dispone, a través de estrategias de clonado, de una sonda de la región cromosomal donde se ubica el gen involucrado en esta enfermedad autosómica recesiva. Usando esa sonda, pudo construir un mapa de restricción de dicha región, y además, obtuvo datos que muestran que, en la población, existe polimorfismo para sitios reconocidos por

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una enzima de restricción E (indicado como +/- en la figura). Mapa de restriccion del gen que hibrida con la sonda:

Ud. aisló DNA de linfocitos de los abuelos y de los miembros vivos de la familia y ha obtenido los correspondientes fragmentos de restricción visualizados en el esquema del Southern. Ud. está ahora en condiciones de hacer un diagnóstico pre-natal a partir de células fetales. ¿Qué patrón de restricción indicaría que el feto heredó la enfermedad (dibújelo)?

15) Se lleva a cabo el análisis de ADN en una familia numerosa en la que algunos miembros están afectados por una enfermedad rara autosómica dominante de manifestación tardía (hacia los 40 años). Se extrae el ADN genómico de todos los miembros de la familia, se digiere con HaeIII y los fragmentos obtenidos se separan por tamaño en un gel de agarosa. Mediante la técnica de Southern se transfieren dichos fragmentos a una menbrana de nylon y se hibrida con una sonda radiactiva procedente de un fragmento de ADN humano de secuencia única clonado de un vector bacteriano y se obtienen los resultados indicados en la autorradiografía (ver debajo del pedigrí).

Autoradiografía correspondiente
I1 I2 II1 II2 II3 II4 II5 II6 II7 II8 II9 II10 II11

16) El mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypti) es una plaga endémica de climas tropicales, pero que desde hace pocos años está extendiendo su distribución hacia Buenos Aires. Se encontró una variante de mosquito que no transmite el temible virus. El carácter se comportó como dominante mostrando un patrón de herencia mendeliana simple. Con el objeto de introducir este carácter en la población, comenzaron a realizarse cruzamientos. Como el carácter es muy difícil de evaluar porque se requiere (para su análisis) que el mosquito hembra pique huéspedes infectados con el virus, se analizaron en cada generación los patrones de 50 microsatélites con el fin de determinar ligamiento entre alguno de ellos y el carácter de resistencia. Sólo uno de los marcadores (m25) mostró ligamiento a este carácter y a una distancia de 5 cM. Los patrones microsatélites observados cuando se utilizó este marcador en los genotipos homocigotas notransmisor y en el transmisor, respectivamente, fueron como se ve en la figura. Si se cruzan las dos variantes de mosquitos (no-transmiso-res x transmisores: generación F0) se obtienen individuos heterocigotas con fenotipo no transmisor (F1). a) ¿Qué patrones de micro- Tam. Trans NO satélites y fenotipos de mole- misor trans misor transmisión y no- cular transmisión presentarán los descendientes de una F1 258 pb cruzada por la línea parental transmisora? y 236 pb b) ¿en qué proporciones? c) Como se explicó más arriba, para la determinación de los fenotipos sólo se pueden utilizar las hembras. ¿Cómo haría si quiere evaluar a los machos de la retrocruza? ¿Qué cruzamientos haría y qué resultados esperaría?. 17) Se desea hallar un marcador molecular asociado al locus que determina resistencia al barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) en maíz para utilizarlo en selección indirecta. Por esta razón se analizó el patrón de bandas generado por 5 RAPD utilizando una población de 23 líneas recombinantes endocriados provenientes de un cruzamiento entre un padre resistente por otro sensible al ataque del insecto. RESISTENTES SENSIBLES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 23

4 kpb 3 kpb 1 kpb Explique la variación obtenida con la sonda dibujando la región cromosómica correspondiente. a) ¿Cómo se explica el tercer hijo? b) ¿Con qué probabilidad aparecerá un individuo enfermo con el patrón de restricción de la madre sana? Tendrían alguna utilidad estos resultados para aconsejar a las personas de esta familia?

A– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – B – – – –– – – – – – – – C= = = = = == == === D– – –– – –– – – –– E¯ ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ ¯ a) ¿Qué marcadores son polimórficos? b) ¿Qué marcadores están ligados al locus? c) Calcule la distancia genética. d) Indique qué marcadores NO están ligados al locus. e) Indique el/los marcadores para los que, con estos datos, no puede afirmar que están ligados (o no). 18) Se realizó el análisis de ADN de una familia numerosa en la cual ocurrieron casos de una enfermedad

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autosómica dominante letal de manifestación tardía (alrededor de los 40 años). El método aplicado fue el del análisis de segregación de RFLP utilizando la sonda denominada T4. A continuación se muestra un esquema del autorradiograma de los individuos analizados alineado con la genealogía correspondiente. Los individuos afectados se representan con símbolo lleno.

a. Proponga los genotipos más probables para el síndrome y el marcador molecular para cada individuo de la genealogía b. De acuerdo con estos resultados, ¿se podría suponer ligamiento entre el marcador molecular y la enfermedad? Justifique su respuesta. c. Si un investigador demuestra que el “lod score” entre estos dos caracteres (bandas y enfermedad) es mayor que 3, ¿cómo explicaría la ocurrencia de un enfermo que presentara sólo la banda de 5kb? d. Si otro integrante de la familia de 20 años de edad quisiera saber el riesgo de tener la enfermedad ¿qué estudio le haría y cómo interpretaría los resultados? e. Cuando se analizaron líneas celulares híbridas hombre-ratón se obtuvieron los siguientes resultados para la sonda T4 y tres productos metabólicos A, B y C. Indique en los casos en que sea posible la ubicación cromosómica de la secuencia homóloga a la sonda T4 y los productos A, B y C. Lín Crom. human. present. A T4 B C cel 2 3 4 5 6 7 8 9 23 + + + + - - - ? - + - + 34 + + - - + + - ? + - + 41 + - + - + - + ? + + - +

4. ALTERACIONES CROMOSÓMICAS
Bibliografía recomendada Griffiths y col. Capítulos: 17- Chromosome mutation I: Changes in chromosome structure; 18- Chromosome mutation II: Changes in chromosome number Lacadena, J.R. Genética General. Conceptos fundamentales. (1999) Editorial Síntesis S.A., Madrid. 13- Variaciones cromosómicas estructurales 14- Variaciones cromosómicas numéricas Guía de estudio 1) ¿Porqué las hemoglobinas humanas constituyen un ejemplo acerca del papel evolutivo de las duplicaciones? 2) Cuándo se dice que las inversiones son supresoras o reductoras de la recombinación. Nos referimos: a) ¿Al mecanismo citológico o a su consecuencia genética? b) ¿A homocigotas o a heterocigotas estructurales?

c) ¿A la zona invertida o al cromosoma completo? d) ¿A las inversiones paracéntricas o a las pericéntricas? 3) Enumere las dos características que considere más importantes en las inversiones paracéntricas y en las translocaciones recíprocas. 4) En un heterocigoto estructural para translocación recíproca, podría originarse algún gameto viable a partir de los productos meióticos originados en una meiosis con orientación adyacente? 5) Los grupos de ligamiento se mantienen constantes en cada especie? 6) El número diploide de un organismo es 2n= 12. ¿Cuántos cromosomas tendrá: a) un monosómico. b) un disómico.c) un tetrasómico d) un doble trisómico. e) un nulisómico.f) un haploide. g) un triploide.h) un autotetraploide. 7) ¿Cuál es la diferencia fundamental entre la aneuploidía y la euploidía? 8) Indique las diferencias entre auto y alopoliploides. 9) Debido al pequeño tamaño del cromosoma IV de Drosophila melanogaster, las moscas pueden ser monosómicas o trisómicas para este cromosoma y continuar siendo viables. a) Si una mosca disómica para el cromosoma 4 y homocigota para el gen recesivo eyeless de dicho cromosoma se aparea con una mosca monosómica para este cromosoma pero normal, ¿cuál será el aspecto de la F1? b) ¿Cuáles serían las proporciones fenotípicas que se obtendrían al cruzar los distintos fenotipos de la F1? Problemas 1) En una sección de cromosomas salivales de Drosophila las bandas tienen una secuencia 123.45678. El homólogo con el que este cromosoma debe aparearse tiene una secuencia: a)123.45876; b)123.445678; c)123.478; d)14.325678; e) 1234.45678; f) 124.35678. ¿Qué clase de cambios cromosómicos han ocurrido en cada caso? 2) En el cromosoma X de D. melanogaster se observa la región 7B constituída por 12 bandas. El carácter “quetas chamuscadas” se debe a la mutación recesiva sn situada en el cromosoma X, efectiva en hemicigosis. Cruzando machos de quetas chamuscadas con hembras de fenotipo normal, pero heterocigóticas, para diferentes deleciones que abarcan varios segmentos de la zona 7B del cromosoma X, se obtuvieron los resultados que figuran en la tabla: Hembra Deleción Fenotipo de las hembras de la descendencia 1 7B1-7B8 50% con quetas chamus cadas y 50% normales 2 7B2-7B5 Todas con quetas norma les 3 7B7-7B12 Todas con quetas norma les 4 7B5-7B10 50% con quetas chamus cadas y 50% normales

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Teniendo en cuenta que todas las deleciones estudiadas son letales en homocigosis y hemicigosis, y que las hembras utilizadas en los cruzamientos eran hijas de machos de fenotipo normal, deduzca cuál es la posición del locus sn en el mapa de cromosomas politénicos. 3) En la descendencia de un cruzamiento entre una hembra normal de Drosophila y un macho, white (w)Bar (B), Bridges observó que una hembra no había heredado el carácter Bar del padre, pero era heterocigota para el carácter white. A esta hembra se la retrocruzó con un macho w B, y las proporciones que se obtuvieron en la descendencia fueron dos hembras a un macho. a) ¿Cuál es la explicación más simple de estas proporciones anormales? b) ¿Cuál es el fenotipo de la descendencia? Se cruzaron las hembras heterocigotas estructurales de la descendencia con distintos machos que eran hemicigotas para los mutantes rudimentary (r), forked (f) o fused (fu), que están cercanos a Bar ( como lo muestra el siguiente mapa): 1.1 55.1 56.5 57 59.5 __l_____________l______l______l______l___ w r f B fu En los cruzamientos con machos forked se observaron en F1 hembras forked; sin embargo, de los cruzamientos con machos r o fu no se obtuvieron hembras r ni fu, respectivamente. c) ¿Cómo explicaría estos resultados? 4) En un cromosoma de Drosophila persimilis se han reconocido citológicamente 8 regiones denominadas a,b,c,d,e,f,g,h. Dentro de estas especies 4 razas diferentes tienen el siguiente orden cromosómico: a) a h b d c f e g. b) a e d c f b h g. c) a h b d g e f c d) a e f c d b h g. Suponiendo que cada raza evolucionó por una inversión paracéntrica simple a partir de otra raza, muestre cómo pudo haberse originado cada una. 5) En un heterocigota estructural para una inversión paracéntrica, un cromosoma tiene una ordenación 12.3456789 y su homólogo 12.3765489. a) En un meiocito se produce un entrecruzamiento en la región 4-5, durante paquitene ¿qué se observaría en anafase I? b) ¿Cómo se observaría la anafase I de otro meiocito en el que se produce un entrecruzamiento en la región 6-7? c) ¿En cuál de los dos meiocitos será mayor el tamaño del fragmento formado en Anafase I? 6) En cierta especie de Drosophila, que tiene los cromosomas telocéntricos, se conocen los loci A,a, que está muy próximo al centrómero, B,b situado a 30 cM del anterior y C,c a 15 cM de B,b y a 45 cM de Aa. Un macho de fenotipo normal capturado en el campo se cruzó con una hembra, perteneciente a una población de laboratorio, que es normal en todos los

aspectos, salvo recesiva para los tres caracteres antedichos. Toda la descendencia del cruzamiento fue de fenotipo dominante. Cuando las hembras de este cruzamiento se sometieron a un cruzamiento de prueba con machos de la población de laboratorio se obtuvo la siguiente descendencia: Fenotipo Número de individuos ABC 4250 Abc 490 aBC 510 abc 4480 a) Explique por qué aparecen sólo cuatro fenotipos. b) De los datos de la tabla se deduce que la fracción de recombinación entre A,a y B,b es 0,1. ¿Cómo se puede explicar esta discrepancia con los datos del enunciado? 7) En hembras de D. melanogaster heterocigotas para las siguientes 3 mutaciones: Bristle (Bl), mutación dominante ubicada en el cromosoma 2; Dichaete (D), mutación dominante ubicada en el cromosoma 3, y eyeless (ey), mutación recesiva ubicada en el cromosoma 4, fueron cruzados individualmente con machos homocigotas para ey. La mayoría de los cruzamientos producen las 8 clases fenotípicas esperadas: Bl D ey+; Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey; Bl+ D ey Seis hembras produjeron un número limitado de fenotipos que es el siguiente: a) Bl D ey+; Bl D ey; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey. b) Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey+ c) Bl D ey; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+. d) Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D ey. e) Bl D ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey. f) Bl D ey+; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey. Para cada una de estas hembras dé la explicación más simple de la causa que pudo restringir el número de fenotipos de la descendencia (considere que los quiasmas son terminales). 8) En el cultivar de centeno Ailés (2n=14), que presenta polimorfismo para translocaciones recíprocas, se cruzó una planta heterocigota para una translocación, que a su vez era heterocigota para 4 loci distintos (AaBbCcDd), por una planta homocigota estructural para la ordenación normal, que también era homocigota recesiva para los 4 loci. Los resultados obtenidos en este cruzamiento se indican en la tabla: Configuración meiótica en metafase I de los descendientes Loci 5 II + 1 IV 7 II . A,a Aa:50 aa: 9 Aa: 7 aa:57 B,b Bb:33 bb:26 Bb:31 bb:33 C,c Cc:59 cc: 0 Cc: 0 cc:64 D,d Dd:30 dd:29 Dd:32 dd:32 a) Indique si alguno de los loci se comporta como ligado a la translocación. b) ¿Cómo explica la ausencia de individuos cc con 5 II y 1 IV, y la de individuos Cc con 7 II?

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9) Suponga que está est tudiando la c citogenética d cinde co especies íntimament relacionad de Droso te das ophila. La figura d abajo mue de estra el orden de los gen (las n nes letras indican genes qu son idént ue ticos en las cinco especies) y los grupos d cromosom que se en de mas ncuentran en cada especie. a

2n n=26. Los híb bridos entre estas especies muestran los sig guientes arreg cromosó glos ómicos duran la meiosi nte is: HI IBRIDO C Configuraci ión meiót tica e metafase I en e
G. hirsutum x G. thurberi 13 II pequeños + 13 I grande s es G.h hirsutum x G.herbaceum 13 II grandes + 13 I pequeño os G.t thurberi x G.h herbaceum 13 I grandes + 13 I pequeños

1

3

1+ +

3

2

4

2

4

a) Explique de qué mod probablem e do, mente, estas e especies evoluci ionaron una a partir de ot esquema tra, atizando los camb ocurrido en cada pa (Nota: as bios os aso. segúrese de que comparar el orden de los genes con c s cuidado). b) Esquema atice una celu en paquit ula tene y otra a anafase I de una hembra hí íbrida obten nida a part del tir cruzamiento de un ma o acho de la e especie a po una or hembra de la especie c. (Considere solamente los dos . pares mayo ores, y la form mación de u solo quias un sma en cada bivalen nte). 10) Tratand de locali do izar (mapear en una e r) especie autógama (2 7x) el lo 2n= ocus correspondiente a u pauna reja alélica A,a, se cru un indiv uza viduo de ge enotipo recesivo po los 7 trisóm or micos de un variedad de gena notipo dom minante, obte eniéndose u una F1 com mpuesta por individu de 14 y 15 cromosom Al auto uos mas. ofecundar estos úl ltimos (los d 15 cromos de somas) se ob btuvieron los res sultados que figuran en la tabla. ¿E qué e En cromosoma está el loc considera a cus ado? Justifiq su que respuesta
Trisómico os cromosoma 1 a cromosoma 2 a cromosoma 3 a cromosoma 4 a cromosoma 5 a cromosoma 6 a cromosoma 7 a Fenotipo de la descen o ndencia obteni por ida autofecu undación de lo trisómicos d la F1 os de A a 140 45 73 24 115 40 405 130 700 20 95 34 208 70

Nota: II bivalente I univalen es, ntes a) ¿Cómo podr interpreta estos resultados desde un ría ar e pu unto de vista filogenético? ? b) ¿Cómo pod probar q su interp dría que pretación es corre ecta?. 13) Existen sei especies p is principales del género Br raslza sic al que per ca rtenece la col (y la can nola): B. cari inata, B. campestr B. nigra B. oleracea B. juncea, B. ris, a, a, , nap Las rela pus. aciones entre las especie pueden de e es educir a partir de la tabla: rse e a) Deduzca el número de c cromosomas de B. camp s pestris B. nigra y B. oleracea. s,
Especie o híbr E rido F1 Crom mosomasBivalentesUnivalen ntes B. carinata 34 17 7 0 B. napus 38 19 9 0 B. juncea j 36 18 8 0 B. juncea x B. ni j igra 26 8 10 B.n napus xB.camp pestris 29 10 0 9 B.c carinataxB.ole eracea 26 9 8 B. juncea x B.ole j eracea 27 0 27 BcarinataxB.cam mpestris 27 0 27 B. napus x B. nig gra 27 0 27

b) ¿Algunas de las especies mencionadas son polie s plo oides ? ¿Cuá áles? c) En caso afir rmativo seña las especi progenito ale ies oras de cada una de las especies poliploides. e s . d) Explique me ediante cruza amientos com se origina mo aron las especies poliploides n s.

5. GENÓM MICA Y P POSTGEN NÓMICA A

11) La zar rzamora eur ropea (Rubus idaeus) tie 14 s ene cromosoma Otro tipo de mora (R as. o Rubus caesi ius) es tetraploide con 28. Los híbridos en estas es s ntre species son individ duos F1 estér riles. Alguna gametas q no as que han reducid sus cromo do osomas en la F1 son funci ionales en las cruz retrógrad zas das. Determ mine el núme de ero cromosoma y el nivel d ploidía pa cada uno de los as de ara siguientes c casos: a) F1; b) Retrocru con amb pauza bos dres. 12) Las esp pecies de alg godón del N Nuevo Mundo Goso sypium hirs sutum tienen 2n=52. Las especies del Viejo l Mundo: G. thurberi y G.herbaceu tiene cad una um da

Gu de estud uía dio 1) ¿Para qué si irven los mar rcadores gen néticos (mole ecular y no mole res eculares)? R: Para mapea Existen distintos méto ar. odos de map peo: físico y genéti ico. Los map físicos se construye a pas s en par de la se rtir ecuenciación del ADN y otras técni icas

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moleculares, como el mapeo con enzimas de restricción (como se vio en la guía 1 –Biología Molecular-) usando o no Southern blot, la hibridación in situ, la alineación de insertos genómicos clonados en BAC y YAC, caminatas cromosómicas, comparación sinténica de genomas filogenéticamente relacionados, etc. Los mapas genéticos se construyen a partir de análisis de ligamiento en poblaciones segregantes posteriores a la recombinación y sumando distancias entre loci sucesivos lo más próximos posibles (ver guía 7 de mapeo). Ambos mapas no coinciden en cuanto a las unidades utilizadas (número de nucleótidos o pares de bases versus unidades de recombinación) ni en las distancias relativas (las frecuencias de recombinación no son parejas a lo largo de todo el cromosoma), pero sí en el orden de los marcadores. 2) Compare el uso de marcadores genéticos moleculares, bioquímicos y morfológicos. R: Su uso para mapeo genético es similar, salvo cuando los marcadores morfológicos están determinados por más de un locus (epístasis) o son de distribución continua (“cuantitativos”). Pero aún en estos casos existen formas de utilizarlos que se verán en otras guías. Los marcadores morfológicos pueden verse influidos por el ambiente, el momento de desarrollo, el órgano y otros factores. A menos que se conozca su base molecular (secuencia nucleotídica) no pueden ser usados para mapeo físico (salvo que sean marcadores citogenéticos = morfología cromosómica). Los marcadores bioquímicos (fundamentalmente patrones de electroforesis de proteínas e isozimas), tienen particularidades intermedias. 3) ¿En qué medida los marcadores moleculares permiten relacionar los mapas genéticos con los mapas físicos? R: Porque se puede relacionar su localización genética con su hibridación y mapeo físico en clones genómicos alineados de BACs y YACs. Una serie de clones solapados se denomina contig. Para formar el contig, se emplean secuencias cortas y únicas presentes en los insertos clonados como si fueran marcas distintivas (por ejemplo, un sitio de restricción en el contexto de la secuencia nucleotídica de un gen que se puede revelar mediante un RFLP). Esas marcas específicas se denominan STS (sequence-tagged sites). Es decir que un RFLP determinado puede ser un STS. Debido a lo tedioso y poco automatizable de la técnica de RFLP; como usualmente se conoce la secuencia nucleotídica, se la convierte en una técnica basada en PCR llamada CAPS. Como estos mismos RFLP (CAPS) pueden mapearse poblaciones segregantes, esto permite superponer el mapa genético con el mapa físico. 4) ¿Cómo clasificaría de acuerdo a la metodología a las distintas técnicas conducentes a obtener marcadores genéticos moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP). Haga una comparación entre ellas. R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de

restricción de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Debido a que se basan en la hibridación molecular lo que permite el reconocimiento entre secuencias que no son totalmente homólogas, se los considera marcadores relativamente conservados que permiten comparaciones evolutivas entre especies, géneros y familias relacionados (dependiendo de la secuencia, se puede progresar en la escala taxonómica hasta más arriba). Se continúan usando en estudios de sintenia (mapeo comparativo). Como contrapartida, resulta más complicado encontrar variabilidad (polimorfismos informativos) intraespecíficos para hacer, por ejemplo, genotipificación (identificación a nivel de individuo o fingerprinting). Hoy en día, los RFLPs han sido desplazados en gran medida por los SNPs (polimorfismo de nucleótido simple –único-, se pronuncia SNiP). Los SNP no tienen una única metodología como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR en alguno de sus pasos. Cualquier técnica que permite visualizar un cambio en un nucleótido se clasifica como SNP. Como ejemplo ya se mencionó a los CAPs que implican la amplificación y posterior digestión del producto de PCR con una enzima de restricción (aquel que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en día, los polimorfismos a detectar son identificados a partir de estudios previos de secuenciaciones genómicas más que de RFLP. No todos los SNPs requieren restricción. Otra técnica bastante clásica clasificada como SNP es la SSCP que consiste en desnaturalizar el ADN y diferenciar electroforéticamente las diferencias de migración de los plegamientos secundarios intracatenarios derivados del cambio nucleotídico. Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto de los RFLP: a) existe mayor número de alelos en la población (en humanos se stima que hay un SNP cada 1000 pb) y b) el grado de heterocigosis es alto, con lo que resultan ser más informativos. Comparten con los RFLP la ventaja de no ser anónimos (se conoce su identidad –secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y su codominancia (posibilidad de diferenciar heterocigotas de homocigotas). Los otros marcadores de mayor utilización (junto con los SNPs) son los microsatélites o SSR (single sequence repeats) están constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repetición en tándem de di-, tri y tetranucleótidos. La repetición más común es la del dinucleótido CA en animales y TA en vegetales. Aquí lo que varía no es un único nucleótido, sino el número de veces en que se repite el motivo de repetición, lo que es detectado como productos de amplificación que poseen tamaños que varían según la cantidad de repeticiones. Son los marcadores más utilizados para genotipificación (también llamado genotipado o fingerprinting). Los RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA, se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que surgen luego de utilizar un único oligonucleótido ini-

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ciador (primer) en la reacción de PCR. Son polimorfismos para fragmentos de ADN amplificados al azar del genoma, obteniéndose una serie de bandas de distintos tamaños según donde se haya pegado ese primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella de ADN que puede emplearse para caracterizar a un individuo. Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qué lugar del genoma hibridan. Por eso se dice que son anónimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo específico) su localización cromosómica. Como son oligonucleótidos de 10 bases, en general “pegan” en varias regiones del genoma, por lo que al correr el producto de la PCR en geles de agarosa, generalmente se observan varios fragmentos, que miden hasta 2 kpb. Otra desventaja es que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del homocigota) y problemas de reproducibilidad. Su mayores ventajas son los costos y la posibilidad de usarlos con cualquier genoma de cualquier especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genómica. Al igual que los RFLPs, se los puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR específica (en este caso se llaman SCARs). Los AFLP representan una sofisticación más reproducible que combina restricción con endonucleasas y amplificación selectiva por PCR. Si bien comparte desventajas y ventajas con los RAPD (son dominantes y anónimos, no requieren de información genómica previa), son más costosos pero su mayor costo se ve compensado por la generación de muchas más bandas polimórficas por corrida (data points) y mayor reproducibilidad.
RFLP AFLP RAPD SSR SNP restricción PCR hibridacióndominantes codominan. + + + + + + + + + + +/+ +

4) ¿Cuál es el origen de la variación genómica (mutaciones) detectada por cada una de ellas y cuál es su magnitud?
RFLP AFLP RAPD SSR SNP sustitución INDELHiper AltaConservado + + + + + + + + + + -

Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucleótidos, INDELs: Inserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables (altísima tasa de mutación/evolución, máximo polimorfismo), Alta: variación, Conservado (particularmente cuando afecta secuencias funcionales codificantes) 5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases posibles se encuentran representadas en forma similar y totalmente al azar (contenido de GC = 50% uniformemente distribuido a lo largo del genoma): a) ¿Cuál es la distancia promedio esperable entre sitios de restricción para enzimas que reconocen especi-

ficidades de secuencia de 6 pares de bases, como EcoRI? ¿y para una de 4 o de 8 pb? b) ¿Cuántos sitios de restricción y, por lo tanto, bandas de DNA en un gel, se generarían en un genoma humano (109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial humano (104 pb) se generarían con EcoRI? c) ¿Cuántas bandas generarían los RAPD que usualmente se hacen con decámeros y se detectan por PCR? R: a) Un sitio de restricción de 6 bases aparecerá, como promedio, una vez cada 46 bases, es decir 4.096 pb. Una de 4 será cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb será de una cada 65.536 pb. b) 109 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o sitios para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre 2 y 3 para el genoma mitocondrial. c) Por un lado debemos considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser “perfectos” (los 10 nucleótidos tienen que ser perfectamente complementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por lo tanto la distancia se podría calcular como para los sitios de restricción 410 = 1.048.576. En un genoma humano habría 1000 sitios, en uno bacteriano, uno sólo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones estén invertidas y “apuntando” hacia adentro entre primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia media aumenta a 4 millones) y que la distancia sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa deja de funcionar eficientemente más allá de este tamaño. La probabilidad de que 2 sitios distintos estén en una posición arbitraria es de uno en 410 x 410 = 42x10 = 1.099.511.627.776 ~ 1012. Sabiendo que las distancias para una amplificación detectable varían entre un poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600 pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias en alguno de esos nucleótidos es 44-2x10 x 2500 = 10-12 x 2,5.103 = 2,5 x 10-9, lo que significa que espero encontrar entre 2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, sólo el 1% está a la distancia necesaria para dar bandas amplificables. Sin embargo, el número de bandas observadas es mayor, debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en las condiciones de anillado de los primers. 6) ¿Qué ventajas tendría el usar enzimas que son sensibles (no cortan) a la metilación de citosinas en el sitio de restricción (como es el caso de PstI) y que ocurren con enorme frecuencia en el DNA heterocromatinizado de organismos eucarióticos? R: Si lo que se busca es clonar genes transcripcionalmente activos este comportamiento es una ventaja porque sólo se clonaría aquello que es digerido por la enzima. El DNA metilado daría fragmentos demasiado grandes para ser detectado o clonado (el DNA de muy alto peso molecular se transfiere pobremente a filtros en los Southerns y por su tamaño no puede ser clonado eficientemente en los vectores más comunes, entre otras razones). También servirían para diferen-

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ciar “alelos” epigenéticos (como los que están en el cromosoma X en mujeres) o diferencias de estados del gen entre tejidos expresantes (hipometilados) versus silenciados (hipermetilados). 7) ¿En qué consiste el clonado posicional y el "caminado cromosómico"? ¿Para qué se utiliza? Clonado posicional: El clonado posicional se utiliza cuando no se dispone de otra información del gen que se desea clonar más que su posición cromosómica relativa respecto a un marcador molecular. La idea es poder disponer en el mismo inserto clonado en un vector, tanto el gen deseado como la secuencia del marcador molecular o en algún otro vector de secuencia vecina contigua (contig). Este tipo de clonados fueron posibles a partir de la aparición de vectores que permiten clonar segmentos de ADN grandes (200.000 bases hasta 1.000.000 de bases) como los BAC y YAC. Caminado cromosómico: Los extremos de un fragmento clonado se usan como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Estas sondas detectan clones de regiones del ADN que se superponen con el clon inicial Se aisla un pequeño segmento de ADN de un extremo del material, se inserta en el primer clon y se lo usa como sonda para volver a rastrear la genoteca en busca de un clon que contenga ese segmento y la secuencia contigua del genoma. Con el segundo clon se puede obtener un tercero, y así sucesivamente, hasta tener un conjunto de segmentos clonados que se solapan. Permite el clonado posicional. Es decir, conociendo la localización del gen y disponiendo de uno vecino clonado, se puede aprovechar esta vecindad para así clonarlo. 8) ¿Cómo se encara un proyecto genómico? ¿Por dónde se empieza? ¿Qué tipo de vectores de clonado son los más habitualmente usados? R: Como no se puede secuenciar sobre los cromosomas (la longitud de ADN es muy larga y el ADN está “mezclado”) lo primero que debo hacer es segmentarlo en fragmentos manejables por las actuales técnicas moleculares. Esto se hace en 2 etapas: primero se clona en vectores que permiten insertos grandes (BAC y YAC) y a éstos últimos se los subclona en vectores con insertos más pequeños (fagos y plásmidos). Ahora bien, al segmentar un genoma pierdo el ordenamiento lineal que tenía el ADN en el cromosoma por lo que tengo que organizar los clones en grupos de contigs y así rearmar el ordenamiento perdido. Esto se logra mediante mapeo físico y genético por lo que, en realidad, todo proyecto genómico comienza siendo un proyecto de mapeo. 9) ¿Qué es el transcriptoma y los EST? ¿Cómo se construyen y para qué sirven? R: Como el procedimiento arriba descripto es largo, laborioso y a veces económicamente inviable, se procede paralelamente (o exclusivamente) por otra vía que aporta, además herramientas que son necesarias para el mapeo. En este procedimiento se privilegia la secuenciación de lo que más interesa y que son los

genes. Como los genes (a diferencia de las secuencias intergénicas no codificantes) se transcriben, una forma es armar clonotecas de ADNc de distintos tejidos y en distintas situaciones ambientales y fisiológicas y secuenciarlas en forma grosera y masiva. De esta manera se obtiene una colección de secuencias representativas del transcriptoma denominadas EST (expressed sequence tags o secuencias expresadas) de las cuales se desconoce mayormente su función. En muchos casos, esta función puede deducirse en base a la homología de las secuencias con las de genes caracterizados en otras especies mediante búsqueda y comparación con las bases de datos de los bancos de genes. Estos ESTs pueden usarse para el diseño de micromatrices (chips de ADN) y para mapeo por RFLP/SNP y servir como marcas ancladas (STS). 10) ¿A qué se llama genómica funcional y análisis de proteoma? En este contexto ¿para qué se usa el etiquetado mediante transposones o “transposon-tagging”? ¿Qué son las micromatrices o microarrays y chips de DNA? ¿Para qué se usan? ¿Qué técnicas para la caracterización de interacciones proteína-proteína conoce? R: La genómica funcional es la rama de la genómica que estudia la función molecular asociada a las secuencias expresadas descriptas por los proyectos genómicos. Estos estudios comprenden tanto estudios predictivos “in silico” por comparación de una secuencia incógnita con secuencias depositas en bases de datos como la corroboración de su función molecular a través de distintas estrategias. Estas estrategias incluyen estudios de complementación génica por sobre expresión o silenciamiento de secuencias incognitas, la asociación de determinado fenotipo con mutantes inducidas tanto por mutagenesis química como por “transposon tagging”. Esta última estrategia permite utilizar secuencias conocidas correspondientes a transposones que interrumpen genes de interés como etiquetas para asilar estos genes. En la última década la genómica funcional ha contado con el desarrollo de micromatrics de ADN o chips que son soportes sólidos que incluyen un elevado numero de secuencias correspondientes a un organismo, pudiendo estar representado el transcriptoma completo de una especie para estudios de expresión concertada en disitntas estadios de desarrollo, distintas condiciones de crecimiento, respuestas a estreses bióticos u abióticos, etc. La proteómica estudia el conjunto de proteinas presentes en determinadas condiciones de desarrollo y/o crecimiento en los sitemas biológicos de interes, permitiendo la determinación de las secuencias primarias así como de su possible estructura e interacción con otras proteínas a través de sistemas de estudios de interacción proteína-proteína como el sitema doble hibrido en levaduras. Problemas: 1) El famoso detective Sherlock Molecularis se encuentra investigando un asesinato. La pista determinante del caso es una mancha de semen encontrada en la ropa de la víctima, de la que pudo extraerse DNA,

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el cual se s sometió a co por una enzima de r orte restricción apropi iada y posterior electrof foresis, cuyo Souto hern blot se analizó por hibridación con el fago M13 e r n o (sonda de J Jeffreys, Natu 314 [198 67-72). En un ure 85]: carril parale se corrió, en idéntica condicione una elo as es, muestra de DNA de li infocitos del sospechoso Jack l o Destripador rius. En la fig gura se mues el resulta de stra ado la correspon ndiente autor rradiografía: I.- Si Ud. f fuera Watso (no James), cuál de las sion guientes afi irmaciones c creería correc para ases cta sorar a Sherlock?: a) Jack es presumiblem mente culpab porque la sonda ble a hibrida tant con el DN de la ma to NA ancha como con el de Jack. La diferencia en el patrón d bandas se debe a n de que el sem contiene gametas y estas refle men e ejan la constitución haploide. P n Para confirm la culpab mar bilidad habría que repetir el an nálisis con u muestra de seuna men de Jack k. b) Jack no es culpable porque los patrones son difeo e n rentes a pe esar de que ambos DNA hibridan con la As sonda y com mparten buen parte del p na patrón de ban ndas. c) El presu unto culpable pasó a ser el hermano prófugo de Jack (con antec k cedentes pol liciales) porq el que patrón de bandas de Jac no coincid pero las b ck de, bandas comunes (a aproximadam mente la m mitad de tod las das bandas) hac sospecha de él. Se requiere, si emcen ar in bargo, un an nálisis del D DNA del jove escurridiz para en zo confirmar esta hipótesis s. II.- Dado q estas secuencias son tan hipervar que riables (muy polim mórficas), se s supone que l tasa de mu la utación (creación d nuevos alelos por el mecanismo de rede combinació ón desigua al o por deslizam r mientoresbalamien de la DN polimera nto NA asa) en game etas es considerable (se calcula un µ = 0,00 ¿Cree U que a 01). Ud. se puede us este tipo de análisis p sar para tests de paternidad? III.- ¿Qué % de bandas coincidente se esperar ens es ría contrar, com mparando los patrones de bandas de persos e nas relacion nadas por los siguientes p s parentezcos?: - madre e hijo - abuelo y nieto - tío y sob brino 2) Mediante hibridación in situ, se pudieron localizar e n 5 YACs de DNA huma (YAC-A a YAC-E) e una e ano A en región crom mosómica det terminada de genoma hu el umano y se desea hacer un m mapa físico d alineamien de de nto dichos clon (mapa de contigs). Los 5 clones fueron nes e evaluados m mediante hibridación con 3 STS (sequ n uencetagged site o sitios de secuen es ncia indicad dora – marcadora-) ). Para obtene los STS, s digirió DN con una e er se NA enzima de restricción y se con nstruyó una genoteca en fago n lambda con los fragmen n ntos resultan ntes. Se anal lizaron varios de lo clones de esta genoteca mediante hibrios e dación con DNA genó n ómico YAC humano, d descartando todos STS A B C D E S aquellos clo ones que hibrida- 1 + + + - ban con DN repetitiv De 2 NA vo. - + + + aquellos qu hibridaban con ue 3 + + - - +

cuencias úni icas, se selec csec cio onaron 3, lo cuales s os se hib bridaron con los YAC n Cs obteniéndose l siguiente los es res sultados: a) ¿Por qué no se trató d de hacer Souther rns con lo os YA y realiza un mapeo AC ar por restricción de esta ma n aner ¿Porqué no hibrida ra? é ar dir rectamente lo YAC entr os re sí, evitando re ecurrir a un na sub bgenoteca en fago lamb n bda de los mism mos? ¿Por q se desca qué artaron aquel llos clo ones de la ge enoteca en fa lambda que no hibri ago idaban con secuen n ncias únicas? ? b) Dibuje un m mapa físico con la aline eación de lo 3 os ST y ordene (en paralelo) el mapa de contigs de los TS e YA ACs. 3) La levadura fue la prim a mera de las es species eucar rióticas que fue t totalmente se ecuenciada y constituye un sis stema model de invest lo tigación deb bido al tama año rel lativamente chico de su genoma y el número ta e ambié relativam én mente chico d genes. Se sabe que h de e hay ~6 6000 genes codificantes p para proteína de los cua as, ales hay 2400 para los que no s tiene ni id de qué f y se dea funció cumplen. Uno de los temas que siempre conc ón s citó int terés es el pr roceso de es sporulación (que en leva ( aduras está asocia a la me s ado eiosis). La misma se puede m con ntrolar y sinc cronizar con relativa sen n ncillez ya que se e inc cuban levadu uras diploid en un medio con defides m cie encia de ni itrógeno, lo que dispara la meiosisesp porulación. L misma o La ocurre en 3 fases bien difef ren nciadas. La I o temprana en la que se abandona el a, a est tado vegetat tivo para pa asar al espor rulado. La I o II me edia, coincid con la mei de iosis I. La III o media-tar I rdía coincide con la meiosis II. Previament a la aparic a te ción de los arreglo de DNA (DNA array o chips de os ys) DN se había identifica NA, an ado, mediant los cada v te vez má obsoletos Northern bl ás lots unos 250 mRNAs. C 0 Con la llegada de los chips, e número ca el ambió drásti icaente col. cience 282:6 699). Se prep paró me (Chu y c 1998, Sc mR RNA total de cada una de las fases y se hibridó c e contra las secuenc de los 6000 genes. Se identifica a cias S aron 256 genes que se activan específicam e mente durante la e fas I. En la gr mayoría de ellos se identificó la sese ran i cuencia: 5’GG GCGCC3’ a 6 pb del nucleótido 1 del 600 n gen en dirección 5´. n, a) ¿Qué le sugiere este res sultado? Se identificaro 158 genes adicionales específicos de on s s s la fase II, de lo cuales, el 70% tienen otra secuen os l n ncia con nsenso deno ominada M MSE. Ademá aparecie ás, eron otr 61 genes específicos de la fase III. Finalmen ros s s I nte, un observació curiosa fu que 600 genes que se enna ón ue g con ntraron activ en la fase vegetativa no pudieron ser vos e det tectados dura todo el p ante proceso de esporulación. e . b) ¿Tendrá algún interés e último dato? este d

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c) Podrá h hacer una est timación de qué proporc ción de los gene está impli es icado, direct o indirecta ta amente con el p proceso de es sporulación? d) ¿A qué se dedica el resto de los 6000 genes? ? 4) Pasó sin llamar much la atenció una pelícu esho ón ula trenada hac unos ce llamada años GATTACA (que A no debe su nombre a una gat muy ta agresiva sin a una no secuencia nucleotídica y a la vez nombre de un centro de viaje al eses pacio del futuro cercano). S trata Se de un típico thriller o con ambie ente de ciencia-ficc ción que se plantea u esceun nario futur muy ro inquietante (más detalles en:http://ww ww.spe.sony.com/Picture es/SonyMvie es/mov ies/Gattaca/ /home.html). Gracias a la tecnolog del . gía genoma hum mano, se pod predecir c bastante precidrá con e sión las pro obabilidades de morir, p ejemplo, de un por ataque card díaco antes de los 30 año Hasta aqu nada os. uí nuevo que no hayan de estacado tod los diari codos ios mentando las posibilida ades de la ci iencia real a partir de la secuenciación del genoma hu l umano. La película avan-za en otro aspecto que es la po osibilidad de planificar la com mposición gen nética (a-lelo de los hi- de os) -jos una pareja. No lo hace en un sent e tido tan decl laradaista de mente fasci (que todos sean arios, rubios y d ojos azules estilo “Los niños de Brasil”) sino tratan de o ), ndo evitar los a alelos de la l llamada carg genética (alelos ga que predisp ponen a enfe fermedades c coronarias, c cáncer, neurológica etc.). No s trata de “c as, se clonar” un H Hitler o un premio N Nóbel, sino d elegir entr los futuros hijos de re posibles dis sponibles, “los mejores a alelos” del p padre y la madre de futuro hij el jo/a, sin des spreciar los “clásicos” color d ojos, coefi de ficiente intele ectual o altur ra. a) ¿Le pare que esto sea factible en la ciencia real? ece a Si Ud. fuera un científic convencid de las bon a co do ndades de liberar a la especie humana de su carga gen nética, basándose e las técnic que apre en cas endió sobre clonación e ingen niería genética en anima (que no e este ales es caso) ¿Cóm diseñaría un sistema de análisis d este mo de tipo? b) Si bien e una parte de la pelícu en meno de 5 en ula, os minutos pu ueden genera un largo d ar diploma con la secuencia nuc cleotídica de una muestra sacada de un pea lo, aún en el mejor es scenario futu (en el s uro sentido científico), no se podrá secuenciar los 30.000 genes án r humanos pa una aplic ara cación masiva como la m mencionada ¿Qué tipo de ma arcadores m moleculares t tendría

qu utilizar par esta detec ue ra cción? ¿Podrá detectar to odas las mutaciones posibles? D s s Discuta este punto. p c) Después de resolver el último probl lema de la g guía de mutaciones ¿le parece q librar a la humanidad de que a d tod los alelo deletéreos es un obje dos os s etivo alcanza able po “mejorami or iento”? Para “premia la “planif P ar” ficación gen nética familia ar”, la sociedad de GATTACA se divide en 2 clases b e A e bien diferenciadas. Aquellos que fueron “planificad dos” tie enen acceso a los mejo ores empleos mientras q s, que aq quellos que son “hijos d azar” so considerados del on “in nválidos” o “de-gen-era ados” y sólo pueden ser barre enderos o ten profesion mal paga En la pelí ner nes as. ícula, una familia tiene 2 he a ermanos (uno de cada “c o clase El herma no planif e”). ano ficado “gené éticamente in nferio logra en or” ngañar al sis stema y acce eder a un bu uen em mpleo aprove echando la c complicidad de una perso ona “g genéticament calificada” que le da muestras de t te ” m tejido (de su DNA bah). Tod va bien ha que se p o A, do asta produ un asesin uce nato y.... no le vamos a contar la pa arte su ustanciosa de la película El tema es que hay u e a. e una “c chica linda” ( más ni m (ni menos que Um mma Thurm man) qu se enamor del mucha ue ra acho que, si bien será ge enéticamente infe erior, es tam mbién ¡tan bueno y lin b ndo! Bu ueno, la chic lleva pelo a una em ca os mpresa que, por pocos dólares, le analiza ( (por computa adora) la hue ella dig gital genética de identid del muchachito (obv dad viame ente tiene su dudas y n es cuestió de juntar sus us no ón ale con un d elos desconocido) ). d) ¿Es esto po osible? ¿Qué técnicas utilizaría para poder hacer una cosa así? (no estamos ha r o ablando de p predis sposición a e enfermedades sino de ide s, entidad). 5) Mégy y co olaboradores (Genome Biology, 20 s B 002) pu ublicaron un trabajo de i identificación de ESTs ( n (secuencias transc criptas) espe ecíficamente expresadas en e ntre s ron: el corazón. En los ESTs identificados encontrar NA ADH dehidrogenasa, ubi iquinona, miosinas, tro opomi iosina y actin (involucra na ados en la co ontracción m muscular), coligina (interactúa con el colá a a ágeno cardíac co), 13 no mostraro poseer fu on unciones rela acionadas (ha asta est trabajo) c el corazón y 11 no tenían func te con ción alg guna conocid Además, 5 de ellos (TG114, TG da. ( G13, TG G131, TG13 32_7, TG78) fueron rel ) lacionados p previa amente con p problemas ca ardíacos. Es decir, la enf ferme edad se relac ciona con la malfunción de los mism mos. La figura mues la topolo a stra ogía de la reg gión regulato oria en el extremo 5 de 17 prom 5´ motores de genes cardíac g cos. Fig gura CAAT GC, TAT y CAP son secuenc T, TA cias con nsenso relacionadas a la unión de la RNA polime erasa II. Otros mo otivos llama ados TRANS SFAC y MEM ME as se representan como punta de flecha. Los cuadrados osc curos (GKLF representa sitios de unión de un f F) an u factor de transcripción pareci al Krüpp de Dros r ido pel sophil Similarm la. mente, (Tcf11 _Rora, TC 1 Cf11_API_C) se ) rep presentan otr motivos n ros nucleotídicos identificado s os. a) ¿Qué son y qué función cumplen estas secuenc n e cias en la región 5’ no codifican de estos genes? nte g

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b) ¿Porqué algunas secuencias están en la mayoría de los genes y otros no? ¿Es esta una muestra representativa? c) Dado que a esta altura está totalmente secuenciado el genoma humano ¿porqué estos investigadores utilizaron esta metodología “más antigua” para poder identificar genes cardíacos? Es decir, ¿porqué no les alcanzó esa información previa? ¿Se podrían haber utilizado “chips” (microarreglos de DNA)? d) ¿Encuentra alguna relación entre unión de factores de transcripción y patologías cardíacas? ¿Cuál? ¿Podría proponer a uno (o varios) gen/es sospechoso/s a la lista? e) Con estos datos limitados ¿podría proponer una hipótesis de explicación molecular de las patologías cardíacas? f) ¿Cómo confirmaría sus hipótesis de la relación establecida en el punto d y e a nivel funcional? Recuerde que, por razones de ética (hacia nuestra especie) todos los experimentos se hacen con ratones 6) P36 es una proteína de 36 kDa de Mycobacterium tuberculosis cuya función fue asociada a los mecanismos de virulencia del bacilo. La ahora Licenciada Laura Klepp estudió durante su trabajo de tesis de Licenciatura, la interacción de dicha proteína con el proteoma micobacteriano empleando un sistema de doble híbrido en bacterias basado en la inducción, mediada por cAMP del operón lactosa via proteína CAP. El sistema se basa en la expresión, por un lado, del dominio T25 de la adenilato ciclasa y por otro lado, del dominio T18. Cuando estos dominios están separados, no se detecta actividad de adenilato ciclasa. En cambio cuando se produce una interacción proteínaproteína que las acerca físicamente, se recompone dicha actividad. Se clonó el gen P36 en el plásmido

pKT25 (anzuelo codifica el dominio T25) y también se construyó una genoteca de M. tuberculosis en el plásmido pUT18C (codifica el dominio T18 en fusión con el gen de la proteína a “pescar”). Para ello, lo primero que se llevó a cabo fue la amplificación del gen P36 por PCR. a) El oligonucleótido 5’ fue diseñado de manera que se respete el marco de lectura del fragmento codificante para T25 presente en el sitio de clonado ¿Por qué? b) Luego de llevada a cabo la ligación y la transformación, los clones positivos se identificaron en la placa por presentar color blanco en presencia de IPTG (análogo de la lactosa) y X-Gal (sustrato incoloro de la β-galactosidasa y que se convierte en un producto azul). ¿Qué hubiera significado que fueran colonias azules? c) Ya obtenido y caracterizado el “anzuelo”, vino la parte de la proteína a pescar: se subclonaron fragmentos producidos al azar del genoma de M. tuberculosis en pUT18C. Los plásmidos recombinantes se introdujeron, junto con los que contienen secuencias del gen para P36, en células competentes de E. coli por cotransfección y se obtuvieron clones positivos. ¿Cómo identificaron aquellos clones en los que las proteínas derivadas de P36 se reconocieron y unieron con otras expresadas en el vector pUT18C? d) Las secuencias con capacidad de unión pudieron ser asignadas a 2 genes ya secuenciados (Rv1417 y Rv2617) de función desconocida, pero que posiblemente sean proteínas de membrana y transmembrana. ¿Cómo se hizo para asignar las secuencias a estos 2 genes? ¿Cómo haría para investigar la función de estas secuencias nuevas? e) El plámido pKT25 (donde se clonó el “anzuelo” tiene un gen de resistencia a neomicina, mientras que el pUT18C (donde van insertos los potenciales “pescados”) tiene un gen de resistencia a ampicilina. ¿Por qué esta diferencia? f) ¿Cómo es el genotipo de las E. coli que se utilizan para este tipo de experimentos en cuanto al gen de la adenilato ciclasa? ¿Ac+ o Ac-? ¿Por qué? ¿Qué hubiera pasado si E. coli expresaba algún gen propio muy similar a Rv1417, Rv2617 o P36? g) ¿Cómo fue la composición del medio de selección? ¿mínimo o rico (conteniendo glucosa)?

6. REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA
Bibliografía: Repaso de IBMyC, Biol. Molec. Célula, Watson y col. (2a Ed.) y Genes VIII, B. Lewin cómo el DNA podía codificar una proteína y desde el Guía teórica: 1) ¿Cuál es el concepto moderno o molecular de gen? descubrimiento de los intrones y el splicing (particuHacer un esquema de un gen eucariótico típico, seña- larmente el transplicing y el splicing alternativo) y la lar qué parte se transcribe como mRNA y qué parte se edición de RNA rompieron la idea de la unidad y conexpresa como proteína. Comparar con un gen proca- tinuidad transcripcional. Definición funcionalista de gen: riótico. R: La respuesta típica sería que es “una secuencia de Unidades hereditarias que se transmiten de una geneDNA codificante para una proteína”. Sin embargo, ración a otra en forma uniforme y predecible conteesta definición estructuralista se acota a un período de niendo información decodificable sobre estructuras y tiempo determinado entre mediados de los ‘50 y los funciones. ‘80. Entre Mendel y Watson y Crick no se conocía

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2) ¿Qué mecanismos moleculares co y posttranscripcionales conoce que sean capaces de producir una sustancial modificación en la secuencia de un transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamiento (splicing). Describa la edición del RNA. R: El procesamiento del ARN genera un ARNm maduro (para genes que codifican para proteínas) o ARNr a partir del transcripto primario. El capping (agregado de una metilguanosina en el extremo 5¨), la poliadenilación (agregado de una cola de poli A en el extremo 3¨), el splicing (remoción de intrones) son ejemplos de modificación co-transcripcional, mientras que el editing (cambio de bases) y el NMD (nonsense mediated decay) son ejemplos de mecanismos de modificación post-transcripcional. Mediante sileciamiento post-transcripcional (o interferencia o quelling) también se produce degradación o inactivación específica de ARNs. Otro mecanismo muy utilizado en bacterias es la utilización de aptámeros (secuencias complementarias de ARN ubicadas en la región 5’no En el caso de genes procariotas, la situación es más compleja dado que los genes individuales pueden codificante del ARNm) que, según el tipo de plegacompartir sus secuencias regulatorias con otros genes miento secundario, pueden inducir terminación temformando operones (no siempre, el gen I del represor prana de la transcripción (atenuación) o el autoclivaje del operón lactosa no conforma un operón sino que se del ARN mediante ribozimas autocatalíticas. parece, en este sentido a los genes eucarióticos). De- Muchos transcriptos sufren splicing alternativo, remobido a esto, en los libros se suele encontrar esquemas ción de intrones y unión de los exones de un gen. de operones y no de genes individuales (ej. operón lac Como consecuencia de esta modificación cotranscripcional se producen diferentes secuencias de formado por los genes Z,Y,A, ver abajo). ARNm que codifican distintas formas de proteínas los P I O Z Y A P cuales serán tejido específicas. Otro mecanismo de procesamiento es el ARN editing. En este proceso la información contenida en una molécula de ARN se ve alterada. Se trata de mecanismos que incluyen deaminaciones de C a U y de A a I, y también inserciones y deleciones. Afecta ARNt, Transcripción ARNr y ARNm. En este último caso, se ve afectada la En estos esquemas se suele incluir, además de los 3 secuencia aminoacídica de la proteína, de manera que genes que conforman el operón, el gen del factor de la misma difiere de lo que se puede predecir a partir transcripción (I = represor) que está físicamente liga- de la secuencia de nucleótidos en la molécula de do a 5’ del operón, pero no a otros genes reguladores ADN. Se da mayormente en eucariotas y se relaciona igualmente importantes (como el que codifica a la con la presencia de variantes de proteínas según el proteína CAP–CRP- en el caso operon lac). No se sue- tejido.

Definición detallada de gen (combinación de estructura y función) Unidad de información (físicamente constituida por un ácido nucleico, DNA o RNA, que puede estar particionado, superpuesto con otros genes o no) codificante para una “unidad” de función (polipéptido o RNA, por ej. ribosomal). Propiedades: tienen capacidad de variar (mutar, recombinar, es decir evolucionar) y de tener una dinámica poblacional (comportamiento frente a la selección natural o artificial) dentro del contexto de especies biológicas. Tienen capacidad de almacenamiento y reproducción fidedigna de la información, así como su decodificación. Los esquemas de los genes en los libros suelen tener varios errores conceptuales. Por ejemplo: en el esquema que sigue, no se explicita que, así como hay un promotor, existe también un terminador. Faltaría incorporar los enhancers (que sí aparecen en otros libros). Estructura de un gen eucariota:

le esquematizar (en el operón lac) un segundo operador que es el sitio de unión (reconocimiento) de la proteína CAP, que serviría para que el operón lac constituyera un ejemplo de regulación negativa (represor) y positiva (activador CAP). No se suele esquematizar tampoco el promotor del gen I, ni los terminadores de transcripción correspondientes y otras secuencias no codificantes importantes del futuro mensajero (por ej. la secuencia de unión a ribosomas llamada Shine Dalgarno), los codones de iniciación (que muchos estudiantes suelen confundir con el nucleótido +1) y los codones de terminación de lectura.

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La degradación mediada por mutaciones terminadoras o nonsense mediated decay (NMD), es un proceso de eliminación de ARNm portadores de una mutación terminadora o de una mutación del marco de lectura que derivan en la creación de codones de finalización precoz de la síntesis de una proteína. De no eliminarse estos ARNm se producirían polipéptidos defectuosos o incompletos al ser traducidos. Estos polipétidos pueden retener parte de su función (por ejemplo actividad enzimática o capacidad de unirse a otra proteína) pero no toda (por ejemplo se puede perder la regulación de la actividad enzimática o la capacidad de unirse a otra proteína). Por lo tanto si se produjeran estos polipétidos, estas mutaciones podrían resultar dominantes. Al eliminarse estos transcriptos por NMD muchas de estas mutaciones serán recesivas. 3) ¿A través de qué mecanismos un mismo gen puede producir varias proteínas distintas? R: Por un lado se pueden producir distintos mRNAs por los siguientes mecanismos: -Splicing alternativo -Poliadenilación alternativa: un mismo gen puede tener más de un sitio de poliadenilación y dependiendo de las situaciones fisiológicas, tejidos, etc. se puede utilizar uno u otro sito. De esta forma se puede producir, a partir de un mismo gen, proteínas con distintos extremos C-terminales. Esto sucede en el caso de los genes de las inmunoglobulinas y de esta forma se regula si las mismas serán secretadas o formarán un receptor de membrana. -Promotores alternativos: Puede haber más de un sitio de inicio de la transcripción y cada promotor dar un exón 1 diferente. De esta forma se pueden producir proteínas con distinto extremo N-terminal. Además cada promotor puede tener una regulación diferente. Por otro lado, a partir de una proteína traducida se pueden producir distintas variantes por modificación post-traduccional: fosforilación, glicosidación, clivaje específico, acilación, etc. 4) ¿A través de qué mecanismos se pueden regular los niveles de una determinada proteína? R: -Estado de condensación de la cromatina -Regulación de la transcripción -Transporte del mRNA al citoplasma -NMD (en caso de haber un STOP prematuro) -Estabilidad del mensajero: Es tan importante encender rápido un gen cuando se necesita su producto como apagarlo cuando ya no se lo necesita. Existen proteínas que se unen generalmente a la región 3´ no codificante del mRNA que regulan positiva o negativamente la vida media del mensajero. También se puede regular por microRNAs. -Traducibilidad del mensajero: en algunas situaciones fisiológicas o ante infecciones virales se favorece o desfavorece la traducción de algunos mensajeros. -Estabilidad de la proteína: Algunas proteínas son rápidamente degradadas luego de ser producidas. Este mecanismo también puede ser regulado.

5) ¿Cuál es la diferencia entre un operón, que codifica para un mensajero policistrónico, y un gen que codifica para una poliproteína? ¿En qué tipo de organismos se presenta cada uno de estos mecanismos? R: Un operón es una unidad transcripcional compuesta por una zona regulatoria de la transcripción y una serie de genes ubicados hacia 3’ de dicha zona promotora-reguladora. Este segmento de ADN u operón se transcribe como un todo y a partir del mensajero policistrónico, se producen varias proteínas, cada una a partir de su propio codón de iniciación, como el caso del operón lactosa en bacterias. Un gen que codifica para una poliproteína es un gen cuyo producto se clivará post traduccionalmente para producir múltiples péptidos. Los primeros son típicos de los procariotas y los segundos de los eucariotas (virus eucariotas, precursores de neuropéptidos, etc.). 6) ¿Qué es un nucleosoma? ¿Qué proteínas participan? R: Un nucleosoma es la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Consiste en un core central de ocho proteínas básicas llamadas histonas que se ubican alrededor de un segmento de ADN superenrrollado de 146 pb. 7) ¿Cómo influyen los distintos órdenes de empaquetamiento del ADN en la expresión genética? ¿Cómo varía el grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? ¿Cómo resulta la susceptibilidad de corte por DNAasa I en cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva? R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo, durante la interfase, la mayoría de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es decir que la condensación de la cromatina se asocia a la pérdida de la expresión génica. La DNAsa I corta secuencias de ADN doble cadena. Si a las mismas se le unen factores de transcripción, existe una protección a la digestión con la enzima ya que estas proteínas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I. 8) ¿Cómo influye la metilación de las citosinas sobre la expresión genética en eucariotas? Comparar el grado de metilación de la heterocromatina en relación con el resto del genoma. R: La metilación del ADN se relaciona con una represión de la transcripción. La heterocromatina es cromatina altamente condensada a lo largo de todo el ciclo celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase. Existen dos clases de heterocromatina, la facultativa, que puede ser genéticamente activa o inactiva, y la constitutiva que permanece siempre en estado inactivo. 9) ¿Qué es un gen reportero? ¿Para qué se utilizan? Mencione algunos ejemplos. R: Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Además deben estar ausentes en la especie que se estudia para descar-

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tar una posible actividad endógena. Se utilizan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y poder, entonces, determinar la actividad promotora. Algunos ejemplos son: -Luciferasa: Oxida a la luciferina emitiendo fotones los cuales son cuantificados en un luminómetro -GFP: Proteína verde fluorescente de medusa -CAT: Cloranfenicol acetil-transferasa -β-galactosidasa: hidroliza un sustrato incoloro (ONPG) para dar un producto amarillo -SEAP: fosfatasa alcalina 10) Indique las características moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripción eucariotas. R: Los factores de transcripción reconocen y unen una secuencia de nucleótidos corta, como resultado de una complementariedad entre la superficie de la proteína y la región de la doble hélice en la zona del binding. En eucariotas, estos factores presentan un dominio de unión al ADN y otro de activación. El de binding presenta un motivo estructural de -hélices y así se une al ADN. Los más comunes son: cierres de leucina, hélice- vuelta- hélice y dedos de zinc. 11) a.- Describir el efecto de la regulación de la transcripción en procariotas en los siguientes casos: I- Operón lactosa por el represor. II- Operón lactosa por CRP (o CAP)-AMPc. III- Operón triptofano por el represor. b. ¿Qué utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su operón y en cambio el triptofano sea un co-represor del suyo? c. ¿Qué diferencias funcionales existen entre los represores bacterianos y los factores de transcripción eucarióticos? ¿y entre un operador y un enhansón (secuencia de unión de un factor de transcripción localizado en un enhancer o en un promotor)? R: a) I- El represor del operón lac reprime la expresión del operón ya que se pega a la zona operadora impidiendo que la ARNpol inicie la transcripción. Sólo cuando en el medio haya ligando, en este caso, lactosa, habrá transcripción del operón por remoción del represor. Se trata de un mecanismo de regulación negativa. II- En el caso del operón lactosa, la proteína CAP (también llamada CRP) coopera en la expresión del operón. Normalmente, la ARNpol se pega muy débilmente a la zona promotora. Pero si además se une la proteína CAP en posición 5’ del promotor, se ve un aumento de los niveles de transcripción. Se trata de un mecanismo de regulación positiva. La proteína CAP se une al ADN si en el medio existe AMPc. Los niveles de AMPc se elevan cuando no existe en el medio otra fuente de carbono como la glucosa que ejerce lo que se conoce como represión catabólica, inhibiendo (indirectamente) la transcripción del operón lac. III- En el caso del operón triptofano, un set de cinco genes adyacentes codifican las enzimas necesarias para la síntesis del aminoácido. Existe un represor que

se pega al ADN junto con el triptofano. Se trata de un mecanismo de regulación negativa, ya que al igual que el operón lac, el binding de la proteína regulatoria suprime la transcripción. b) Que no se sintetice triptofano cuando haya trp en el medio, y que se induzca la síntesis de β-galactosidasa cuando hay lactosa en el medio para aprovecharla como fuente de carbono y energía. c) Ninguna y ninguna. Distintos nombres para igual función. 12) ¿Qué son los elementos genéticos reguladores (de la transcripción) en cis y en trans? Describirlos para: a) el operón lactosa. b) un gen eucariótico como el que codifica actina. c) el gen de una proteína eucariótica inducida por una hormona esteroidea. R: Existen elementos genéticos que modulan la transcripción desde una dada posición en el genoma (en cis), mientras que otros producen elementos difusibles como proteínas que se unen a otras zonas del ADN (actúan en trans). a) cis: operador, sitio de unión (binding de CAP) y promotor. trans: represor y CAP. b) Cis: enhancers y promotor, trans: factores de transcripción que actuan sobre el promotor del gen. c) Cis y trans: idem actina y la hormona que se une a una zona determinada del ADN después de unirse a un receptor soluble intracelular (que es, a su vez, factor de transcripción). 13) ¿Cómo explica que las mutaciones que generan codones STOP prematuros sean dominantes si ocurren en el último exón de un gen de globina, mientras que son recesivas si ocurren en los primeros exones? R: Los mRNAs con codones de terminación prematuros que ocurren en los primeros exones son eliminados por nonsense-mediated decay. Si los individuos son heterocigotas para dicha mutación y la dosis génica del alelo salvaje es suficiente para mantener la función biológica, entonces los individuos serán sanos y por ende la mutación recesiva. En cambio mutaciones en el último exón no son eliminadas por NMD y el producto de dicho alelo puede tener un efecto dominante negativo interfiriendo con la función del alelo salvaje, resultando en una enfermedad dominante. 14) ¿Qué son las ribozimas, los ribointerruptores y los aptámeros? R: Las ribozimas son enzimas cuya composición química es ARN (en vez de proteína). También existen desoribosimas (de ADN). En forma natural se las descubrió en el proceso de splicing autocatalítico de intrones de mitocondrias del protozoo Tetrahymena. En este caso se trata de una ribonucleasa específica de secuencia pero existen otras actividades naturales y sintéticas. Los ribointerruptores (riboswitches) son secuencias de ARN que determinan la finalización de una transcripción de un ARNm o un splicing a través de secuencias que son parte del ARN llamadas aptámeros (que tienen la posibilidad de formar estructuras internas de doble cadena por su complementaridad de

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secuencia). Estas estructuras secundarias se ven afectadas porque la propiedad de interés de estos aptámeros es que tienen una afinidad muy fuerte de unión a un metabolito regulador (parecido al de una enzima por su sustrato), cuya presencia modifica el patrón de plegamiento del ARN desencadenando su degradación por una ribozima o por terminación temprana de transcripción porque esta estructura secundaria actúa como terminador “informando” a la transcriptasa que debe detener la transcripción. 15) ¿Qué relación existe entre los cromosomas politénicos de Drosophila con la resistencia a metotrexato en fibroblastos? R: En ambos casos se produce gran amplificación de ADN, programada a nivel de desarrollo y afectando cientos de genes en el primer caso y como respuesta al antibiótico localizada en el gen de la dihidro folato reductasa (DHFR) en el segundo. 16) El mapa del operón lac es: I P-O Z Y A El promotor (P) es el sitio donde se une la RNA polimerasa antes de comenzar la síntesis de mRNA. El operador (O) es donde se une el represor (en ausencia de inductor) codificado por el gen I. Dados los genotipos de los siguientes diploides parciales, completar la siguiente tabla con "+" si espera actividad de la proteína codificada por "Z" (ß-galactosidasa) y de la codificada por "Y" (permeasa) o con "-" si no espera actividad. Considere que las mutaciones indicadas por "-" impiden: que las correspondientes regiones no codificantes del operón se unan al ligando específico. que las correspondientes regiones codificantes del operón puedan originar por traducción una proteína biológicamente activa. Is: gen del represor con una mutación que origina una proteína incapaz de unirse al inductor (pero su capacidad de unirse al operador está intacta).
Genotipo I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ YIs P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+ I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ YI+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Yβ galac- Permeasa tosidasa +lac -lac -lac +lac

Problemas: 1) La figura muestra la estructura de un plásmido. El gen R del fago lambda codifica un represor que reprime la transcripción de ciertos genes del fago controlados por el promotor/operador PL; pero en este caso, R tiene una mutación tal que la proteína codificada resulta termosensible: reprime a 30ºC, pero no reprime a 42ºC porque su estructura 3-D se altera dramáticamente. El gen R lleva su RΛ PL propio promotor PRM que, a los efectos de este problema, PRT Zrev consideraremos constitutivo. El gen Zrev contiene la secuencia codificante de la ßgal de E.coli en orientación antisentido con respecto a su promotor: PL. Con este plásmido se transforman mutantes de E.coli con distintas características genotípicas, las cuales se detallan en la tabla. Completar con + o con "-", según si espera o no actividad enzimática. plás Actividad ß-gal mi30 ºC 42 ºC do s/IPTG c/IPTG s/IPTG c/IPTG I-P+O+Z+ Sí I+P-O+Z+ No I-P+O-Z+ Sí I+P+O-ZSí IsP+O+ZNo I-P+O+Z+/ I+P+O+Z- Sí Para aquellos casos en los que indicó que no hay actividad de ß-gal, indique además, para cada uno, si se debe a: I- inhibición de la transcripción II- inhibición de la traducción III- Producción de una ß-gal inactiva genotipo

genotipo
I-P+O+Z+ I+P-O+Z+ I-P+O-Z+ I+P+O-ZIsP+O+ZI-P+O+Z+/ I+P+O+Z-

plás mido
Si No Si Si No Si

Actividad ß-gal 30 ºC 42 ºC s/IP c/IP s/IP c/IP TG TG TG TG + + II I + + II - 30ºCIII/42ºCII 42ºC I + - 30ºCI/42ºCII*

R:
β galac- Permeasa tosidasa Genotipo +lac -lac -lac +lac I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+ + + I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ + + + I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ Y+ + Is P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+ + + + + I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ Y+ + I+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ +

* A 42ºC: sin IPTG no hay transcripción pues el represor se une al operador; con IPTG hay transcripción pero no hay traducción pues se transcribe Zrev.

2) La ribulosa bisfosfato carboxilasa (abreviada "rubisco") es una enzima localizada en el interior de los cloroplastos. Permite fijar CO2 en la síntesis de triosas en el estroma cloroplástico. Rubisco está formada por dos tipos de subunidades, la subunidad grande (LSU), codificada en el genoma del cloroplasto, y la subunidad chica (SSU), codificada en el genoma nuclear e importada desde el citoplasma. Ambas son ensambladas entre sí dentro del cloroplasto con ayuda de una chaperona. El estudio de la regulación de la expresión de los genes LSU y SSU despertó el interés de mu-

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chos investigadores. Con el objeto de encarar, en un futuro, la producción de plantas transgénicas con genes de resistencia a virosis reguladas por luz, se realizó el siguiente experimento: se tomó un fragmento de ADN ubicado entre -973 y -4 bp del gen de la SSU de papa (por convención, se denomina +1 al sitio de iniciación de la transcripción) y se ligó río arriba de la secuencia codificante del gen de origen bacteriano de la cloranfenicol acetil-transferasa (CAT). Con esta construcción se transformaron protoplastos (células desprovistas de pared) de hojas de tabaco y se las sometió a condiciones de luz u oscuridad. Luego de varias horas, se aisló ARN para analizar la expresión de CAT dentro de esos protoplastos, mediante northern blot usando como sonda el cDNA de CAT. Los resultados fueron: Luz Oscuridad Posteriormente se eliminaron los siguientes fragmentos del gen, y con cada una de las nuevas construcciones se transformaron protoplastos, se sometieron a las mismas condiciones y se aisló el ARN para hacer nuevos Northerns:
Sin eliminar Luz Osc.

una de las 2 construcciones se hizo un Northern, todo bajo las mismas condiciones que antes:

1)

luz oscuridad luz

2) oscuridad
d) De acuerdo a los resultados obtenidos, ¿Qué tipo de elemento regulatorio está contenido en la secuencia 973/-772 aislada del gen SSU? 3) Imagine que las sin-herculitis son una serie de enfermedades genéticas en humanos producidas por defectos recesivos en la expresión del gen de la herculina, una proteína asociada al desarrollo y tono muscular. La enfermedad no es mortal pero se caracteriza por una tendencia a la flaccidez y la pereza. Para analizar los distintos tipos de la enfermedad, se dispone de biopsias musculares de individuos sanos homocigotas, es decir no portadores (S) y de enfermos (homocigotas) (X1, X2 , ...), además de un mapa de restricción del gen de la herculina, un clon de cDNA de longitud completa y anticuerpos anti-herculina. Para comenzar se realiza una serie de experiencias de Southern (DNA genómico cortado con la enzima BamHI), northern y western blots que se muestran en la figura. Gen sano
E1 500 pb E2 200 pb BamHI E3 800 pb BamHI

(-90/-4) eliminado

Luz Osc.

(-973/-90) eliminado

Luz Osc.

(-972/-722) eliminado

Luz Osc.

BamHI

a) ¿Qué conclusiones se pueden sacar con respecto al papel de las secuencias de SSU manipuladas? b) ¿Qué conclusión se puede sacar del hecho de que los protoplastos fueran de tabaco y no de papa? 5 kpb c) ¿Podrían haberse usado protoplastos preparados a 4 kpb partir de raíces de tabaco?
1 kpb

1000 pb
S X1 X2 X3 X4 X5

4000 pb
S X1 X2 X3 X4 X5

1,5 kpb

1)

-973

SSU

-772

P nos Pnos

cat
Southern Northern
S X1 X2 X3 X4 X5

2)

-772

SSU

-973

cat
50 kDa

Finalmente, se realizó la siguiente construcción: el fragmento de -973/-722 de SSU se fusionó en los sentidos posibles río arriba del promotor (P) del gen nopalina sintetasa (nos), gen que se expresa en vegetales y que no está regulado por luz. Esta construcción se fusionó río arriba de la región codificante del gen CAT. Luego de transformar los protoplastos con cada

a) Interpretar los resultados caracterizando cada alelo mutante X1, X2, X3, X4 y X5.

Western

30

Dado que los pacientes X4 y X5 presentaban el mismo patrón de bandas en el Southern, en el northern y en el western, y con el fin de determinar si ambos pacientes presentaban la misma alteración, se realizó otro experimento que consistió en la construcción de plásmidos mediante fusión de: la zona 5' de un clon genómico de la herculina de individuos enfermos con un patrón tipo X4 y X5 (homocigotas) o de un individuo sano (S) + la parte codificante del gen de la gal. Luego se realizaron los siguientes experimentos de transfección: Línea celular Plásmido Activ. -gal Fibroblastos 3T3 p5’S / CAT --Fibroblastos 3T3 p5’X4 / CAT --Fibroblastos 3T3 p5’X5 / CAT --Mioblastos L6 p5’S/CAT +++ Mioblastos L6 p5’X4 / CAT +++ Mioblastos L6 p5’X5 / CAT --b) ¿Cómo explica los resultados del experimento de transfección? c) ¿Qué fenotipos tendrán individuos heterocigotas con genotipos S/X1, S/X4, S/X5 y X4/X5? d) Dibujar el resultado de Southerns (con enzima BamHI) de individuos que sean portadores sanos de los alelos recesivos X1, X2, X3 y X4. e) ¿En qué casos el polimorfismo de sitios de restricción con la enzima BamHI será útil para el diagnóstico prenatal de la enfermedad? f) Si se crea un ratón transgénico con una copia del gen humano sano completo y sabiendo que el gen sano de la herculina de ratón tiene el siguiente mapa de restricción para la enzima BamHI, dibujar los resultados de los Southern de ratones sanos (homocigotas) transgénicos y no transgénicos hibridizados con una sonda de herculina humana, a alta y baja sal.

a) ¿Qué conclusiones obtiene de los resultados de medición de actividad de luciferasa en las plantas transgénicas? b) ¿Qué controles agregaría al experimento con plantas transgénicas? El resultado sorprende al estudiante por lo que se decide a realizar experimentos para determinar qué secuencias en cis regulan la transcripción del gen. Para ello aísla los fragmentos –1263 a –877 y –525 a –226 y los marca en uno de los extremos 5’, los incuba con preparaciones de proteínas nucleares de plantas de tabaco cultivadas a distintas temperaturas, los trata con DNasa I y separa los fragmentos por electroforesis en gel de poliacrilamida. De este experimento de “footprinting” obtiene el siguiente autorradiograma:
Fragmento -1263 a –877
Extracto -

Fragmento –525 a –226
10°C 28°C

10°C 28°C Extracto -

BamHI

BamHI

BamHI

1800 pb

5000 pb

4) Un estudiante de doctorado está decidido a encontrar los factores que regulan la transcripción del gen OMEGA8 en plantas. Se sabe que los niveles de mRNA de OMEGA8 aumentan cuando se exponen las plantas de tabaco a baja temperatura, aunque la función real de OMEGA8 es desconocida. Para lograr su objetivo, el estudiante realiza una serie de construcciones génicas donde fusiona fragmentos de la región “5’ upstream” del gen OMEGA8 a la región codificante del gen de la luciferasa. Acto seguido introduce dichas construcciones por transformación en plantas de tabaco. Cuando obtiene las líneas transgénicas, analiza la respuesta del transgén a la temperatura y obtiene los siguientes resultados: Nota: bloque blanco = región 5’ “upstream” del gen OMEGA8, +1= sitio de iniciación de la transcripción, bloque negro = región que codifica para luciferasa.

Nota: la primera calle de cada gel corresponde a la incubación del fragmento de DNA correspondiente con la DNasa I, en ausencia de extracto nuclear. c) ¿Qué le sugiere el “footprinting”? d) En base a sus respuestas a) y c), haga un esquema de la región -1588/-1 indicando el rol de cada región e) ¿Qué otro experimento de “footprinting” haría para confirmar este modelo? f) ¿Por qué el estudiante hizo fusiones a la región codificante del gen de la luciferasa y no de la propia secuencia codificante del gen OMEGA8? 5) Un investigador está estudiando la expresión de una enzima hepática X la cual también se expresa en páncreas sólo en condiciones de stress oxidativo. Am-

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bas enzimas son estructural y bioquímicamente idénticas. El gen en cuestión tiene la siguiente estructura:
E1 E2 E3

Las flechas indican sitios de clivaje y poliadenilación. La región en gris es la región codificante. En primer lugar, realizó un nort- Hígado Páncreas hern blot con RNA extraido a CT S CT S partir de hígado y de páncreas de ratones control y ratones sometidos a stress: a) Esquematizar los mRNAs maduros que se expresan en hígado y en páncreas. b) ¿Cómo haría para confirmar su hipótesis? ¿Qué experimento realizaría para descartar que la diferencia de tamaño de los mensajeros se deba a splicing alternativo del transcripto primario? Interesado por la regulación de la expresión de esta proteína en páncreas el investigador clonó el promotor de la enzima X río arriba del gen de la luciferasa y transformó, con esta construcción, células de páncreas. Para su sorpresa, tanto las células sometidas a stress como las células control expresaron niveles similares y elevados del gen reportero. c) ¿Qué puede decir, hasta el momento, sobre la regulación de la expresión de la enzima X en páncreas? Sospechando que la secuencia perteneciente a la región 3´ UTR presente en el mensajero en páncreas, pero ausente en el hígado, podría estar relacionada con estos resultados, el investigador diseñó las siguientes construcciones: (P: promotor constitutivo)
1 P P Luc Luc

Cuando se expresa tTA se induce la transcripción del gen de interés dado que se une a las zonas regulatorias de pTetOp. El sistema tiene un paso más de regulación: En presencia de tetraciclina, tTA no se puede unir a pTetOp debido a un cambio en su conformación. Esta inhibición es reversible. Una vez removida la tetraciclina, tTA se puede unir a pTetOp. Se diseñaron ratones transgénicos con las siguientes construcciones:
PromTetOp Gen de interés PromTej. esp. tTA

2

3´UTR

Con estas construcciones transfectó células pancreáticas y las sometió a condiciones de stress o control durante 8 horas. Finalmente midió la actividad de luciferasa: Construcción 1 Construcción 2 Control 3000 400 Stress 3000 2000 d) ¿Qué puede decir del papel de la región 3´UTR en la regulación de la expresión de la enzima X? 7) Se desea desarrollar un mecanismo para expresar genes en el cerebro de ratón en un determinado momento de su vida. Para ello Chen y col. diseñaron una estrategia utilizando el sistema Tet off. El sistema funciona de la siguiente manera: el gen de interés se clona río abajo de un promotor (pTetOp) inducible por el factor de transcripción tTA. A su vez el gen tTA se clona río abajo de un promotor tejido específico. El mecanismo es el siguiente:

Línea 1 (pTetOp-luciferasa): Línea transgénica con una construcción que lleva el gen de la luciferasa río abajo de TetOp. Línea 2 (pEnolasa-tTA): Línea transgénica que lleva una construcción con el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias del gen de la Enolasa (pEnolasa). Línea 3 (pNestina-tTa): Línea transgénica con una construcción que lleva el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias del gen de la Nestina (pNestina). Línea 4 (pActina-tTA): Línea transgénica con una construcción que lleva el gen tTA río abajo de las zonas regulatorias del gen de la Actina (pActina). Se cruzaron los ratones pTetOp-luciferasa por cada una de las líneas fundadoras 2, 3 y 4. La F1 transgénica para ambas construcciones (corroborada mediante Southern blot) se utilizó para los ensayos de actividad de luciferasa en diferentes tejidos en ratones de 2 semanas de edad: ACTIVIDAD LUCIFERASA 2 semanas. Línea 1 F1 F1 F1 sola (1x2) (1x3) (1x4) Corteza 4 400 500 2300 Cerebro Estriado 3 90 1400 2000 Hígado 2 6 7 1900 corazón 3 7 6 2150 Nota: los números representan medidas arbitrarias relativas de actividad de luciferasa. a) Teniendo en cuenta los resultados de la tabla, ¿en qué se diferencia la regulación de los promotores analizados (pNestina, pEnolasa, pActina y pTetOp)? b) ¿Para qué sirve medir la actividad de luciferasa? c) Esquematizar los northern blots esperados para Nestina y Enolasa en estriado y en corteza de ratas salvajes de dos semanas de edad. (tamaño del mensajero de Nestina:1800 bases, tamaño del mensajero de Enolasa: 3200 bases). Se quiere utilizar este sistema de expresión (TetOptTA) para el desarrollo de una terapia contra una enfermedad neurodegenerativa. El objetivo es expresar una proteína neuroprotectora en el estriado de ratas sanas y enfermas en determinado momento de sus vidas y no en otro (NOTA: A las ratas se les puede dar de tomar agua con tetraciclina el tiempo que sea necesario y ésta llegar a todos los tejidos).

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d) ¿Bajo qué zonas regulatorias pondrías a la proteína neuroprotectora? ¿Qué línea transgénica utilizarías para hacer el experimento? ¿Cómo harías el experimento?

7. GENÉTICA DE POBLACIONES

Guía de Estudio: 1) a) En una población en equilibrio: ¿Cuál es la frecuencia de heterocigotas que puede haber?¿Cuál es la de homocigotas dominantes?¿Cuál es la de homocigotas recesivas? b) La invariabilidad de las frecuencias génicas de una generación a otra, implica que esté en equilibrio (de Hardy Weinberg) la población parental? c) La estructura genética de una población, ¿viene dada por sus frecuencias génicas o por las genotípicas? d) El conocimiento de las frecuencias génicas de una población, ¿implica conocimiento de su estructura genotípica? ¿Y si la población está en equilibrio H-W? R:a) Frecuencias heterocigotas H=2.p.q < 0.50 (si hay dos alelos), H = 1 - Σ pi (si hay más de dos alelos) Frecuencia homocigotas dominantes D=p2 Frecuencia de homocigotas recesivos R=q2 b) La invariabilidad de las frecuencias génicas de una generación a otra no implica que la población parental esté en equilibrio. La generación parental puede tener D, H, R ≠ p 2, 2pq, q 2, pero llega al equilibrio en una generación de panmixia. Para que hablemos de equilibrio deben mantenerse constantes las frecuencias génicas y genotípicas. c) La estructura genética de una población viene dada por sus frecuencias génicas y genotípicas. Si (D, H, R) ≠ (p 2, 2pq, q 2 ) puede deberse a que no hay panmixia, o que hay selección, deriva, mutación, etc., que afectan la estructura genética. d) El conocimiento de las frecuencias génicas de una población no implica el conocimiento de su estructura genotípica, a menos que la población esté en equilibrio de Hardy-Weinberg. 2) En el caso de loci ligados a cromosomas sexuales, ¿cuándo se considera que una población se encuentra en equilibrio? R:En estos casos, el sexo heterogamético presenta solo dos genotipos, y el homogamético tres. Por lo tanto podemos describir sus frecuencias genotípicas poblacionales de la siguiente manera:

AA Aa aa A a P H Q R S pBfB = frec. del alelo A en la población femenina qBfB = frec. del alelo a en la población femenina pBmB = frec. del alelo A en la población masculina qBmB = frec. del alelo a en la población masculina En este caso, 2/3 de los alelos totales de la población son transportados por el sexo homogamético y 1/3 por el sexo heterogamético. Las frecuencias génicas en cada uno de los sexos serán diferentes si la población no está en equilibrio. Siguiendo la nomenclatura asignada para cada uno de los genotipos, la frecuencia del alelo A en las hembras será igual a: pf = P + ½ H y en los machos pm = R En la población total será igual a: p = 2/3 pf + 1/3 pm Si las frecuencias en ambos sexos no son iguales en un comienzo, y se produce apareamiento aleatorio, las frecuencias irán oscilando en los dos sexos hasta alcanzar el equilibrio cuando: pf = pm = p Los machos obtienen sus genes ligados al sexo de la madre, por lo tanto: pm = pf de la generación anterior (identificada con el apóstrofe). Las hembras obtienen sus genes en igual proporción de los progenitores, por lo tanto, pf = ½ (pm + pf ) de la generación anterior En cada generación se reduce a la mitad la diferencia de las frecuencias génicas entre los dos sexos, lo que se desprende de la siguiente ecuación: pf - pm=½p’m+½p’f - p’f=½p’m - ½ p’f= - ½(p’m+p’f) Por lo tanto, el equilibrio no se alcanza en una sola generación de apareamiento aleatorio, sino en varias. Las frecuencias se van acercando asintóticamente al valor medio poblacional, momento en el cual se alcanza el equilibrio. 3) ¿Por qué, en teoría, la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en una población sino que solamente afectaría la distribución de alelos entre genotipos? R:La falta de panmixia no modifica las frecuencias génicas sino las genotípicas. Entonces, por la consanguinidad p y q no cambian. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias génicas conjuntas, sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La consanguinidad hará que los genes recesivos raros se presenten en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio en poblaciones de tamaño grande. Problemas: 1) Una condición anémica en el hombre llamada talasemia es determinada por un par de alelos codominantes. El genotipo homocigótico dominante TmTm produce una anemia grave (talasemia mayor) y el genotipo heterocigótico TmTn produce una anemia benigna (talasemia menor). Los individuos normales son homocigóticos TnTn. Se encontró que la distribución de esta enfermedad en una muestra de una población italiana era de 4 con talasemia mayor, 400 con talasemia

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menor y 9596 normales. Indique si esta muestra está de acuerdo con los valores indicados según el equilibrio de Hardy-Weinberg dentro de límites estadísticos aceptables. 2) Cierta planta presenta flores azules, celestes y blancas y se sabe que esos tres colores están determinados por un locus bialélico de dominancia incompleta. Un ecólogo vegetal encuentra una población de esta planta y considera que pueden reconocerse dos subpoblaciones. Desea entonces averiguar si cada una de ellas se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg y qué sucede con la población total. Si partió de los siguientes datos ¿A qué conclusión llegó? Azul Celeste Blanco Total Subpoblación I 164 32 4 200 Subpoblación II 20 80 100 200 Total 184 112 104 400 3) Los grupos sanguíneos humanos (AB0) están determinados por un sistema de alelos múltiples en el que existen relaciones de codominancia y dominancia (según la interacción). La jerarquía de dominancia de estos tres alelos es: IA = IB > i. En una muestra de una población humana se encontraron 23 individuos del grupo AB, 441 del grupo “0”, 371 del grupo B y 65 del grupo A. a) Calcule las frecuencias alélicas de IA, IB e i. b) Calcule el porcentaje de la población que se espera que sea de los grupos A, B, AB y 0 si las frecuencias génicas fueran: IA = 0,36, IB = 0,20 e i= 0,44. 4) Al analizar, en una población de mamíferos, un carácter monogénico con ligamiento total al cromosoma X, se encontró que la frecuencia del gen dominante en las hembras es 0,8, mientras que el 30 % de los machos son recesivos. ¿Qué frecuencias génicas aparecerán en cada sexo en la 3ra generación a partir de la citada? ¿Hacia qué valor tienden dichas frecuencias al cabo de un gran número de generaciones? 5) La enzima 6-glicerol fosfato deshidrogenasa presenta, en algunos lepidópetros, distintas formas, diferenciables en una corrida electroforética., donde cada banda depende de la presencia de un alelo diferente para el locus autosómico 6-Gpd. Los alelos más comunes son el F y el S. Se inician 4 poblaciones experimentales. En la tabla se muestra el número de individuos de cada genotipo para cada sexo y en cada población. Machos Hembras FF FS SS FF FS SS POBLACION 1 48 84 18 18 84 98 POBLACION 2 24 24 72 24 24 72 POBLACION 3 9 42 49 9 42 49 POBLACION 4 20 20 60 9 42 49 Suponiendo que a partir de estas poblaciones se dan las condiciones de equilibrio de Hardy-Weinberg: a) ¿Cuáles se inician con frecuencias de equilibrio? b) ¿Cuáles serán las frecuencias génicas y genotípicas de equilibrio en las poblaciones que no ofrecen diferenciación sexual en las frecuencias génicas? c) ¿Cuántas generaciones tardarán en alcanzarlo?

6) En un acuario se mantienen numerosos ejemplares de Rana pipiens. Se estudiaron los individuos para el locus isoenzimático dialélico esterasa, encontrándose el número de individuos de cada genotipo en estado de renacuajo y adulto que se indican en la figura. a) Calcule las frecuencias alélicas de este locus en la población y diga si está en equilibrio tanto en el estado de renacuajo como en el de adulto. b) Compare la supervivencia larva adulto de los tres genotipos. RENACUAJOS

EST
N°de indiv. observados

1272 ADULTOS

652

76

N°de indiv. observados

1032

508

60

El becario que cuida las ranas para su tesis descubre un nuevo producto para mantener el pH del acuario, a mitad de precio del que venía utilizando habitualmente. Después de cierto tiempo de utilizar este producto se da cuenta que aparcen en el acuario varios individuos muertos y hace de nue-vo el estudio anterior, 1440 520 40 encontrándoRENACUAJOS se los siguientes datos:

EST

+

N°de indiv. observados

1008

364 ADULTOS

8

c) Calcule las frecuencias alélicas de este locus en esta población y diga si están en equilibrio tanto en estado larvario como adulto. d) Compare la supervivencia larva-adulto de los tres genotipos. e) El producto nuevo utilizado afecta diferencialmente algún genotipo? ¿Por qué?.

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7) Un señor muy enfermo que estaba redactando su testamento, deseaba saber si él era verdaderamente el padre biológico del segundo hijo de su anterior esposa, que, a pesar de su duda, llevaba su apellido. Sus abogados le recomendaron que realizara las pruebas genéticas de filiación. En un prestigioso laboratorio se tomaron entonces las muestras de sangre del hijo y de ambos padres. Se extrajo ADN genómico. Mediante PCR y a partir de primers adecuados se amplificaron 8 regiones de microsatélites altamente variables del ADN (loci), con el fin de determinar el índice de paternidad. A continuación se muestran los esquemas de los patrones electroforéticos de bandas obtenidos al correr en geles de poliacrilamida los productos de amplificación obtenidos para cada locus. P= padre, H= hijo y M= madre. A los costados se indican los alelos que difieren en el tamaño del fragmento. En la tabla se indican las frecuencias poblacionales de estos alelos.

P H

M P H M P H M __ 117 __ __ 157 __ __ 195 __ 155 __ 193 __ __ 113 __ 153 __ __ 111 __ __ 149 __ __ __ 179

Locus 2 Locus 3 Locus 4 P H M P H M P H M __ 166 __ 205 __ __ 104 __ __ 199 __ __ __ 156 __ 195 __ __ 88 __ __ 185 Locus 5 Locus 6 Locus 7 P H M __ __ __ __ __ __ Locus 9 232 214 184 182 P H M __ __ 115 __ __ __ 109 Locus 8

Frecuencias alélicas: Locus 2: 117= 0.18; 113= 0.16; 111= 0.1 Locus 3: 149= 0.01; 153= 0.32; 155= 0.1; 157=0.16 Locus 4: 179= 0.16; 193= 0.09; 195= 0.01 Locus 5: 156= 0.65; 166= 0.05.Locus 6: 185= 0.025; 195= 0.05; 199= 0.25; 205=0.13. Locus 7: 88= 0.58; 104= 0.28 Locus 8: 109= 0.3; 115= 0.16 Locus 9: 182= 0.13; 184= 0.29; 214= 0.01; 232= 0.01. A partir de estos datos calcule el índice de paternidad para cada locus (razón de verosimilitud hijo/ no hijo). y el valor acumulado para todos los loci.

8.- MUTACIONES
Guia de estudio 1) Explique los conceptos siguientes:

- mutación inducida - mutación espontánea - clastógeno - mutación somática - mutación germinal - mutación letal - mutación condicional - mutación polar - reversión R: clastógenos son mutágenos que producen ruptura cromosómica. Son en general físicos (Radiación X, por ejemplo) y no son detectables por el test de Ames. Se requiere de ensayos cromosómicos (como el intercambio de cromátides hermanas) para ser detectados. 2) Indique las formas más habituales de expresar la probabilidad de que ocurra una mutación. 3) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxótrofos. ¿Cómo se puede demostrar que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo? 4) Defina los siguientes conceptos y dé ejemplos: - transición (los 4 casos posibles) - transversión (los 8 casos posibles) - mutación silenciosa - mutación neutra - mutación por corrimiento del marco del lectura (o "frame-shift") - mutación por sustitución "missense" - mutación por sustitución "nonsense" - mutación supresora intragénica - mutación supresora extragénica 5) Diferencie los siguientes mecanismos de mutación espontánea: - errores en la replicación del ADN. - lesiones espontáneas 6) Con relación a los errores en la replicación del ADN, ¿con qué base se aparean por puentes de hidrógeno los siguientes nucleótidos: - la forma imino de C? - la forma enol de T? - la forma imino de A? - la forma enol de G? 7) Indique dos tipos de lesiones espontáneas que, de no ser reparadas, pueden generar mutaciones. 8) Explique la causa por la cual las posiciones de 5metilcitosina constituyen "hotspots" para transiciones C → T G → A. ¿Cuál es la función de la uracil-DNA glicosidasa? ¿Cuán específica es la uracil-DNA glicosidasa? ¿Por qué no sería ventajoso para una célula tener uracilo como constituyente normal en su DNA? ¿Qué significado evolutivo tiene el hecho de que en eucariotas las zonas no codificantes tienen una mayor cantidad de A-T que las codificantes? 9) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxótrofos. ¿Cómo se puede demostrar que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo?

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10) Hermenigildito, el hijo de Eulalia y Casimiro, hervía de fiebre y diarrea. El doctor, al observar al infante y sabiendo que muchos tratamientos habían sido ineficaces para controlar esta salmonelosis en otros pacientes, recetó un cóctel con un antibiótico tradicional derivado de la penicilina: ampicilina y otro antibiótico sintético de última generación llamado bacterminator III del prestigioso laboratorio BioTruch S.R.L. (Sociedad de Responsabilidad muy Limitada). Después de una breve mejoría, el párvulo volvió a recaer y el prestigioso médico dictaminó: las bacterias se volvieron resistentes al nuevo antibiótico, no es la primera vez que veo que ciertos antibióticos inducen resistencia. Gumersindo, despierto hermano de la víctima, contestó prontamente: - pero Doctor a mí me enseñaron en Genética I que todas las mutaciones son preadaptativas. Los demás pusieron cara de no entender (o mejor dicho, no entendieron un pepino). - los agentes selectivos como los antibióticos no inducen la resistencia, la seleccionan, algunas de las bacterias ya eran resistentes antes de que Ud. administrara los antibióticos. Ante la cara de incredulidad de todos los presentes, Gumersindo tuvo que aclarar. a) ¿Qué pudo haber dicho el enigmático Gúmer? Después de la explicación, el médico no quedó muy convencido y le dijo: ¿Cómo puede haber resistencias preexistentes a antibióticos con los que estas bacterias jamás tuvieron contacto previo? Demuéstremelo. Gúmer llevó, entonces, al doctor a la FCEyN y preparó unos menjunjes para cultivar bacterias y le pidió al matasanos aislamientos de bacterias de distintos intestinillos tratados y no tratadas con el nuevo antibiótico. b) ¿Qué experimento reprodujo Gúmer para convencer al terco galeno? Obviamente, Gúmer utilizó para su demostración bacterias de pacientes que no fueron tratados previamente con el antibiótico ¿por qué? c) Gúmer aprovechó los distintos aislamientos para estudiar la razón por la que estas bacterias eran resistentes a tantos fármacos distintos. Él vio que la frecuencia de aparición de colonias resistentes a bacterminator era de 10-2 y mientras que para la ampicilina (y otros antibióticos), los valores eran de 10-9. ¿Qué concluyó Gúmer de estos resultados? Cuando buscó evaluar colonias simultáneamente resistentes a bacterminator y ampicilina, se gastó todas las cajas de Petri de la facultad para encontrar apenas una colonia. Con cifras tan bajas era muy difícil explicar lo que le había pasado a su hermanito. Sin embargo, hasta ese momento, sólo había estudiado la guía de problemas de Mutaciones. Cuando llegó a la de genética bacteriana se le prendió la lamparita. Se puso a hacer experimentos con el aislamiento de su hermanito (a esa altura, Gúmer sufría de una terrible fiebre, hacía frecuentes visitas al baño y enflaquecía aceleradamente, vaya a saber porqué motivos). Cuando puso en contacto células del aislamiento con una cepa de E.

coli Amp- Bac-, en cuestión de minutos fue capaz de aislar colonias de E. coli resistentes a ambos antibióticos con altísimas frecuencias. Sin embargo, Escherichia y Salmonella claramente pertenecen a especies (y géneros) distintos. Gúmer no lo pudo explicar porque está en cama y estudiando Genética para el parcial. d) ¿Podrá Ud.? R: a) No existen mecanismos por los cuales los antibióticos puedan modificar el ADN y los genes, sólo lo pueden hacer los mutágenos pero de una manera inespecífica (no dirigida a un gen en particular) y no es el caso de los antibióticos. Lo que ocurre es que las poblaciones bacterianas se cuentan por miles de millones, lo que hace que un evento improbable (una mutación al azar en algún lugar muy preciso de algún gen) se vea representada en una o en unas pocas células. Como todas se mueren salvo esos raros mutantes, se tarda un tiempo hasta que estas pocas células alcanzan un número importante (breve mejoría hasta la recaída). b) Hizo réplicas de placas de Petri sembradas con una suspensión conteniendo numerosas bacterias y que contenían el antibiótico y le mostró al médico que el número y la distribución de las colonias resistentes fue idéntica en todas las réplicas, lo que sólo es posible si las células que originaron dichas colonias ya eran resistentes ANTES de la colocación del antibiótico. Si hubiesen sido inducidas por el antibiótico, no existiría ninguna razón para que seleccionara el mismo número y en la misma ubicación en repetidas ocasiones. c) Que el antibiótico puede ser neutralizado por varios mecanismos de acción diferentes: por una mutación en un “hot spot” (nucleótido con una frecuencia de mutación muy superior al resto), por un aumento en el nivel de expresión del promotor que controla la cantidad de la proteína afectada, diluyendo el efecto del antibiótico; por transposición del gen que codifica para la proteína blanco a un plásmido de alto número de copias, aumentando su expresión, modificación de enzimas con leves cambios (varios cambios diferentes alcanzan para la resistencia), por efecto de varias mutaciones distintas independientes entre sí (lo que es lo mismo), etc. d) La conjugación no suele reconocer barreras de especies. Además, como lo que se suelen transferir son plásmidos (donde suelen ubicarse los genes de resistencia a antibióticos), ni siquiera se requiere de que los genomas de las bacterias conjugantes tengan homología muy grande entre sí ya que los mismos no se transfieren. La transferencia horizontal de plásmidos que combinan varios genes de resistencia a antibióticos es un conocido mecanismo de apilamiento y dispersión de dichos genes en varias especies de bacterias patogénicas. 11) Además de permitir el estudio del proceso mismo de mutación, las mutaciones pueden ser útiles en algunos casos. Dé ejemplos de esos casos. 12) ¿Por qué hay que preocuparse por el agujero de ozono? Explique.

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13) ¿Qué procedimiento y sistema selectivo se le ocurren a Ud. para obtener plantas resistentes a una sustancia tóxica? R: Desde los años 70 se sabe que las plantas que regeneran in vitro en ciertas condiciones son propensas a sufrir mutaciones aunque algunos autores opinan que las mutaciones pueden producirse previamente, en las células somáticas que originan el explante (tejido vegetal del cual se parte para iniciar el cultivo de tejidos). Este fenómeno de mutagénesis por cultivo de tejidos es conocido en la literatura como variación somaclonal (variación por mutación y somaclonal porque las plantas se derivan clonalmente de células somáticas por regeneración in vitro). El cultivo de tejidos in vitro ofrece varias de las ventajas que tiene el manejo de microorganismos, fundamentalmente, la posibilidad de seleccionar en frascos aplicando un agente selectivo al medio de cultivo, por ejemplo, un antibiótico (que es una sustancia tóxica). La frecuencia de variación somaclonal puede ser incrementada por el agregado de mutágenos al medio. 14) Explique el modo de acción de los siguientes mutágenos y el tipo de mutación (a nivel molecular) que producen: - los análogos de bases (ej., el 5-bromouracilo) - los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej., etilmetanosulfato y nitrosoguanidina) - aflatoxina B1 - los agentes intercalantes (ej., proflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio) R: el 5-bromouracilo es un análogo de T pero forma, con mucha mayor frecuencia que ésta un tautómero, que en su forma enólica adquiere propiedades de apareamiento como las de C. - etilmetanosulfato y nitrosoguanidina son capaces de conferir alquilos a nucleótidos, preferencialmente G, confiriéndole propiedades de apareamiento iguales a las de A. - la Aflatoxina B1 producida por el hongo Fusarium, está muy frecuentemente presente en alimentos (cereales, maníes,etc.) y es un modificador de bases muy especial, que forma un derivado de G, el cual es eliminado enzimáticamente, generando un sitio apurínico. (Los sitios apurínicos pueden inducir un mecanismo de reparación imperfecto, introduciendo una A enfrente de esos sitios.) - Los agentes intercalantes se ubican entre bases obligando a la polimerasa a producir inserciones o deleciones. 15) Mencione los mecanismos biológicos de naturaleza enzimática más importantes en la reparación del ADN dañado. 16) Explique en qué consiste el “test de Ames”. ¿Por qué se usan varias cepas mutantes de Salmonella? 17) ¿Cuáles son las diferencias entre mutaciones somáticas y germinales? ¿y entre mutágenos y oncógenos o cancerígenos? R: mutaciones somáticas son aquellas que se producen en células pertenecientes a tejidos no reproducti-

vos y NO son heredables por línea germinal. Pueden, o no, conducir a un cáncer (lo más frecuente es que la mutación sea neutra o silenciosa y, en caso de afectar algún gen, disminuya la funcionalidad celular o lleve a la muerte de la célula). Mutaciones germinales son aquellas que afectan las células de la línea germinal y que darán origen a las gametas. Como no hay cáncer de gametas (aunque sí lo puede haber del tejido somático que las alberga –ovarios, testículos-), no se puede afirmar que sean cancerígenas aunque afecten específicamente a un protooncogén. Mutágeno es cualquier agente químico o físico que induzca o aumente la frecuencia de mutaciones en el ADN o el ARN. Oncógeno es aquel que lo hace en determinadas células somáticas afectando a oncogenes y que pueden derivar en el desarrollo de un proceso tumoral (el cual suele requerir de más de un oncogén para producirse, además de fallas en los sistemas de defensa). No todos los mutágenos son oncógenos ni todos los oncógenos son mutágenos porque hay compuestos que se metabolizan formando otros compuestos que sí son mutagénicos en determinadas condiciones específicas que sólo se producen en determinados tejidos u órganos. 18) ¿Qué es un oncogén y un protooncogén? ¿Recuerda el c-myc en el linfoma de Burkitt? R: Protooncogén es todo gen que, por mutación del gen o de ADN circundante, es capaz de convertirse en un oncogén. Pueden ser genes codificantes para hormonas de crecimiento o división celular, factores de transcripción, telomerasas, etc. El c-myc es el oncogén que se induce extemporariamente en linfocitos por efecto de posición del enhancer de un gen de inmunoglobulinas que se localiza cercanamente debido a una traslocación recíproca. Es un caso en que no necesariamente muta el oncogén, sino que lo hace el ADN circundante (efecto de posición). 19) ¿Cuál es la base molecular de la teoría mutacional del cáncer?¿Existen otras teorías?¿Se contagia el cáncer?¿Se hereda? R: Ver punto anterior. La teoría viral, particularmente la retroviral, que tuvo su auge en los ´70-´80, se basa en la transducción por parte de un virus de un oncogén celular (por ej. el c-myc pasa al virus de la leucemia aviar, pasando a llamarse v-myc) transmitiendo infecciosamente. Este mecanismo demostró ser de escasa o nula importancia en humanos. Por lo tanto, no se contagia en humanos (aunque sí entre algunos animales). Un cáncer es un fenómeno muy complejo que involucra usualmente la interacción de varios genes. Se puede heredar la predisposición heredando alguna mutación en algún protooncogén en la línea germinal, pero definitivamente no se puede heredar una mutación somática. Es decir, una persona que tuvo o tiene un cáncer particular no transmite, a priori, la enfermedad a sus hijos porque las mutaciones determinantes son mutaciones somáticas. 20) ¿Qué métodos se utilizan para evaluar oncogenicidad específica de órgano?¿Por qué no es suficiente con métodos como el test de Ames?

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R: A veces, el agente inductor no es de por sí mutagénico sino que es metabolizado por alguna enzima celular específica en condiciones específicas de pH, por ejemplo, para producir un mutágeno/oncógeno. Para investigar el potencial mutagénico de este tipo de compuestos en los que el agente es un subproducto metabólico, el test de Ames puede ser adecuado convenientemente mediante el agregado de extractos celulares de los tejidos/órganos que se desea detectar, se trata de un sistema bactetiano que guarda diferencias con el de los humanos. Debido a esto, se desarrollaron en los últimos años varios modelos murinos transgénicos. Por ej. el MutaMouse® es un sistema que se basa en un ratón transgénico que contiene unas 40 copias repetidas en tándem del genoma completo de un vector común en ingeniería genética (el λ gt10) el cual, a su vez, tiene una copia funcional del gen de la β-galactosidasa del operón lac. Al extraer DNA total del ratón y mezclarlo con un extracto de empaquetamiento, estas copias del genoma de λ se encapsidan y pueden infectar células de E. coli (lac-) y expresarse generando placas azules en presencia de IPTG y Xgal. Si se recuperan placas translúcidas, se atribuye a mutación y puede ser verificada por secuenciación del clon. La relación entre placas blancas y las totales genera un coeficiente que se denomina frecuencia de mutación.

posible mutágeno o carcinógeno extracción de DNA de órganos Problemas:
1) Se está estudiando un gen de E. coli que especifica cierta proteína. Una parte de la secuencia de la misma es ala-pro-trp-ser-glu-lys-cys-his. Se obtuvo una serie de mutantes de este gen que no mostraban actividad enzimática. Aislando los productos enzimáticos mutantes se encontraron las siguientes secuencias: Mutante 1: ala-pro-trp-arg-glu-lys-cys-his Mutante 2: ala-pro Mutante 3: ala-pro-gly-val-lys-asn-cys-his a) ¿Cuál es la base molecular más probable de cada mutación? b) ¿Cuál es la secuencia de ADN más probable que especifica esta parte de la proteína? Utilice el código genético. 2) Un hombre (H.S.), empleado durante varios años en la planta nuclear de Springfield, se convierte en padre de un varón hemofílico (B.S.), el primer caso en el árbol genealógico tanto suyo como de su esposa (M.S.). Otro trabajador de la misma planta durante varios años tiene un hijo enano acondroplásico, también el primer caso en su familia y en la de su esposa. Los dos compañeros de trabajo demandan a su empleador (Mr. M.B.). Como genetista, lo llaman a Ud.

a declarar en el juicio. ¿Qué diría Ud. en relación a cada situación? Aclaraciones: - la hemofilia es recesiva ligada al cromosoma X. - la acondroplasia es autosómica dominante. 3) El mutágeno etilmetano sulfonato (EMS), que se utiliza mucho en mejoramiento vegetal, induce transiciones G-C → A-T. La aflatoxina B1, micotoxina que frecuentemente contamina alimentos, induce transversiones G-C → T-A. Diga si cada mutágeno es capaz de revertir codones ámbar (UAG) y ocre (UAA) tipo salvaje. 4) Una mutante de E. coli defectuosa en el sistema de reparación SOS es resistente a la mutagénesis por luz UV. Por otro lado, células de piel de un paciente que padece xeroderma pigmentosum (deficiencia de una de las enzimas reparadoras por escisión) son extremadamente propensas a morir (y desarrollar tumores) por exposición al sol. Intente explicar la aparente contradicción. 5) Ud. fue nombrado Jefe del Laboratorio de Bromatología (Ministerio de Salud y Acción Social), encargado de otorgar permisos para la venta de nuevos productos alimenticios que se desean lanzar al mercado, luego de constatar su inocuidad. Ud. recibe, de manos de una empresa productora de alimentos, una muestra de un nuevo edulcorante artificial para analizar, junto con un placas totales vs placas blancas proyecto de una impresionante campaña publicitaria planeada, y además un inesperado cheque. Para realizar los análisis, Ud. dispone de un cepario de Salmonella con 5 auxótrofos que no pueden sintetizar histidina, que se comportan frente a 3 mutágenos así: frecuencia de reversión his- → his+
mutantes hisespontánea 5-Br-U aflatoxi- Bromuro de na etidio

1 0 0 0 0 2 10-8 10-5 10-8 10-8 -8 -8 -5 3 10 10 10 10-8 -8 -8 -8 4 10 10 10 10-5 -5 -5 -5 5 10 10 10 10-5 a) ¿Qué mutantes eligiría para usar en el test de Ames con el objeto de evaluar la potencial mutagenicidad del nuevo edulcorante? b) Si la mezcla de las mutantes elegidas + muestra a analizar + extracto hepático produce crecimiento bacteriano en ausencia de histidina exógena (1 colonia de cada 10.000 bacterias plaqueadas), otorgaría Ud. el permiso para la venta libre del edulcorante? 6) La 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolina (IQ) es una amina heterocíclica aromática que se podría formar durante la cocción de ciertas comidas. Como algunos compuestos de esta familia son genotóxicos, se

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decidió inv vestigarla. P Primero se utilizó el te de est Ames, con resultados n negativos. Si embargo se dein mostró in v vitro que, en presencia de citocromo P450 e se produce una N-oxi idación a 2-(hidroxiami ino)-3metilimidaz [4,5-f] qu zo uinolina, la c cual reaccion con na el DNA for rmando N-(d deoxiguanosi in-8-il)-2-am mino-3metil-imida azo[4,5-f]quin nolina (dG-C C8-IQ). La reversión de mu utaciones por test de Am de este último r mes compuesto (a diferencia del precur a rsor) mostró mutaciones de cambio de lectura de una o dos pares G:C. a Cuando se e ensayó con e sistema M el Muramouse® se obtuvieron los siguientes v s valores (* = diferencia. s significativa respe al contro ecto ol): ÓrganoTrat tamiento total placas Mu utantes FMx10–5 Hígado Con ntrol 1 70 030 01 47 2.8±1.1 1x20 mg/kg 1 41 460 0 15 72 5.1±2.3* 5x20 mg/kg 2 71 226 0 10 349 12.9± ±6.2* Colon Con ntrol 1 29 750 99 35 2.7±1.2 1x20 mg/kg 1 22 900 0 23 68 5.6±3.5* 5x20 mg/kg 1 31 970 0 16 97 7.4±1.4* Riñón Con ntrol 1 54 100 40 51 3.3±1.3 1x20 mg/kg 1 52 600 0 23 71 4.7±2.1 5x20 mg/kg 1 61 830 0 11 95 5.9±0.8* a) ¿Por qué el control (a que se le in al nyectó agua) da ) valores posi itivos en los 3 órganos an nalizados? b) Hipotetic por qué lo resultados son diferentes en ce os diferentes ó órganos c) A la luz d estos resu de ultados ¿Cons sidera Ud qu la ue IQ produce una respuest mutagénic generaliza o ta ca ada específica d tejido? de Para estudia si el mecan ar nismo de acc ción tiene alg que go ver con el h hipotetizado, se secuencia aron todas las placas blancas derivadas de DNA de hí e ígado y se tab bularon los porc centajes relat tivos de tipo de mutación en n los controle y en las tra es atadas con IQ (recordar q se Q que trata de porc centajes rela ativos y que s IQ produce en si e, algún caso a algún porcen ntaje menor a control, es no al so significa qu haya gener ue rado un núm mero absoluto meo nor de placa blancas qu el control) as ue ) Control IQ Tipo mutaci ión Transición GC AT G 38% 1 15% AT GC A 9% 1% Transversió ón GC TA G 25% 5 52% GC CG G 16% 7% AT TA A 3% 4% Cambio de marco +1 + 6% 1% Cambio de marco –1 – 3% 19% 1 Deleción 2 pb 0% 1% d) ¿Detecta Ud algún tip de mecan po nismo prefere encial? ¿Cuál? e) Todo lo anterior resultó importa ante para la detección de mu utaciones som máticas (com las oncog mo génicas o carcinogé énicas) ¿Le parece que los ratones transgénicos tam mbién podrían servir para estudiar mu n a utaciones germina ales? ¿Qué t tejido se le o ocurre que s sería el más apropia para estu ado udiar este asp pecto?

10.- TRAN NSPOSONE ES
1) Explique la siguiente terminologí e ía

- secuencias de inserción n - transposon nes - repeticione invertidas es Secuencias de inserción: traducción de “insert e n tion seq quences” o I que fuer descubiertas como ta IS, ron ales en genomas ba acterianos, de allí su nom e mbre. Son tra ansposones simple autónomo ya que co es, os, odifican para las a enz zimas que p permiten su t transposición (una trans n sposas En sus extremos co sa). ontienen secu uencias inve ertidas repetidas (casi idéntica que son reconocidas por as), r la transposasa. Cuando se i insertan en el genoma hu e uésped, se produc pequeña repeticione (direct re cen as es epeats a cada lado del transpo s) o osón. Tr ransposones: son fragme entos discreto de ADN q os que tienen la capac cidad de mo overse a otro sitios del geos noma. Contrar riamente a lo que ocurre con plásmidos o e y fagos, su mo f ovimiento se restringe al genoma hu e l uésped. Re epeticiones i invertidas: “inverted re epeats”, los extre emos de los transposone se caracte es erizan por te ener sec cuencias sim milares (de allí repeticion nes) en orien ntació invertida l de un extr ón la remo respecto de la del ot o tro. 2) Explique, a nivel molec cular, la form de chupe ma etín observada al microscopio electrónico adoptada por o o cad denas simple de DNA q contiene transposon es que en nes, lue de desna ego aturalización y lenta renat turalización. R: Cuando sec cuencias con nteniendo tra ansposones son desnaturalizada y renatura as alizadas, los extremos re epetid invertido pueden rea dos os accionar en forma intram molec cular, forman una estru ndo uctura doble cadena. Co e omo la transposasa no tiene regi iones repetid se mantiene das, com ADN de simple cad mo e dena. Los ex xtremos inve ertidos forman la b base de la es structura de chupetín, mi c ientra que la tran as nsposasa form el cuerpo de la misma ma a. 3) ¿Cómo se c cree que han evolucionad las bacter n do rias ue esistentes a v varios antibió óticos al mis smo qu hoy son re tiempo? R: Existen tra ansposones c compuestos, que llevan secuencias del h huésped. Un ejemplo so aquellos f on forma ados por dos IS. Dos IS c cercanos pue eden comport tarse como un ún nico transpos y llevar consigo las sesón los sos, cuencias que l separan. En algunos de estos cas alg gunas de las IS perdió la capacidad de transposic d ción y todo se trans t spone como u unidad. En otros cas una sos, am mbas IS son funcionales pero con una frecuen s, ncia baj suelen tra ja ansponer en conjunto, lle evando cons sigo las secuencias que los sep s paran. Si bien estos even n ntos son de baja fre n ecuencia, cu uando las sec cuencias que se e tra ansponen lle evan resiste encia a anti ibióticos, es stos eventos son se eleccionados y aparecen con más f s n frecuencia. Los tr ransposones no se transfi fieren entre b bacter rias, pero sí lo hacen los plásmidos en los que p s e pueden insertarse los transposo n ones; de ahí que la mayo oría de las bacteria con multiresistencias lleven las m as misma en plásmid as dos. 4) Marque las diferencias entre los mecanismos no s s m rep plicativo y replicativo de transposici e ión. ¿Qué en nzima participan? as

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R: En el mecanismo no replicativo, el transposón se mueve de un lugar a otro del genoma, sin dejar una copia en el sitio dador. En el mecanismo replicativo, se genera una nueva copia en el sitio de transposición. En ambos casos actúa una transposasa, que unida a los extremos del transposón, es la encargada de clivar una cadena del sitio dador y una del aceptor y ligarlas en forma cruzada, por un mecanismo que tiene similitudes con las topoisomerasas. Las estructuras que se forman tienen similitud con las orquillas de replicación. Si dichas horquillas son sustrato para la maquinaria de síntesis de ADN, entonces habrá una duplicación del transposón, se formará un cointegrado y esté será resuelto por una recombinación homóloga, catalizada por una resolvasa, también codificada por el transposón. Si las horquillas no son sustrato para la síntesis de ADN, entonces se produce un segundo corte y ligación en el sitio aceptor, pero el sitio dador no se reconstituye, por lo que el “salto” del transposón produce una rotura del ADN en dicho sitio. 5) ¿Qué evidencias experimentales demuestran que en algunos casos la transposición ocurre a través de un RNA intermediario? R: En muchos transposones se encuentran “huellas” del procesamiento del mRNA, como ser uniones exón-exón precisas, colas de poli A y extremos 5’ que coinciden con el inicio de la transcripción 6) ¿Qué analogía tienen los retrovirus con los transposones? R: Los retrovirus también tienen extremos repetidos y se insertan en el genoma del huésped. 7) ¿Qué son y cómo funcionan los elementos controladores en maíz? R: Los elementos controladores de maíz también son transposones. Se los denominó originalmente “controlling elements”. Existen varias familias en el genoma del maíz. Dentro de cada familia se los puede clasificar en autónomos y no autónomos. Los primeros pueden transponer por sí mismos, mientras que los segundos perdieron la actividad transposasa, por mutación o deleción, y son estables a menos que actúe en “trans” una transposasa de un elemento autónomo de la misma familia. 8) ¿Qué son los elementos P de Drosophila? R: Los elementos P de Drosophila también son transposones, que se encuentran en las cepas P. Estos transposones se activan cuando se cruzan machos P por hembras M. La activación del transposón produce lo que conocemos como disgénesis del híbrido, ya que la transposición continuada en la línea germinal produce esterilidad en los híbridos de dicha cruza. El cruzamiento opuesto no produce disgénesis y eso ocurre por un efecto materno en las líneas P, que reprime la transposición. La transposición sólo ocurre en la línea germinal. La explicación molecular de dichos eventos radica en que el transposón codifica para dos productos de “splicing alternativo” que difieren en la inclusión o no del intrón “3”. Cuando el “intrón” se incluye, el producto de 66 kDa es un represor de la trans-

posición, mientras que cuando el intrón no se incluye, el producto es la transposasa de 87 kDa. En la línea germinal se produce el evento de “splicing” que elimina el intrón 3 y se produce la transposasa activa. El efecto materno se explica por la presencia del represor en la línea germinal. 9) ¿Cómo se supone que surgieron los pseudogenes? R: En algunos casos, los pseudogenes “procesados” se originaron de secuencias de ARN que fueron retrotranscriptas. Si bien no contienen información necesaria para su transposición, pueden haber sido sustrato para un sistema de retrotransposones. En general este tipo de pseudogenes se encuentra en porciones del genoma no relacionadas con la del locus que les dio origen. En otros casos, los pseudogenes aparecieron por duplicación de los genes originales, seguida de una pérdida de la capacidad de expresarse de una de las copias. En este último caso no hay ARN intermediario, la estructura del pseudogen no revela huellas de procesamiento de ARN.

Problemas
1) En 1938, Marcus Rhoades analizó genéticamente el maíz negro (pigmentado) mexicano. De la autopolinización de una variedad totalmente pigmentada, surgió una progenie con los siguientes fenotipos: 12/16: granos totalmente pigmentados 3/16: granos blancos con manchas pigmentadas 1/16: granos blancos Estos resultados fueron confirmados por su contemporánea Barbara McClintock quien, profundizando sobre el tema, logró interpretar agudamente sus observaciones citogenéticas, lanzando, en los '50s, una teoría muy resistida en su momento sobre genes "móviles". Tres décadas más tarde, la Genética Molecular permitió la interpretación de esos datos, al identificar un gen dominante P que determina la pigmentación y otro gen dominante (situado en otro cromosoma) que controla la reversión a un alelo Pm mutado por inserción de un elemento móvil. a) ¿Cuáles son los genotipos de la planta parental y de la progenie? b) ¿Qué tendrá el gen controlador que le falta al transposón que se metió en el gen de la pigmentación?¿Qué deben tener en común los dos? c) ¿En qué tipo de células (somáticas o germinales) y en qué momento del desarrollo ocurrió la reversión en los granos mosaico? d) ¿Cuál sería el resultado de un Southern de las partes blancas y pigmentadas de los granos mosaico, usando el gen P como sonda? 2) Una estrategia alternativa a los marcadores moleculares para el clonado de genes es el "transposon tagging", es decir etiquetado de genes mediante transposones. Se realizó la transformación -vía Agrobacterium- de Arabidopsis thaliana resistente al hongo Cladosporium fulvum, con el elemento Ds a unas plantas, y con un elemento Ac defectivo a otras plantas. Como resultado, se obtuvieron algunas transgéni-

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cas visiblemente mutadas (plantas enanas, albinas, sin flores, etc.), pero ninguna presentando fenotipos mosaico. Sin embargo, al cruzar ambos tipos de transgénicas entre sí (con Ds x con Ac), la progenie resultante incluía varios individuos con fenotipos mosaico debido a mutaciones somáticas. Uno de los fenotipos analizados fue el aspecto de las hojas luego de inocular con Cladosporium fulvum, llamando la atención una planta que tenía una hoja saludable excepto en una zona necrótica-dañada por el hongo- bien delimitada. Al hacer un Southern sembrando DNA -cortado por Hind III- aislado de dos zonas de la hoja mosaico (resistente (R) y susceptible (S) al hongo), el resultado fue:

kpb 15-13-7--

S

R

kpb

S

R

inserción, no se expresa y los ojos resultan blancos. Por sucesivas cruzas, se obtuvo una población de machos y hembras con todos sus cromosomas X conteniendo el gen white interrumpido por peach. Por otro lado, se logró una construcción denominada hsp, en la que el elemento mariner salvaje se puso bajo la regulación del promotor del gen de la proteína hsp70 (heat shock protein), que es inducible por calor. Esta segunda construcción se introdujo en uno de los cromosomas del par 2 de moscas transgénicas que ya eran peach, obteniéndose moscas hsp/+. Se realizaron cruzas entre moscas transgénicas peach, en las que uno de los parentales tenía 1 dosis de hsp (hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+). Se contó el porcentaje de la progenie, criada a 25ºC (actividad basal de hsp) o a 37ºC (actividad inducida de hsp), que exhibía ojos rojos.

Genotipo del cromosoma 2 de los padres hsp/+ ; +/+ 6-hsp/+ ; hsp/+ Sonda: Ac +/+ ; +/+

3-Sonda: Ds
Nota: Hind III no corta a Ds ni a Ac a) Haga un esquema que muestre qué zona del plásmido Ti (o derivado de Ti) usaría para colocar a los transposones con el fin de transgenizar a las plantas? ¿Cómo haría para lograr una selección de las plantas verdaderamente transformadas? b) ¿Por qué aparecieron mutantes somáticas (fenotipos mosaico) en la F1 y no en las parentales? c) ¿En qué se basa el "tagging" del gen a clonar, en este caso? En base al Southern, ¿por cuál mecanismo (replicativo o no replicativo) transpone Ds? d) Si usted desea clonar el gen de resistencia a partir de una biblioteca genómica indique: I. la fuente de DNA para hacer la "library" (¿qué parte de la planta?) II. el tipo de "library" (¿genómica o de cDNA?) III. si usaría alguna enzima de restricción. ¿Cuál? IV. el tipo de vector para construir la "library" (indique, además, si debe permitir o no expresión de insertos y por qué) V. la sonda que usaría y el fundamento del "screening" VI. en qué consistiría el análisis del clon aislado 3) Recientemente, un grupo de investigadores estudiaron los mecanismos de regulación del elemento transponible mariner, que está presente en genomas de invertebrados, hongos y humanos. Obtuvieron un macho transgénico que tenía reemplazado un fragmento del gen white, localizado en el cromosoma X, por otro homólogo, pero interrumpido por un mariner cuya transposasa no era funcional. Esta variante de transposón con transposasa no funcional se denominó peach. El gen white codifica para un pigmento rojo del ojo y cuando está mutado por

Temp. % progenie (c/ ojos rojos) 25 8 37 17 25 18 37 48 25 1 37 2

a) Interprete los resultados numéricos b) ¿En qué etapa del desarrollo ocurren los eventos que dan a origen a la progenie con ojos rojos ? c) En este tipo de cruza también aparecen individuos con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo mosaico). ¿Cómo justifica estos resultados? ¿En qué etapa del desarrollo ocurrieron los procesos que originaron los ojos mosaico? d) Las hembras mosaico presentan un mayor número de manchas rojas que los machos mosaico. ¿Cual es la causa? 3) Un ejemplo muy llamativo de “transposon tagging” es el del trabajo publicado por Ling y col. en Science 282:943 (1998) en el que clonaron el gen Matusalem (Methuselah) que prolonga la vida de las moscas (y de gusanos). Recientemente (febrero del 2002) se publicó en varios diarios la identificación del gen homólogo en humanos. Los investigadores introdujeron, de manera controlada como para evitar la disgénesis del híbrido, elementos P en una cepa de Drosophila que no los tenía (cepa M). a) ¿Cómo supone que lo hicieron? b) ¿Le parece que aparecieron mosaicos? ¿Por qué? Si bien identificaron varios mutantes en la M1 (primera generación de mutantes equivalente a lo que comúnmente se llama F1 pero que en este caso no proviene de un cruzamiento sino de un tratamiento mutagénico), encontraron muchas más en la M2 (o en generaciones posteriores de endocría entre hermanas, equivalente a la F2, segunda generación después de la mutación). c) ¿Por qué es esto?

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Entre los nuevos mutantes había uno que les llamó mucho la atención: era capaz de vivir un promedio de 77 días en vez de los 57 que vivían, como promedio, las moscas normales, por lo que bautizaron Matusalem al gen en cuestión. d) ¿Quién fue Matusalem? ¿Quiere decir que este gen en forma normal alarga la vida? Además estas mutantes eran más resistentes al ayuno y a condiciones de estrés oxidativo. Por todas estas razones, inmediatamente clonaron y secuenciaron el gen en cuestión. e) ¿Por qué esto les resultó, relativamente, fácil de hacer? ¿Porqué no les habría sido tan fácil mutagenizando con un producto químico como el EMS? El gen resultó ser un receptor de superficie celular de 514 aminoácidos del tipo de los receptores G, pero de función desconocida. Con este gen se pudo clonar rápidamente un gen muy similar en Caenorhabditis elegans (un nemátodo muy estudiado como modelo en análisis genómico y del cual ya se conocía buena parte de la secuencia genómica). Su mutación tenía efectos fenotípicos muy similares a lo observado en moscas. f) ¿Qué le indican estos resultados respecto a la evolución del gen? g) ¿Cómo se pudo aislar tan rápidamente este nuevo gen de nemátodos y modificar el mismo para hacer estas observaciones sin repetir el transposon tagging de las moscas?

11.- INGENIERÍA GENÉTICA
Bibliografía: Recombinant DNA, Watson y col.

Guía de estudio:
1) ¿Qué significa "clonar" un gen? Defina la expresión "ADN recombinante", "vector" e "inserto" Mencione un método que sirva para reconocer fácilmente colonias de bacterias que llevan plásmidos que contienen insertos.

R: Clonar un gen (o una secuencia de ADN) significa sinifica aislarlo de su contexto original y colocarlo en otro contexto donde pueda ser amplificado. Es decir, aislarlo del genoma (por ej. con enzimas de restricción) para insertarla en un vector (por ej. un plásmido bacteriano) para que, después de introducida la construcción recombinante en una bacteria como E. coli, se pueda multiplicar esta secuencia para su análisis molecular (por ej. secuenciación nucleotídica). El concepto difiere de la clonación biológica en el sentido de que acá estamos hablando de un segmento de ADN y no de un organismo completo. Para reconocer bacterias que llevan plásmidos con inserto se hace visualización de color (o falta de color) de colonias (ver uso de β-gal, más adelante). 2) Defina la expresión "ADN recombinante" R: ADN recombinante es un término que se originó cuando se desarrollaron las primeras técnicas de Ingeniería Genética y se refiere a un fragmento de ADN que se origina por la unión “in vitro” de dos fragmentos distintos, que pueden provenir, inclusive, de especies no relacionadas. Quimera (sinónimo) Nota: La expresión recombinante (aquí) no es sinónimo de recombinación homóloga porque no hay un intercambio de segmentos homólogos. En todo caso, se parece a la llamada recombinación ilegítima (como por ejemplo la integración de fago lambda para hacerse lisogénico, ver guía de genética bacteriana). 3) ¿Qué tipos de vectores de clonado conoce que funcionen en células procariotas? ¿y en eucariotas? R: Vector se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y , como el témino lo indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo. Elementos básicos de un vector: ser transferible por algún método, ser seleccionable, ser propagable, aceptar la inserción de DNA exógeno. Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en general representa el ADN de interés, que fusionado al vector puede replicarse en el huésped adecuado. En células procariotas hay plásmidos y fagos. Los primeros con circulares y tienen un origen de replicación que permite que se repliquen y se mantengan en la célula. Los hay de alto y bajo número de copia. Los fagos pueden ser utilizados como vectores, donde el ADN se interés debe ser “insertado” en el genoma del fago. En ambos casos se puede también diferenciar a los vectores de expresión, ya sean fagos o plásmidos, que tienen promotores y terminadores que flanquean al inserto, de forma de producir un mRNA y la proteína correspondiente. En células eucariotas también hay vectores virales y plásmídicos. Estos últimos sólo se se parecen a los bacterianos naturalmente en levaduras. En células de mamíferos se los ha fabricado articialmente utilizando orígenes de replicación y replicasas de origen viral (como los plásmidos derivados de SV40 en células

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Cos). Muchos de ellos fueron modificados para incorporar orígenes de eplicación de E. coli para así poder replicar también en bacterias, especialmente cómodo para producirlos en buena cantidad. Por eso se los denomina: de combinación (shuttle). En levaduras también se desarrollaron cromosomas artificiales (YACs), que fueron los primeros en utilizarse para clonar grandes fragmentos que fueron secuenciados en los albores de la genómica estructural. Posteriormente fueron sustituídos por otro tipo de vectores com los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes). 4) ¿Qué es una genoteca (o library genómica) y cómo se construye? ¿Qué diferencia tiene con una clonoteca (habitualmente llamada library) de ADNc (cDNA)?¿Cómo se realiza una búsqueda, prospección, relevamiento (habitualmente llamado screening)? ¿Cómo se puede marcar una sonda? ¿Cómo se procede para identificar bacterias que llevan una construcción de interés, luego de haber sido transformadas con una mezcla de ligación? R: Genoteca o genomoteca es una “biblioteca” de ADN donde, en vez de colecciones de biblios. (que significa libros) dispongo de colecciones de segmentos de genomas. En general son específicas de un organismo determinado. Se utiliza ADN genómico que se corta ya sea con enzimas de restricción o por métodos físicos y se liga a un vector, que puede ser un plásmido, un fago o un BAC. Este material se utiliza para transformar bacterias competentes (preparadas fisiológicamente para permitir la entrada de ADN extracelular) o para infectarlas, si se utiliza un fago. La población de bacterias obtenidas representa a todos los posibles fragmentos del ADN genómico original. En el caso de la clonoteca o “library” de cDNA se utiliza ADNc en lugar de ADN genómico, pero el proceso es similar, salvo que no es necesario cortar el ADNc. Hay varias formas de marcar sondas, las que numeramos a seguir. “Random priming”: se incuba el fragmento con una población de oligonucleótidos (hexámeros y/o octámeros) en presencia de fragmento Klenow (fragmento de la ADN polimerasa de E. coli), dNTPs, alguno de los cuales está marcado en Alpha (primer fosfato) y Mg2+. Después de un proceso de desnaturalización y renaturalización se agrega la enzima, los oligonucleótidos se unen al ADN y son utilizados como sustrato por la enzima. Actualmente el más usado. “Nick translation”: si una de las cadenas de un plásmido se corta exponiéndo un extremo 3’OH, la ADN polimerasa I utiliza ese extremo como sustrato e inicia la síntesis de ADN, desplazando a la cadena existente, y corriendo el “nick”. Aquí también se lleva a cabo la reacción con dNTPs, alguno de los cuales está marcado y Mg++, además de la ADN Polimerasa I de E. coli. Marcación terminal: se puede marcar el extremo de un fragmento utilizando una quinasa específica y ATP marcado en gama.

PCR: la reacción de PCR puede utilizarse introduciendo un dNTP marcado en la reacción o utilizando un “primer” previamente marcado en su extremo 5’ con una quinasa. Lo mismo puede hacerse con hexámeros de secuencia al azar. Ribroprobes: con el plásmido adecuado , en presencia de una ARN polimerasa como la T7 y de ribonucleótidos, se puede transcribir un gen “in vitro” y marcarlo pasa ser utilizado como sonda. En el caso de las genotecas, se llama “screening” a la búsqueda del clon que contiene el fragmento de nuestro interés. Existen esencialmente dos formas. La primera es utilizar un fragmento y oligonucleótido de nuestro gen marcado. Este fragmento se hibrida con una membrana obtenida de una placa de petri conteniendo múltiples colonias o playas de lísis, dependiendo del vector utilizado. El ensayo es análogo al “Southern blot”. La marca (sea radiactiva o no radiactiva) indicará las colonias o placas positivas, las cuales se pueden recuperar de la placa madre. La segunda forma es utilizar una forma de detectar la proteína expresada, en caso de los vectores de expresión. En general puede hacerse utilizando anticuerpos que detectan la proteína producida y nos darán la posición de la colonia o playa de lisis positiva, en un ensayo que es análogo al de un “western blot”. Para identificar bacterias que llevan una construcción de interés, luego de haber sido transformadas con una mezcla de ligación y seleccionadas para la presencia de plásmidos: Se preparan plásmidos a partir de un cierto número de clones “positivos” y se los “chequea por restricción”, es decir se los digiere para comprobar el mapa de la construcción realizada. A veces se hace PCR con primers específicos directamente de las colonias positivas (la Taq pol es mucho más barata que las enzimas de restricción y permite analizar muchos clones a la vez). 5) ¿Cuál es la diferencia entre una transformación y una transfección? R: En animales, transformación se refiere a la conversión de una célula o tejido en neoplásico, por lo que no es correcto sinonimizarlo con transfección. En bacterias, también es preferible decir transfección porque la transformación “natural” que vimos en genética bacteriana tiene diferencias con la artificial que se usa en ingeniería genética. En plantas son sinónimos. 6) ¿En qué situaciones usaría Ud. las siguientes enzimas?: retrotranscriptasa ligasa Taq polimerasa DNAasa I RNAsa H R: RT: Es una ADN polimerasa dependiente de ARN por lo que se la usa para fabricar ADN a partir de ARN por ejemplo en el proceso de clonado molecular de ARNm. Nota: raramente se la puede usar como ADN polimerasa dependiente de ADN cuando hay dificultades en la secuenciación manual de regiones

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con estructuras secundarias que dificultan la acción de las ADN polimerasas tradicionales. L: Para ligar fragmentos. Para unir un inserto a un vector. Requiere ATP y Mg. Taq pol: en PCRs. DNAasa I: para cortar ADN en forma inespecífica, por ejemplo para introducir los “nicks” en la marcación por “nick translation”. RNAsa H: para eliminar la hebra de ARN después de la acción de la tanscriptasa reversa. 7) Se quiere clonar el gen de una proteína que se expresa en cerebro de ratón. Ud. no tiene, ni puede llegar a saber, la secuencia de aminoácidos de la proteína y depende exclusivamente de anticuerpos. ¿Qué tipo de genoteca usaría para comenzar?: a) ¿una genómica hecha con ADN obtenido de cerebro de ratón? b) ¿una genómica obtenida de hígado de ratón? c) ¿una de ADNc hecha con ARNm de corazón en pBR322? d) ¿una de ADNc hecha con de ARNm de cerebro en pBR322? e) ¿una genómica de expresión hecha en el fago λ gt11 hecha a partir de ADN de ganglios linfáticos de ratón? f) ¿una genómica de expresión hecha a partir de ADN genómico obtenido de cerebro de ratón? g) ¿una de ADNc de expresión hecha en fago λ gt11 a partir de ARN de cerebro de ratón? R: La opción g) porque es en el tejido en el que el ARNm es más abundante. 8) ¿Qué es la mutagénesis dirigida in vitro? Mencione algún procedimiento para lograrla, uno usando células y el otro sin usarlas. R: Suponiendo que la secuencia que quiero mutar se encuentra entre 2 sitios de restricción de tipo cohesivo dentro de un plásmido, puedo digerir con la enzima y religar para obtener una deleción. Otra: teniendo la secuencia clonada en un plásmido, se la desnaturaliza con calor (para obtener ADN de cadena simple) e hibrida (anilla) con un oligonucleótido sintétizado artificialmente de forma de tener una secuencia complementaria, salvo por un nucleótido (que es el que interesa modificar) y que está ubicado en el centro del oligo. El ADN heterodúplex (tiene una base mal apareada o missmatch) se incuba con una ADN polimerasa que usa el oligo como iniciador (primer) para completar la cadena complementaria. Transformo bacterias con el plásmido heterodúplex y su replicación dentro de la célula originará 2 moléculas hijas: una normal y la otra mutante. Un ejemplo de mutagénesis usando células es el reemplazo alélico que se produce en un experimento de knock out de un gen. 9) Dada una secuencia de interés: mediante qué estrategias se pueden generar mutaciones in vitro? Dé ejemplos de generación de mutantes in vivo. A) Partiendo de la secuencia de interés clonada en un plásmido, se pueden hacer deleciones, inserciones o

reemplazos puntuales 1) mediante el uso de primers específicamente diseñados que amplifiquen la secuencia con la modificación deseada. Se trabaja con DNA simple cadena (por desnaturalización del plásmido, por obtención de moléculas de simple cadena si el plásmido es derivado de un fago), primers y DNA polimerasa. (Hacer esquemas ilustrativos). Las bacterias son transformadas con el plásmido heterodúplex y su replicación dentro de la célula originará 2 moléculas hijas: una normal y la otra mutada. 2) Se pueden hacer deleciones por digestión y religado de la secuencia de interés. Se necesita disponer de sitios adecuados de enzimas de restricción. B) Por amplificación de la secuencia de interés por PCR en condiciones de alto error (concentraciones bajas de alguno de los ddnucleótidos, reemplazo de Mg por Mn). Los fragmentos son clonados y se obtiene una “library” de mutaciones. Una secuencia de interés puede ser mutagenizada in vivo mediante la introducción en células de construcciones adecuadas (algunas se describieron arriba). Una posibilidad es el reemplazo alélico que resulta en una modificación funcional (Ej. generación de mutantes termosensibles) o en la anulación de la función (Ej.: en un experimento de knock out de un gen). 10) ¿Cuál es la diferencia entre una transfección transitoria y una estable? ¿En qué casos se utiliza la primera? R: En la transitoria (no se dice transiente) el ADN ingresa al núcleo y se expresa, pero no se integra al genoma. Después de un tiempo se degrada o se pierde por dilución a medida que no puede acompañar la replicación del ADN cromosómico. Se usa para determinar más rápidamente la especificidad y nivel relativo de expresión de un promotor, así como en muchos otros casos (reporteros en células animales, expresión de proteínas de fusión por ej.). Obtener clones “estables” en cultivos celulares animales o vegetales es un proceso lento y engorroso. 11) ¿Cuáles son los métodos más comunes para transfectar células animales? ¿En qué casos o aplicaciones se utilizan la transfección de células animales cultivadas in vitro versus la de animales transgénicos? R: Coprecipitación con fosfato de Ca (el más antiguo, en desuso), microinyección (ídem), electroporación, liposomas usando lípidos catiónicos e infección con vectores virales. Aplicaciones: industriales-farmacológicas (algunas comunes otras distintas en ambos casos) = molecular farming. Mejoramiento (aunque no hay casos de esto último a nivel comercial). 12) ¿A qué se llama organismo "transgénico" u OGM u OVM? Dé ejemplos. Las definiciones son necesariamente artificiosas y arbitrarias porque no basta con decir que se trata de un organismo que contiene ADN procedente de otra especie o foráneo. Todos los cultivos modernos tienen esta característica debido a que fueron mejorados mediante cruzamientos interespecíficos y hasta inter-

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genéricos (el trigo, por ejemplo, fue cruzado con el centeno para incorporarle genes de resistencia a enfermedades fúngicas) por lo que serían transgénicos. Por lo tanto, se denomina así a los organismos obtenidos por biotecnología moderna, entendiendo por biotecnología moderna a la ingeniería genética y a la fusión celular entre células de especies que no se pueden cruzar entre sí. OGM (organismos genéticamente modificados) es nomenclatura del Codex-FAO, OVM (organismos vivos modificados) del Protocolo de Bioseguridad del Tratado de Cartagenadependiente del Convenio de Biodiversidad de PNUMA (Prog. Nac. Unidas Medio Ambiente). 13) ¿Qué utilidad tiene el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens? R: El plásmido Ti contiene lo que se conoce como región T, que es la región que la bacteria transfiere a la planta en el proceso de infección, y otra que contiene los genes “vir” que se requieren en “trans” para que la región T pueda ser transferida. En los primeros ensayos de obtención de plantas transgénicas, la región T se modificó, agregando los genes de interés y manteniendo los bordes derecho e izquierdo que son importantes para la transferencia. De esta forma se logró transferir un ADN de interés a plantas. En este momento se utilizan plásmidos Ti desarmados, es decir, que no contienen la región T, en conjunto con plásmidos pequeños que contienen los bordes de la región T, flanqueando los genes de interés. Este tipo de plásmidos se denomina binarios y permiten que la manipulación sea mucho más simple que con el plásmido Ti completo ya que este último tiene aproximadamente 250 kpb contra las 10 kpb de los plásmidos binarios. 14) ¿Qué tipo de plantas se suelen transformar con el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y cuales por métodos biolísticos y por qué? R: Si bien es posible utlizar ambos métodos con todo tipo de plantas, las dicotiledóneas suelen ser transformadas con Ti mientras que las monocotiledóneas lo son por el método biolístico debido a que existen grandes diferencias en su eficiencia relativa. Esto es así porque estas últimas no son huéspedes naturales de Agrobacterium. 15) ¿A qué se llama "vacuna recombinante"? ¿Hay alguna en el mercado? R: Vacuna recombinante es aquella producida por métodos de ADN recombinante. En general consiste en la producción del gen codificante para un antígeno (proteína recombinante) en un sistema viral heterólogo. El antígeno funciona como vacuna cuando logra despertar en el organismo una respuesta inmune que lo protege del ataque del patógeno que lleva ese antígeno. Un ejemplo muy utilizado es la vacuna contra la Hepatitis B,Vaccinia- rabia. Retrovirus felino para perros.... 16) ¿Qué significa "terapia génica"? R: Es una terapia que implica el uso de vectores para lograr introducir ADN conteniendo un gen funcional en células de un paciente con el propósito de revertir

los síntomas de una enfermedad, generalmente producida por un gen defectuoso. 17) ¿Cuáles son los riesgos para el ambiente y para la salud humana que pueden traer estas tecnologías? R: Las inquietudes, algunas genuinas, otras no tanto, pueden agruparse en 3 categorías: a) Potenciales efectos sobre la salud humana y animal (toxicidad, alergenicidad, transferencia horizontal de resistencia a antibióticos, ingestión de ADN foráneo que modificaría nuestra constitución genética, utilización de secuencias de ADN de origen viral) b) Potenciales consecuencias ambientales (daño a especies ajenas al proceso, como la mariposa Monarca; la aparición de insectos resistentes; que el cultivo se convierta en una supermaleza; que haya flujo de genes desde cultivos a malezas; que las proteínas transgénicas se difundan en el ambiente; que disminuya la biodiversidad y otros semejantes). c) Preocupaciones de tipo político, económico o social: concentración de beneficios monopólicos en empresas, particularmente multinacionales; limitación de acceso a la biodiversidad genética por un patentamiento concebido como apropiación comercial no ética; avasallamiento del derecho de agricultores; acrecentamiento de brechas sociales y productivas entre productores pequeños y grandes; crecimiento de una agricultura industrial poco sustentable, en detrimento de prácticas que lo sean; dificultades de la coexistencia con la agricultura orgánica. Un riesgo que se debe considerar como de ocurrencia probable, es que el uso generalizado de plantas resistentes a plagas y herbicidas seleccione la aparición de insectos y malezas capaces de superar dicha resistencia (ver problema de genética de poblaciones en el anexo). La experiencia acumulada en 20 años de comercialización masiva del primer producto derivado de un OGM, la insulina humana, y en 10 años de cultivos, no parece indicar que la mayoría de estas inquietudes se puedan fundar genéricamente en la tecnología. Es decir, un OGM no conlleva riesgo por ser tal, si bien podría tenerlo por el transgén específico que lleve incorporado. Debido a ello, los organismos nacionales e internacionales de análisis y regulación estudian caso por caso el producto final. Por ejemplo, los riesgos de soja con resistencia a herbicidas son distintos que los de maíz con el mismo gen incorporado por ingeniería genética (o transgén), o a los de soja con otro transgén. Es más, los sistemas regulatorios suponen razonablemente que una soja resistente a un herbicida como resultado de acciones de ingeniería genética tiene idénticos riesgos ambientales que una obtenida por métodos convencionales. Los riesgos alimentarios se evalúan de acuerdo con procedimientos bien establecidos y aceptados internacionalmente. Además de analizar su toxicidad y su degradación en jugos gástricos sintéticos, se realizan pruebas de equivalencia entre alimentos derivados del cultivo convencional y otros preparados con el OGM.

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Si bien el riesgo de que los transgenes se incorporen por cruzamiento a otras plantas de la misma especie o de especies relacionadas demostró ser real, los perjuicios, según se encontró, fueron más comerciales que ambientales. En todo caso, la incidencia real de estos riesgos está muy lejos de obligar a la consideración de un abandono de los cultivos OGMs. Por otro lado, se comprobó que, a pesar de la demora en la liberación de desarrollos realizados por instituciones públicas de OGMs con caracteres que favorecen a los productores más pequeños, éstos también se beneficiaron notblemente al cultivar los OGMs de primera generación. 18) ¿Qué pasó en Asilomar en la década del ’70? ¿Qué conoce del tema de la bioseguridad del manejo de OGMs en Argentina y en el mundo? Lo de Asilomar está en el Recombinant DNA de Watson: Poco después de que se descubrieran las enzimas de restricción y se produjeran las primeras moléculas recombinantes, cuando aún no existía Greenpeace, los propios científicos plantearon inquietudes de bioseguridad del tipo: ¿qué pasaría si una E. coli (habitante habitual del intestino humano) recombinante con un oncogén se “escapa” al ambiente e infecta la humanidad? A partir de ese momento se diseñaron laboratorios con distintos niveles de seguridad: desde P1 (muy bajo) para trabajar con plantas (no se las consideraba “peligrosas”) hasta P4 (parecido a la película epidemia, igual nivel de seguridad que para trabajar con Ébola). Posteriormente se demostró que la excesiva cautela no fue justificada y los niveles de seguridad se restringieron al nivel del problema estudiado, más que a la metodología. Es más, hoy se considera más seguro trabajar con secuencias clonadas de patógenos (como el HIV) que trabajar con el patógeno mismo. La Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos publicó en su sitio de internet un documento donde responde a las preguntas que frecuentemente se hace la gente sobre los transgénicos: http://www. sagpya.mecon.gov.ar/ ir a Biotecnología donde se puede obtener más información sobre el sistema regulatorio en Argentina.

Problemas:

1) Se desea clonar el gen que codifica a una entomotoxina proteica con propiedades insecticidas que se encuentra en Bacillus thuringiensis (bacteria del suelo originalmente aislada de insectos muertos), pensando en producir soja transgénica resistente a lepidópte- Cla I pTEros. Para cumplir con la primera etapa del objetivo ORF ampR TORF Cla I planeado, se cortó el DNA total de B.t. con MboI en Cla I cantidad limitante (tubo 1). Por otra parte, el plásmido R pAMP 6 kpb Bluescript (parecido al pUC19) fue incubado con 5 kpb BamHI (tubo 2, ver tabla de sitios de reconocimiento en la guía 1 y comparar BamHI y MboI). Después se mezclaron los contenidos de los tubos 1 y 2 en pre- El plásmido recombinante pTETORFAMP se obtuvo sencia de ligasa, incubándose durante la noche a 16 ºC por transformación en una cepa de E. coli recA (in(tubo 3). Luego se transformaron células competentes capaz de hacer recombinación homóloga). Las bacte(permeabilizadas con CaCl2) de una cepa de E. coli rias transformadas con la ligación se crecieron a que era RecA-, AmpS, lac- en presencia de ampicilina, 30°C. Posteriormente, el plásmido obtenido fue introIPTG y X-gal (X-gal es un sustrato cromogénico de la ducido por transformación en una cepa de E. coli sal-

ß-galactosidasa que da un producto azul). Como la relación entre colonias blancas y azules resultó apropiada, se decidió continuar haciendo réplicas de las colonias en filtros de nitrocelulosa. Finalmente, los filtros se revelaron con un anticuerpo antientomotoxina, mediante el método del segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. Diga si es verdadero o falso y fundamente el razonamiento: a) Los extremos generados por BamHI no pueden ligarse a extremos generados por MboI. b) Se utilizó BamHI porque la enzima universalmente reconoce los codones de iniciación de todos los genes permitiendo su correcta inserción en el vector utilizado con respecto a su posición respecto del promotor lac. b) La ampicilina sirvió para seleccionar bacterias transformadas. c) La ampicilina sirvió para seleccionar bacterias transformadas con algún plásmido recombinante (es decir plásmido con inserto). d) Las colonias que llevaban algún plásmido recombinante (es decir con inserto) son azules. e) Dado que la maquinaria transcripcional de E. coli es similar a la de B.t. fue posible encontrar algunos clones positivos que contenían el gen de la entomotoxina completo (incluyendo su promotor) orientado en cualquiera de las dos sentidos respecto al vector. 2) Utilizando como sonda un cDNA de la subunidad mayor del receptor de GABA (un neurotrans-misor) y empleando condiciones de baja rigurosidad, se aisló a partir de una genoteca de E. coli un fragmento de DNA (llamado ORF más adelante) conteniendo un marco de lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la sonda usada. Con el objeto de identificar la función de este gen (la cual seguramente no es recibir neurotransmisores) se utilizó la siguiente estrategia: El plásmido pAMPR (ver Fig.) fue digerido con la enzima de restricción Cla I y el fragmento de 1,6 kpb conteniendo el gen de la ß-lactamasa (enzima que hidroliza a la ampicilina y confiere resistencia a este antibiótico) fue purificado e introducido en el sitio Cla I de pTETORF (ver Figura) Este plásmido contiene el fragmento clonado (ORF) y un gen (tet r) que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina. La replicación de pTETORF es termosensible, funciona a 30°C y se inhibe a 42°C.

vaje (recA+). Las bacterias fueron cultivadas a 42°C durante 15 horas en presencia de ampicilina y luego una alícuota fue sembrada en ágar conteniendo medio rico y ampicilina. Se hizo un plaqueo en réplica hacia una placa conteniendo el mismo medio más tetraciclina. Las colonias resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina fueron utilizadas en los ensayos siguientes. A-¿Cuál es el objetivo del protocolo? ¿Por qué fueron elegidas las bacterias ampR tetS? ¿Hubiera bastado con determinar la resistencia a ampicilina?¿Por qué? B-¿Qué hubiera pasado si las bacterias hubieran sido cultivadas a 30°C? C-¿Qué ensayos haría para confirmar que las mutantes aisladas tienen el genotipo esperado? Una vez confirmada la mutación, obtenemos como primera conclusión que ésta no parece afectar la capacidad de la bacteria para crecer en medio rico. (D- ¿ De dónde saca esa conclusión?). El experimento siguiente fue plaquear las bacterias mutantes en medio mínimo. No se encontraron diferencias respecto de las salvajes en número ni en morfología de colonias. Luego de tanto tiempo de trabajo infructuoso y, con tal de tener un resultado, los investigadores decidieron mapear por conjugación el locus ORF aprovechando las características de la mutación introducida. E-¿Que característica de las mutantes facilita el mapeo del locus ORF? ¿Podría hacerlo si no la tuvieran? Muchos años después, un joven e inquieto estudiante de biología, buscando tema para su tesis de Licenciatura, rescató de una congeladora esta vieja mutante y se propuso caracterizarla. Su razonamiento fue: si este gen no es esencial en condiciones de crecimiento normales, quizás sea necesario en condiciones de estrés (calor, frío, hiperosmoticidad, hipoosmoticidad). Haciendo curvas de crecimiento en medio líquido en estas condiciones, encontró que la cepa mutante mostraba una marcada deficiencia (comparando con la salvaje) para crecer a temperaturas mayores a 45°C. Al mostrarle este resultado a su ya decrépito director éste lo desanimó diciéndole que seguramente tanto tiempo en la heladera había introducido nuevas mutaciones en la cepa. Aunque extrañado el estudiante enseguida pensó y realizó un experimento que despejó toda duda sobre la causa genética de la deficiencia de la cepa congelada. F- ¿Cuál fue el experimento realizado? 3) Diseñe una estrategia detallada para expresar anticuerpos monoclonales contra el virus de la diarrea infantil (un rotavirus) en leche vacuna, usando las técnicas de uso común en ratones transgénicos. Para ello dispone de la línea celular necesaria (hibridoma) produciendo dichos anticuerpos, todo tipo de variantes de bacterias y vectores utilizados en ingeniería genética. 4) El tema de las patentes de secuencias nucleotídicas es polémico, particularmente en el caso de las secuencias humanas. Para analizar el tema se analiza el caso de la patente No. 4943674 de Calgene en Estados

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Unidos que protege a secuencias nucleotídicas de unión de factores transcripcionales específicos de fruto. La patente protege todo uso de estas secuencias en cuanto a su uso en la obtención de plantas transgénicas que provoquen CUALQUIER tipo de cambio fenotípico en el fruto de CUALQUIER planta (desde vid, sandía, citrus, peras, cerezas, ciruelas, etc. hasta tomate, pepinos y zapallos). Para sustentar el reclamo, la empresa provee una serie de datos experimentales. A partir de una clonoteca (colección de clones) de cDNA diferencial se clonó y caracterizó la secuencia codificante para la poligalactouronasa (PGU). Esta enzima se sintetiza en los tomates maduros y ataca la pared celular produciendo el ablandamiento del fruto, proceso no deseado comercialmente. La concentración del mRNA para PGU aumenta más de 2000 veces cuando se compara la concentración en tomates rojos (maduros) con la de tomates verdes (inmaduros) por lo que hipotetizan que la regulación del gen es fundamentalmente a nivel transcripcional. Posteriormente, clonaron y secuenciaron el gen completo de la PGU (incluyendo su promotor) e hicieron una construcción en la cual invirtieron la orientación de la secuencia codificante la cual introdujeron en plantas de tomate (transgénicas para la misma). Como consecuencia, se transcribe un RNA complementario al mRNA para PGU que al formar una doble cadena con el mRNA bloquea su traducción (esta forma de inactivación de la expresión de genes se denomina estrategia RNA antisentido). De esta forma se obtuvo el tomate Flav®Sav® (con mucho aroma y sabor) que constituyó la primera planta transgénica liberada, comercializada y consumida a nivel mundial (1988). I) Describa cómo obtuvieron la clonoteca diferencial. II) Describa cómo clonaron el gen PGU completo. III) Describa cómo haría para demostrar en forma más precisa, usando secuencias indicadoras (reporteras), el control transcripcional ejercida por este promotor. No olvide detallar construcciones, vectores, métodos de transformación, evaluación de la expresión, etc. IV) La descripción de la patente viene acompañada por la secuencia nucleotídica completa del promotor del gen de la PGU. Sin embargo la empresa se preocupa particularmente en proteger no sólo la secuencia completa sino también cualquier fragmento parcial de la misma ¿por qué? V) La secuenciación del gen incluyó al terminador del gen. Sin embargo, a diferencia del promotor, la empresa no solicita su protección mediante esta patente ¿por qué? VI) Si Ud. fuera funcionario de la oficina de patentes y le toca evaluar esta presentación particularmente en cuanto a la amplitud de la protección solicitada (derechos extensivos a todas las plantas, por ej.) ¿qué experimentos adicionales solicitaría para sustentarla? 5) En la película de los expedientes secretos X, se plantean una serie de situaciones cuya verosimilitud sería interesante constatar. Al principio de la película (30.000 años AC) un virus extraterrestre infecta a un

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humano primitivo. Posteriormente, ya en el presente, los "malos" de la película tratan de multiplicar este virus para su transmisión de varias formas (en una escena la agente Scollie se infecta al ser picada por una abeja transmisora del virus). En otra parte de la película se comenta que el virus está siendo producido (biotecnológicamente) en unos maíces "transgenéticos". Imagine que resulta contratado por una activa organización ecologista tratando de demostrar el peligroso uso de estas plantas “transgenéticas” como arma biológica de producción de virus activos, ¿cómo haría para demostrar que tales plantas pueden realmente ser producidas? Dispone para ello de viriones aislados de un picornavirus (virus de RNA+ a los que pertenecen, por ej. el virus de la poliomelitis, el de la fiebre aftosa. y que se caracterizan porque a partir de su genoma se traduce una única proteína autoclivable postraduccionalmente -poliproteína-) y todos los recursos posibles a su alcance. I) Detalle cada uno de los pasos del clonado de secuencias necesarias y de las construcciones genéticas que realizaría para su posterior introducción en maíz por ingeniería genética. II) Indique por qué vía introduciría esta construcción en maíz y justifique brevemente. III) ¿Cómo seleccionaria las plantas transformadas? IV) ¿Qué herramientas moleculares y biológicas utilizaría para confirmar que el virus se produce en esas plantas? 6) La hormona del crecimiento (HC) es una proteína que se sintetiza y se secreta en la glándula pituitaria. La expresión de este gen depende de un factor de transcripción específico llamado Pit-1, el cual reconoce la secuencia de ADN (T/A)NCTNCAT. Además de Pit-1, existen otros elementos regulatorios que juegan un papel importante en la expresión de este gen como CRE, GRE y TRE, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas. La zona promotora del gen HC de pollos (HCp), no ha sido tan bien estudiada como la de mamíferos. Se describieron sólo 500 pb de la región promotora del gen HCp, lo cual no permitía realizar un análisis profundo de la regulación de la transcripción en esta especie. Ip, S et al. (Exp.Biol.Med 229: 640-649, 2004) decidieron entonces estudiar más extensamente esta zona regulatoria, y lograron identificar un fragmento de 1,8 kbp de la región promotora de HCp. a) Describa cómo le parece que hicieron los autores para clonar el gen completo de HCp (zona reguladora de 1,8 kpb + region codificante). Qué sonda/s habrán utilizado? b) Cómo se le ocurre que los autores determinaron los posibles sitios de unión de Pit-1 y de otros elementos regulatorios? Los resultados revelaron dos sitios de reconocimiento de Pit-1 en el fragmento de 1,8 kpb. : uno proximal – 113/-104 pb y el otro distal –541/-533 pb, y un posible motivo TRE (CAATGAGGTA) a –137/128. Para ca-

racterizar funcionalmente la zona 5’ del gen HCp, se realizaron ensayos de transfección in vitro usando como gen reportero al gen de la luciferasa. c) ¿Qué consideraciones cree Ud. que se deberían tener para elegir un gen reportero? d) ¿Que construcciones genéticas los autores podrían haber utilizado para el ensayo de transfección? e) ¿Qué células pudieron haber utilizado para el ensayo de actividad promotora por transfección? Qué control/es considera Ud. que los autores deberían haber realizado? Con los ensayos de luciferasa concluyeron que la zona entre –187/+48 pb es la secuencia mínima para tener la mayor actividad promotora. Luego, para determinar si los sitios proximales y distales de unión de Pit-1 eran ambos funcionales, midieron actividad de luciferasa en el fragmento de 1,8 kbp al cual le habían introducido, previamente, mutaciones en la zona distal, proximal o ambas. Los resultados se muestran en la siguiente figura. -1727pb -541pb -113pb + 48pb
LUCIF.

% Act. Prom relativa a 1 100

Pit-1
LUCIF.

80

LUCIF.

100 80

LUCIF.

motivo ADN salvaje motivo de ADN mutado Secuencia codificante del gen de la enzima luciferasa. f) Cómo interpreta Ud. estos resultados? Finalmente compararon las zonas regulatorias del gen HC de pavo (HCv) con las de HCp. Encontraron que dichas zonas en ambas aves tienen un 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, informaron que existe poca similitud entre estas zonas del gen HCp y las zonas regulatorias de HCm (mamíferos como rata y humanos). g) ¿Qué le sugieren estos resultados?
LUCIF.

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12.- GENÉTICA CUANTITATIVA

Guía de estudio:
1) ¿Qué características particulares permiten diferenciar los caracteres de herencia cuantitativa y aquellos de herencia cualitativa?

Caracteres Cuantitativos Caracteres Cualitativos
U U

Diferencias de grado

Diferencias de clase

Variación continua: Variación discontinua: Clases fenotípicas que forman Clases fenotípicas discretas un espectro métrico continuo Muchos genes involucrados Pocos genes en determinación del carácter Efectos individuales de los Efectos individuales de los genes no discernibles, por ser genes discernibles pequeños y afectados por el ambiente El análisis genético se realiza El análisis genético se realiza mediante estimaciones es- por conteo y proporciones tadísticas de los parámetros de la población, como media y varianza

2) ¿Qué es la “heredabilidad” de un carácter? Se refiere a la proporción de la variabilidad fenotípica total de un carácter que es genéticamente heredable en una población (h2 = VA/VP, VA = varianza genética aditiva, Vp = varianza fenotípica; en otras palabras h2 es la proporción de la varianza fenotípica que se debe a la varianza genética aditiva). 3) Una heredabilidad de 0,4, significa que para un determinado carácter, un individuo presenta el 40% de su fenotipo determinado genéticamente, y un 60% determinado por el medio ambiente? R: No!!!!, es un parámetro poblacional, por lo tanto significa que en una población, sólo el 40% de la variabilidad fenotípica total observada para ese carácter está determinada genéticamente. 4) ¿Por qué es importante conocer el valor de este parámetro en el marco de programas de mejoramiento? R: Porque permite que el mejorador tenga un indicio de cual es la respuesta potencial a la selección que se esté aplicando sobre el carácter. De esta manera se diseñan los cruzamientos adecuados para obtener la mejor respuesta (mejora del carácter) evitando la depresión endogámica y la disminución drástica del tamaño poblacional.

5) a) ¿Por qué el mejoramiento de los toros es más rápido que el de las vacas? ¿Por qué es más fácil mejorar cerdos que ovinos o bovinos?¿Por qué en teoría la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en una población sino que solamente afectaría la distribución de alelos entre genotipos?, b) ¿Cuál es la razón por la que no se obtienen líneas puras en animales?¿Qué son las "razas" en términos de mejoramiento animal?, c) ¿Por qué la selección individual se llama fenotípica y la familiar genotípica? R: El mejoramiento en toros es conveniente pues producen mayor descendencia que las vacas. Los machos son siempre más convenientes pues se pueden evaluar más descendientes sin alargar el intervalo generacional (edad media de los padres cuando nacen los hijos). Además se pueden seleccionar pocos animales con el caracter deseado sin afectar el tamaño poblacional del rodeo. - Es más fácil mejorar cerdos, por ser multíparos. - Consanguinidad: p y q no se modifican. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias génicas conjuntas, sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La consanguinidad hará que alelos recesivos raros se presenten en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio. - Líneas puras en animales no existen pues no hay autofecunfación. Las razas en términos de mejoramiento son poblaciones altamente endocriadas. - En la selección individual se elige al individuo progenitor para realizar mejoramiento por su FENOTIPO. La selección familiar es GENOTÍPICA pues se elige por el pedigree del individuo, por ejemplo, el carácter producción de leche en toros se elige por su tía, madre o abuela. 5) ¿A qué se denominan QTL? R: El término se aplica a los “loci” que afectan caracteres cuantitativos. Es decir que se refiere a la ubicación de genes que afectan caracteres que pueden ser medidos en una escala lineal o cuantitativa. El mapeo de QTL es una técnica de mapeo por recombinación y requiere de: 1) uso de grupos de individuos que difieran marcadamente en el carácter que se quiere mapear; 2) identificación de aquellos marcadores moleculares polimórficos que difieran entre ambas líneas; 3) análisis de la F2 segregante entre ambos grupos (o de la retrocruza o de RIL!!!!), tanto en cuanto a los marcadores moleculares como en cuanto a los valores para el carácter cuantitativo en estudio, 4) análisis estadístico de los datos (ANOVA simple o de regresión como primer paso crudo - el análisis real requiere mapeo del intervalo compuesto con estadística de máxima probabilidad para estimar valores LOD a lo largo del cromosoma). 6) ¿Qué son las líneas recombinantes endocriadas o RILs (recombinant imbred lines)?¿y las líneas haploides duplicadas? R: Las RIL son líneas endocriadas con 9 o más generaciones (14 en Drosophila) de autofecundación o endocría (cruzamiento entre hermanos) y son, por lo tanto, prácticamente homocigotas. Sue-

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len ser derivadas de un cruzamiento entre dos parentales altamente divergentes (contrastantes) para uno o más rasgos cualitativos o cuantitativos representando diferentes combinaciones aleatorias de alelos que estaban fijados en las líneas parentales. Se parte de una F2 (o retrocruza de F1 por un parental). Es una alternativa al cruzamiento prueba dado que todos los segregantes serán homocigotas dominantes o recesivos. Otra ventaja es que la autofecundación (o endocría) de las líneas mantiene el genotipo (no hay segregaciones), lo que permite su mantenimiento (inmortalización) y distribución entre distintos grupos que compatibilizan mapas genéticos. Los haploides duplicados tienen las mismas características, pero se obtienen por un mecanismo distinto. En muchas plantas es posible cultivar anteras (gametas) in vitro de forma de generar plantas haploides. Partiendo de una F1 se obtienen, entonces, gametas haploides que generan plantas que combinan genes de distintos loci de las dos líneas paternas. Cuando se las trata con colchicina, se pueden duplicar los cromosomas dando individuos diploides que son homocigotas porque los cromosomas “homólogos” representan copias idénticas del mismo cromosoma del haploide original.

Problemas: 1) Suponga que dos pares de genes con dos alelos cada uno Aa y Bb, determinan en una población la altura de las plantas en forma aditiva. El homocigota aabb tiene una altura de 30 cm y el AABB, 50 cm. a) ¿Cuál es la altura de la F1 de un cruzamiento entre estas dos cepas homocigotas? b) Después de un cruzamiento F1xF1, ¿qué genotipos de la F2 presentarán una altura de 40 cm? c) ¿Cuál será la frecuencia de estas plantas en la F2? d) Si se seleccionaran los individuos de 45 cm o más de altura para obtener la siguiente generación, ¿cuál sería la altura media de ésta? 2) Se cruzaron dos razas diferentes de maíz, cada una con una altura media de 1,72 m y se obtuvo una F1 con una altura media también de 1,72 m. En la F2 había una considerable variación que iba de 0,91 m a 2,5 m. De las 1942 plantas consideradas, 8 alcanzaban una altura de 2,5 m y 7 una de 0,91 m. La altura del maíz, ¿sería para Ud. un carácter cualitativo o cuantitativo? ¿Por qué? ¿Cuántas parejas de genes están implicadas en la determinación del carácter segregaron en la F2? Explique estos resultados en términos génicos asumiendo que el ambiente fue mantenido constante en todos los casos. 3) Johannsen midió el peso de las semillas de porotos de la variedad Princesa. Los porotos son autógamos (autofertilizados) y por lo tanto esta variedad es una línea pura. Los pesos en centigramos de una muestra pequeña pero representativa se enumeran a continuación: 19 31 18 24 27 28 25 30 29 22 29 26 23 20 24 21 25 29 a) Calcule el peso promedio y la desviación estándar de las alubias en esta muestra. b) Calcule la varianza ambiental.

c) Calcule la heredabilidad del peso de las alubias en esta variedad. d) Si el peso promedio de las alubias seleccionadas para ser progenitores es 30 cg, prediga el peso promedio de las alubias de la siguiente generación. 4) Al medir el contenido en proteínas por mg de materia seca de las plantas de una población se obtuvieron los siguientes resultados: Proteínas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Nº de individuos 1 3 6 10 18 13 6 2 1 Al seleccionar como progenitores para formar la generación siguiente los individuos con contenido proteico superior a 7 unidades se obtuvieron los siguientes resultados: Proteínas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N º de individuos 0 3 4 10 18 9 6 2 0 A la vista de estos resultados, se desea saber: a) El valor de la heredabilidad del carácter "contenido de proteína" b) De acuerdo con dicho valor de la heredabilidad, ¿qué consecuencia se puede sacar respecto al componente genético del carácter analizado? c) ¿Podría darse esta interacción en una alógama? 5) Si 3 genes que segregan independientemente, con dos alelos cada uno, determinan la altura de una determinada planta, por ej.: Aa, Bb y Cc, de modo que la presencia del alelo representado por la mayúscula añada 2 cm a la altura base (que es de 2 cm). a) Indique la altura que esperaría en la F 1 de un cruzamiento entre las cepas homocigotas AABBCC (14 cm) X aabbcc (2 cm). b) Indique la distribución de las alturas (fenotipos y frecuencias) que se espera en un cruzamiento F1 X F1. c) ¿Qué proporción de esta F2 tendría la misma altura que las cepas paternas? d) Si los alelos representados por mayúsculas actuasen como dominantes, por ej.: A_B_C = 8 cm, ¿cuáles serían las respuestas a los epígrafes a), b) y c)? e) Si los alelos representados por mayúsculas actuasen multiplicando la altura existente, por ej.: Aabbcc= 4 cm, AAbbcc= 8 cm, AABbcc= 16 cm, etc., ¿cuáles serían las respuestas a los puntos a), b) y c)? 6) Tiempo atrás salió en los diarios el “descubrimiento” del “gen” del temor (o cobardía) en ratas de laboratorio basado en diferencias observadas en el patrón de comportamiento de ratas frente a la aplicación de shocks eléctricos poco después de hacer sonar un sonido peculiar en un lugar de sus laberintos. Las ratas “temerosas” desarrollaron un reflejo condicionado de cobardía por el que huían rápidamente al escuchar el sonido o cuando eran colocadas en ese lugar del laberinto, sin necesidad de aplicar el shock eléctrico. El grado de “cobardía” se estableció cronometrando el tiempo que tardaban las ratas en huir después de emitirse el sonido característico y al ser colocadas en el lugar prefijado. Se analizó la influencia del cromoso-

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ma 1 en este comportamiento mediante cruzamientos controlados. Se estudiaron distintas RILs para dicho cromosoma obtenidas a partir de un cruzamiento entre líneas “temerosas” y “valientes”. a) Haga un esquema de los cruzamientos con los que se obtuvieron las RILs ejemplificando con el caso de este problema.
Valor proEsquema 1 Sondas RFLP Xabg XKna XCent Xpsr medio y 601 1 1 121 desvío → Padre valiente 10 ± 2,8 Padre temeroso 0,9 ± 0,3 Clase 1 1 ± 0,5 Clase 2 9 ± 2,5 Clase 3 10 ± 2,6 Clase 4 9,5 ± 2,4 Clase 5 0,8 ± 0,4 Clase 6 1 ± 0,6 Clase 7 8,5 ± 2,3 Clase 8 0,9 ± 0,6 Clase 9 1,3 ± 0,7

ra llegar a las mismas conclusiones? e) ¿Reflejan los datos la ocurrencia de segregación transgresiva? ¿Por qué? f) En el esquema siguiente se representa uno de los RFLPs obtenidos para los padres temeroso y valiente, respectivamente, utilizando la sonda Xabg601 y la enzima Eco RI. Complete el patrón obtenido para cada una de las clases recombinantes endocriadas.
Padres T V 1 2 Clases Recombinantes 3 4 5 6 7 8 9

En el esquema 1 se representa una región del cromosoma 1 en las distintas familias recombinantes (negro perteneciente al padre temeroso, blanco perteneciente al padre valiente). De cada clase recombinante esquematizada se obtuvieron al menos 50 ratas que fueron ensayadas biológicamente mediante un diseño estadístico apropiado. Para cada clase recombinante se obtuvo un promedio y un desvío estándar. Indique cómo se hizo para ordenar los distintos marcadores en el cromosoma 1 b) ¿Porqué se utilizaron 50 ratas de cada una de las líneas recombinantes y no solamente una? c) ¿Qué conclusiones puede sacar acerca de la localización genética del temor? ¿Está este QTL ubicado en el cromosoma 1? ¿Podría Ud localizar más de un QTLs en el esquema 1? ¿Supone que puede estar ubicada en otras partes del genoma? ¿Por qué? d) ¿Podría haber utilizado otro método alternativo pa-

6) El enanismo es un carácter muy buscado en trigo porque está asociado a una menor susceptibilidad al vuelco y a un mayor rendimiento. Para estudiar este carácter se construyeron líneas de sustitución cromosómica entre las variedades Mara y CappelleDesprez. Es decir, se obtuvieron distintas líneas de la variedad Cappelle-Desprez las cuales tienen alguno de sus cromosomas reemplazados por los de la variedad Mara. Mara es como 12 cm más baja que C-D (cuyo promedio de altura es de 103 cm de alto, ver ordenadas del gráfico). Observando el gráfico adjunto: a) ¿Qué clase de carácter es la altura? b) ¿Qué podría decir acerca de la cantidad y de la localización de los genes de altura de Mara? c) ¿Puede existir algún otro gen relacionado con altura que no esté siendo detectado por este análisis? d) ¿Podría sospechar algún efecto epistático para el carácter altura a partir de este análisis? e) ¿Considera que a partir del cruzamiento se podrían obtener líneas más bajas (o más altas) que estas variedades parentales (por segregación transgresiva)? f) ¿Serviría este método de utilización de líneas de sustitución para asignar una localización cromosómica a marcadores moleculares?

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13. GENÉTICA BACTERIANA
Bibliografia Microbial Genetics, D. Freifelder, Jones and Bartlett Publishers, Inc. Modern Microbial Genetics. Streps UN y Yasbin RE (1991) J Wiley Sons. ral de ágar, un polímero extraído de algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del ágar, de forma que los microorganismos no pueden moverse libremente y forman colonias aisladas. Los componentes solubles del medio difunden lentamente, por lo que disminuye considerablemente la competencia entre los microorganismos que comparten el medio de cultivo. El medio sólido se suele realizar en cajas de Petri (de varios tamaños y formas), o en frascos chatos (de Roux, utilizados para células tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una colonia, que en muchos casos, por sus características, permite la identificación del microorganismo que la generó. Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la proporción de un microorganismo determinado en una población heterogénea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma tal que aumente la proporción de aquellas para las cuales el medio de cultivo es adecuado. Es por ello que los medios de enriquecimiento son líquidos, de forma de facilitar la difusión de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen. El medio sólido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio líquido sirve para obtener masa (gran cantidad) de células, por ejemplo, para obtener plásmidos en forma preparativa. 4) ¿Qué diferencia un medio selectivo de medio diferencial. R: Un medio selectivo es aquél donde sólo crecerán determinadas cepas o especies. Es un caso extremo de medio de enriquecimiento, pero dado que la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios sólidos. Un ejemplo de medio selectivo es el que utiliza un antibiótico que sólo permite el crecimiento de las cepas resistentes. Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar al menos una de las distintas cepas/especies de una muestra. Los medios diferenciales son sólidos, para permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de forma tal que puedan distinguirse. El medio diferencial no impide el crecimiento, simplemente permite diferenciar. (ej. bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal). 5) Diferencie entre un medio completo y uno definido ¿Para qué los utilizaría? R: Medio completo es el que contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento pero no están bien definidos en su composición que puede variar levemente de partida a partida. Por ej. la triptona del medio LB es un hidrolizado de caseína con tripsina, el extracto de levadura es un extracto soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido, en cambio, contiene componentes y concentraciones de aminoácidos individuales y vitaminas (por ejemplo biotina para E. coli) perfectamente establecidos y constantes. 6) ¿Qué es la técnica de plaqueo en réplica (replica plating)? ¿Para qué sirve?

Guía de Estudio:
1) ¿Cómo es la estructura de una célula bacteriana? ¿Como está organizado su genoma? R: La célula bacteriana (gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplásmico y una pared celular, generalmente de péptidoglucano, que le otorga rigidez y protege de los “shocks” osmóticos. La membrana interna encierra al citoplama, separándolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maquinaria necesaria para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. La membrana interna es compuesta por una bicapa lipídica mayormente de fosfolípidos, mientras que la externa contiene una hemimembrana interna similar y una capa externa de lipopolisacárico. Las bacterias gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es más gruesa que la de las gram-. Si bien no existe un núcleo, como en las células eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que es una masa de ADN y proteínas (80% ADN), que puede ser observado por microscopía. El nucleoide contiene dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este grado de independencia sugiere que los dominos están asociados a una matriz que impide que se transfieran las tensiones entre ellos. El cromosoma bacteriano no está tan empaquetado como el de los eucariotas, pero se encuentra asociado a una serie de proteínas que cumplen funciones análogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF. En la mayoría de los casos conocidos, las bacterias poseen un único cromosoma circular que se replica en forma bidireccional. Pueden contener plásmidos grandes (el factor F o el plásmido Ti, por ejemplo, pueden llegar a tener 200 kpb y pueden servir como vectores para ingeniería genética: BAC). 2) ¿Cómo se multiplican las bacterias? R: Se reproducen asexualmente por división binaria (aunque no es la única forma). Es asexual y en los libros viejos se la llama fisión). Incluso las bacterias que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen asexualmente y son un ejemplo del fenómeno de diferenciación celular. 3) ¿Qué es un cultivo líquido? ¿Y uno sólido? ¿Para qué se utiliza cada uno? R: Medio de cultivo líquido: es un medio que no tiene soporte sólido, donde los microorganismos crecen en suspensión y los nutrientes difunden libremente, por lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos. El medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos de ml) o en fermentadores de varias escalas. Medio de cultivo sólido: difiere del líquido en el agregado de una matriz inerte que sirve de “sostén” para el crecimiento bacteriano. Esta “matriz” es por lo gene-

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R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de una caja de petri un número de colonias, cada una de las cuales proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo, existe la posibilidad de “replicar” dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con la misma distribución de colonias, cada una de las cuales debe ser genéticamente idéntica a la de la placa madre. Para ello se usa un trozo de terciopelo estéril, que cubre un lado de un cilindro del diámetro de la caja de petri. El cilindro se coloca suavemente sobre la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo con las colonias. Algunos microorganismos de cada colonia quedarán adheridos al terciopelo, y este se usa a la manera de un “sello” en una caja de petri vacía. En esta última, crecerán colonias idénticas a las originales, en la misma posición. Podríamos evaluar, por ejemplo cuales son resistentes a un antibiótico determinado, con lo que bastaría con preparar una placa con dicho antibiótico y hacer la réplica a dos placas, una con y otra sin antibiótico. 6) ¿Qué es una placa (playa o calva) de lisis? R: La difusión limitada que se observa en los medios sólidos también puede ser utilizada para estudiar fagos (virus) bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecerán cubriendo toda la superficie, lo que llamamos “césped”. Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias con una suspensión diluída de fagos, éstos infectarán y lisarán las bacterias y en la superficie del ágar se observará un halo translúcido por cada fago infectivo como consecuencia de la lisis localizada de bacterias. Es decir, las bacterias son el “medio de cultivo” de los fagos. Esto no sólo permite titular (contar) suspensiones de fagos, también permite trabajar con ellos en forma análoga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un método análogo para estudiar virus animales, aunque eso se hace sobre monocapas de células en cultivo. Para obtener un número bajo y cuantificable de placas se requiere mezclar un exceso de bacterias con una cantidad mucho menor de viriones (a esto se le llama baja multiplicidad) de manera que la probabilidad de que 2 partículas virales distintas penetren en la misma célula sea insignificante. Después se plaquean las células sobre la caja de Petri. 7) ¿Qué se entiende por "sexo" en organismos procarióticos (¡NO en eucarióticos!)? R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformación, a través: bacterias muertas que actúan como “machos” (donantes); transducción, a través de sus virus; conjugación: a través de plásmidos y estructuras de secreción que conforman puentes celulares. 8) Describa brevemente el mecanismo de conjugación. ¿Siempre se observa transferencia de información genética cromosómica?

R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plásmido conjugativo (históricamente denominado Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugación es el mecanismo por el cual una bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El mecanismo es similar al de replicación por círculo rodante (rolling circle). Primero se genera un corte (nick) en una de las cadenas, más precisamente en la región conocida como oriT, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la transferencia de una de ellas. La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa (plásmido, por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia cromosómica). En el caso de los plásmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el oriT y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. Además del oriT, los plásmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra. Estos genes codifican para el “pilus” que es una estructura que protruye de la bacteria dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formación de complejos de secreción tipo III. Además del pilus, otros genes tra codifican para proteínas que no tienen un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa .Otro tipo de plásmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos plásmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero sí contienen la región mob, que permite que los genes tra de un plásmido transmisible puedan actuar en trans para transferir a los plásmidos movilizables. La región mob contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa. En el caso más común, sólo se transfiere una copia (en general completa) del plásmido (ej. factor F) por lo que la célula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay tranferencia de genes cromosómicos ni, por lo tanto, aparición de recombinantes para genes crosomales; a menos que estos se encuentren transpuestos en el Factor F (sexducción), lo que no es muy común. Esta forma de “apareamiento” permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes como pueden ser los genes de resistencia a antibióticos que pueden ubicarse en plásmidos por la susodicha transposición. Se observa transferencia de ADN cromosómico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexducción (factor F recombinado = F’ conteniendo algún gen cromosomal). 9) ¿Cuál es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+? R: Hfr proviene de “High frequency recombination”. El plásmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y codifica para los genes tra que lo hacen transmisible,

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manteniendo en general una copia por célula. Las cepas F+, son las que contienen el plásmido F como episoma. Como el plásmido F tiene algunas secuencias homólogas a secuencias cromosómicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos de recombinación, donde el plásmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y los genes tra siguen siendo funcionales, y promueven la transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosómica es la causa de la alta frecuencia de recombinación de estas cepas y de allí su nombre Hfr. La cointegración del plásmido (la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec A combinada con recBCD) entre el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias homólogas, usualmente transposones duplicados en ambos ADNs o, más raramente, como producto de una transposición sin resolución). Resolución quiere decir: separación de los 2 círculos cointegrados después de que se produjo la copia o transferencia del transposón entre el círculo de ADN dador al receptor). 10) ¿Qué es un F' y cómo se origina? R: Un F’ es un plásmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosómico. Cuando un plásmido F se escinde de una cepa Hfr (resolución), en general ocurre por recombinación entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integración). Hay casos en que los eventos de recombinación ocurren entre secuencias más lejanas (otros elementos IS o secuencias homólogas) y el plásmido que se escinde es mayor que el original y contiene el fragmento cromosómico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plásmidos F se denominan F’. También se pueden generar plásmidos F’ por otros mecanismos como ser la transposición.Un F’ es una forma “natural” (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmídico, sin uso de enzimas de restricción, muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un virus-que es, al mismo tiempo, un transposón llamado fago μ. 11) ¿Cómo determinaría orden y distancia entre genes utilizando la técnica de "apareamiento interrumpido"? R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el oriT. Puede llevar más de una hora y media la transferencia completa, lo que generalmente no ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora. Dado que en la suspensión, la interrupción de la conjugación ocurre durante todo el proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT. La frecuencia de recombinación para un marcador es entonces una medida de la distancia al oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparición de los dobles recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos).

Por lo tanto, se hace cronometrando la aparición de recombinantes en una conjugación entre una Hfr y una F-que se interrumpe artificialmente con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos diferenciables de los genes a estudiar. 12) Algunos bacteriófagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explíquelos y ejemplifique. ¿Qué es un profago o un provirus? R: Existen fagos en los cuales el proceso de infección puede tomar por dos vías antagónicas, lisis o lisogenia. En el ciclo lítico, la funciones tempranas y tardías codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran número de partículas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisogénico, la mayor parte de los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado profago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria. Hay procesos externos, como el daño al ADN que producen la activación del ciclo lítico. Esta cointegración puede ser mediada por enzimas de recombinación codificadas por los virus como es el caso de la integrasa del fago λ que, a diferencia de la recombinasa del huésped, produce recombinación específica de sitio (una secuencia de ADN llamada attB, presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como esto es muy distinto a la recombinación homóloga tradicional, se lo denomina recombinación ilegítima. El virus HIV (y otros retrovirus eucarióticos) también tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es más complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transducción de oncogenes entre células eucarióticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias). 13) Compare transducción generalizada y especializada. R: En la transducción, un bacteriófago (virus) transfiere DNA desde la bacteria en la cual se reprodujo a la bacteria que infecta. El virus debe tener la característica de no producir la lisis del hospedero al cual transfiere el material genético, es decir la partícula viral debe ser defectiva. Existen diferentes tipos de transducción, ellas son: Los fagos que las realizan tienen estrategias diferentes de encapsidación. Los fagos que permiten la transducción generalizada (por ej. P1) no son capaces de reconocer específicamente el ADN que encapsidan por lo que son capaces de transducir cualquier segmento de ADN cromosómico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente, pueden transferir cualquier segmento cromosómico del tamaño apropiado. Es decir, que es aquella en que cualquier porción del genoma del hospedante del virus puede hacerse parte de la partícula viral madura reemplazando al ADN viral. Transducción Especializada o Restringida. Se define a ésta cuando el virus sólo puede transferir determinados genes bacterianos cercanos a su sitio de integración genómica.

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Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden pasar por una fase lisogénica (por ej. el fago λ) integrándose en un sitio preciso del genoma (entre los operones gal y bio en el caso de λ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo secuencia cos del fago λ) por lo que sólo son capaces de transportar genes vecinos al sitio de integración que accidentalmente permanecen unidos al genoma viral en el entrecruzamiento que se produce al resolver el cointegrado (como primer paso hacia la activación de la fase lítica). Además, en la t.g. el segmento de ADN donante se incorpora por recombinación homóloga reemplazando al alelo nativo (la célula sigue siendo monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra como si fuera un profago y se produce un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un cuadro. 14) Cómo sería afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa bacteriana rec-(deficiente en los sistemas de recombinación celulares) al infectarla con un lisado transductor de el bacteriófago λ? ¿y por el fago P1? R: La inducción del fago λ requiere de la proteína RecA. RecA se activa por daño cromosómico (por formación de ssDNA que es sustrato de RecA) y, a su vez, esta interactúa con el represor del ciclo lítico. Esto produce la derrepresión de las funciones líticas y el ciclo lítico comienza. El fago λ se integra como profago al genoma bacteriano en sitios específicos, attB. Requiere además funciones celulares como IHF y la integrasa que es una recombinasa específica de secuencia (la secuencia attB) de λ, pero NO requiere RecA. Esto implica que no se vería afectada la capacidad de transducir si la cepa aceptora es RecA-. En el caso del fago P1, la capacidad de transducción se vería afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosómico de la cepa dadora que tienen que recombinar con las porciones homólogas de la cepa aceptora. 15) ¿Pueden recombinar los virus entre sí? ¿Qué mecanismos están involucrados? R: Sí. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinación homóloga usando las enzimas de la célula huésped. En los virus a ADN de simple cadena, la recombinación puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinación en virus a ARN cuya explicación excede lo que se pretende enseñar en la materia. 16) Describa algunas aplicaciones de la utilización de fagos para la ingeniería genética. R: El fago λ es un vector ampliamente utilizado en ingeniería genética en el que el ADN conteniendo los genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es “transducido” sin posterior lisogenización a bacterias (que no tienen otra opción que ser lisadas) para su clonado molecular, conservación y multiplicación.

Genes de λ salvaje En λ recombinante lisis lisogenia lisis lisis inserto lisis 17) ¿Qué es la transformación bacteriana? ¿Se logra únicamente en forma artificial o también ocurre en poblaciones naturales? R: La transformación bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra en condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son competentes para la transformación. La competencia puede ser natural, lo que se observa en algunas especies o puede ser inducida en laboratorio. La transformación natural implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la célula receptora después de un “reconocimiento” por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo alélico en las colonias recombinantes. En la transformación artificial (también llamada transfección), las células son forzadas a permeabilizar el ingreso de ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo un plásmido) mediante mecanismos artificiales. E. coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por transformación en la naturaleza y es la bacteria que más se transforma (= transfecta) en el laboratorio. Se puede esquematizar en un cuadro. 18) ¿Se pueden mapear genes por transformación? R: Sí; en forma similar a la transducción, la eficiencia de cotransformación es una medida de la cercanía de dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transducción, la transformación es útil para los mapeos finos. Al igual que en la transducción generalizada, el % de cotransformación de 2 genes es inversamente proporcional a su distancia. Estos métodos de mapeo genético en bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por métodos de mapeo físico por lo que se les prestará menor importancia a la que se le da en los libros de texto. 19) El gráfico muestra el resultado de un experimento de apareamiento interrumpido entre las siguientes cepas de E. coli: Hfr: a+ b+ c+ d+ strps X F-: a- b- c- d- strpr

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c + strpr a + strpr

d + strpr b + strpr 5 10 15 20 Min.
a) Defina en forma precisa a las variables del eje X y del eje Y. b) ¿Por qué algunos marcadores alcanzan valores de frecuencias más altos que otros? c) Deduzca el orden y la distancia genética en minutos. ¿Qué puntos de la curva utilizó? d) ¿Cuál es la utilidad de la resistencia a antibiótico que posee la cepa receptora?

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R: a) eje x: número de recombinantes / 100 bacterias Hfr; eje y: tiempo en minutos, posterior a la mezcla de los parentales. b) Frecuencia mayor: más próximos al origen de transferencia. Los marcadores que entran antes están representados en una proporción mayor de recombinantes ya que tuvieron más tiempo para integrarse. c) orden c a d b tiempo 3’ 4’ 9’ 14’punto donde cruza eje x (y=0) 3’ es el tiempo al cual se transfiere el primer marcador d) distinguir recombinantes a+ b+ c+d+ str R de los parentales Hfr a+ b+ c+ str s. Elimina a cepa dadora. 20) En la húmeda profundidad de la Baticueva, el Hombre Murciélago intenta olvidar su desengaño amoroso con una famosa reportera de Ciudad Gótica mapeando una cepa bacteriana hilarante desarrollada en los laboratorios secretos del Guasón. Mientras Alfred le acerca un sabroso vaso de leche cultivada con una bacteria probiótica genéticamente modificada, el encapotado contempla los datos proporcionados por la BatiPC:
Resultados de la transferencia por conjugación de material genético en secuencias diferentes. Se indica tiempo de entrada en un receptor F- (dador Hfr):

niegan su transgenicidad (fueron obtenidos por mejoramiento convencional y no por ingeniería genética).

Problemas: 1) Bitácora de vuelo: fecha espacial 1654.9. Habla e1
capitán Kirk. Toda la tripulación del Enterprise sufre una diarrea infernal. E1 señor Spock afirma que se trata de una extraña bacteria intestinal proveniente de la tercera luna del cuarto planeta de la segunda estrella del sistema Papanópulos XXXIII. Sospecho que la bacteria fue introducida involuntariamente por el señor Cheko después de la última visita a su novia en Nueva Creta. En el tiempo que le queda libre después de repartir pastillas de carbón, el doctor McCoy logró identificar cuatro genes implicados en la regulación de un sistema enzimático. También aisló una mutante: Fa-,b-,c- y d- StrR, la cual normalmente da revertantes a+, b+, c+ o d+ a una frecuencia aproximada de 1 colonia revertante por cada 107 células sembradas en el medio selectivo correspondiente. Con esta cepa aisló un clon con las mismas auxotrofías (a-b-c-d-) y con la misma tasa de reversión hacia a+ y d+ pero con una frecuencia de aparición de revertantes c+ y b+ reducida a niveles no detectables. Se utilizó esta cepa como receptora en un experimento de apareamiento con la Hfr a+ b+ c+ d+ StrS. La figura muestra los resultados obtenidos usando medios selectivos que carecen de a, b, c o d. c + strpr N° recomb.

genes ja je ji jo tiempo 15 21 32 48 genes ju ji jua jo jue 57 2 tiempo 10 17 22 33 genes jui juo juu ay jo jua 11 33 48 49 60 3 tiempo 6 genes juo jui ja ju 4 tiempo 18 23 35 45 ¿Podrá Bruno Díaz construir un mapa genético que incluya todos estos hilarantes marcadores y señalar la distancia de tiempo entre genes adyacentes? No se pierda la continuación de este batiapasionante capítulo, a la misma batihora, por el mismo baticanal y en la misma batimateria. R: JA JE JU JI JUA JO AY JUU JUE JUO JUI y, dando la vuelta, de nuevo JA. De una forma similar a esta se demostró por primera vez la circularidad del genoma de E. coli. Era la única forma de justificar resultados como éstos. Nota sobre el enunciado: las bacterias probióticas (tipo la Lactobacillus casei del Actimel) suelen producir una modificación favorable o reconstitución de la flora bacteriana intestinal (por ejemplo por cambio del pH intestinal). No hay evidencia científica clara de que produzcan ninguno de los efectos que muestra la publicidad. Es más, este tipo de publicidad está prohibida en la mayoría de los países del primer mundo. Algunas bacterias del yogur (como el famoso Lactobacillus G de origen francés que comercializa La Serenísima) están genéticamente modificadas e incluso contienen genes de resistencia a antibióticos, aunque fueron obtenidos por mecanismos de genética bacteriana (como en los ejercicios de esta guía “ingeniería genética” in vivo) por lo que las legislaciones no los consideran OGMs y los fabricantes (y los ecologistas)

cepa 1

b+ c+ d+ 10 20 30 40 min. Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+ de las placas de 30 minutos y se ensayó su genotipo para los otros dos marcadores. Los resultados se resumen en la tabla. Explique los resultados. 2) Cuando Sledge d+ b+ c+ Hammer le dijo al 93 93 capitán Tronk: d+ ----95 ----100 -Confíe en mi, sé b+ exactamente lo que c+ 92 100 ---hago-, a la teniente Dureau se le erizaron los pelitos de la nuca. Entonces Sledge se encerró durante siete días en el laboratorio del cuartel (después de desalojar a punta de revólver al médico forense). Cuando salió, Sledge anunció que había resuelto el misterioso caso de los coliformes mutantes. Más tarde, en una ronda de prensa sensacionalista, Sledge declaró: - Bueno, se trataba de un aislamiento de la cepa bacteriana Mágnum 44 la cual es Hfr y StrS y, lo que es más grave, completamente salvaje. De este condenado germen, aislamos un engendro mutante (F-StrR arg-lac-). La cuestión es que conjugué ambos demonios pero interrumpiendo su disgustante orgía a distintos tiempos con lo que logré

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hacerles confesar lo más íntimo de sus genes sometiéndolas a un medio con estreptomicina y suplementados como se indica en la tabla, con el sencillo trámite de contar el número de colonias al día siguiente. Con esto queda demostrado, una vez más, que el crimen es la N° de colonias observadas en profesión menos t (min) lac glu arg+lac arg+glu paga des1 0 0 0 500 pués de la 5 0 128 0 491 de Estu 10 40 201 58 509 diante de 15 80 199 127 498 Biología. 20 82 203 139 504 a) ¿A qué distancia del operón lac mapea el origen de transferencia en la cepa Hfr usada? b) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que crecen en los distintos medios? c) ¿Porqué los valores de la primer columna son menores que los de la tercer columna? d) ¿Qué estrategia se podría seguir para clonar el gen (salvaje) involucrado en la síntesis de arginina cuya versión defectuosa está en la cepa F-? 3) Se realizó una coinfección en medio líquido (a alta multiplicidad –densidad- de fagos y sobre una cepa sensible), con dos fagos T4 mutantes: T4m- (playas pequeñas) y T4tu (playas turbias). Una alícuota del lisado resultante fue usada para infectar (a baja multiplicidad de infección) nuevas bacterias de la misma cepa y se obtuvo un 7% de playas grandes y claras (salvajes). ¿Qué porcentaje de playas pequeñas y turbias se habrá obtenido? 4) Teodorico Snopolsky se abocó a una tarea que le había quitado el sueño durante la mayor parte de su vida: obtener bacterias que sintetizaran whisky y gi-

nebra. A continuación se reproduce una página del cuaderno de Snopolsky, encontrado por unos expedicionarios groenlandeses: Anotación N° 12.506: Para transformar una cepa bacteriana incapaz sintetizar whisky (whi-) y ginebra (gin-) usé, por una parte, una mezcla de ADN de dos cepas. Una whi+ gin- y la otra whi- gin+ y, por otra lado, e1 ADN de una cepa whi+ gin+. Obtuve clases transformadas en las siguientes proporciones:
ADN donante whi+ ginwhi- gin+ whi+ gin+ whi- gincepa receptora whi- ginclases transformadas whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ N° colonias 248 175 3 315 201 382

¿A qué se debe la aparición de un mayor número de colonias transformadas whi+ gin+ en el segundo caso?
5) Uno de los objetivos de la microbiología es “construir” microorganismos recombinantes para que actúen como “remediadores” del medio ambiente dentro de un ecosistema contaminado, y que al terminar su función se autodestruyan. Existe un compuesto tóxico, 3-metil-benzoato (3MB) que es catabolizado por la bacteria Pseudomonas putida. Los genes responsables del catabolismo del 3MB están organizados en un operón dentro de un plásmido denominado TOL. Los genes de este operón están regulados positivamente en presencia de 3MB. Construya, mediante conjugación, una cepa de Pseudomonas putida capaz de destruir al 3MB presente en un lago contaminado, y que esta cepa se autodestruya luego de eliminar el contaminante. Se dispone de los siguientes elementos:

(1) a (4) cepas de P. putida: TOL
operón Trp

TOL

TOL
p3MB ß-gal

TOL
p3MB lacI

(1) Δlac; Δleu / pTOL / pOperón Trp

(2) leu- / pTOL

(3) leu / pTOL / p[p3MB-ß-gal]; kmR (I) Δleu; ala-; mob+; tra+ (en el cromosoma)

(I) y (II) cepas de E. coli

(4) Δlac; Δleu / pTOL / p[p3MB-lacI]; kmR (II) Δleu; ala-/ pRK2013 (mob+; tra+; bom+; kmR)

(A) a (C): Plásmidos que poseen origen de replicación de amplio rango de huésped (funciona en Pseudomonas y Escherichia), contienen un gen de resistencia a ampicilina y las siguientes características:

I

II
pRK2013

leu+
A

leu+ bom
B

leu bom
C

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plac gef
- p3MB-βgal: promotor del operón que cataboliza el 3MB a 5’del gen de la enzima ß-galacosidasa. - p3MB-lacI: promotor del operón que cataboliza 3MB a 5’del gen del represor del operón lactosa. - Δlac y Δleu: La Δ (delta) significa que lo que sigue está delecionado (operón lac o leu, en este caso la deleción involucra también al gen del represor I). - tra: genes de transferencia del plásmido F - mob: endonucleasa que corta en la región bom - bom: origen de transferencia del plásmido F - ptrp : promotor operón triptofano (otro distinto) - plac: promotor del operón lactosa - gef: es un “gen suicida”, es decir que codifica para una proteína que produce la muerte de la bacteria cuando se expresa. Guía teórica 1. ¿Qué se entiende por determinación sexual y diferenciación sexual? R: Determinación sexual: sistemas biológicos que determinan el desarrollo de las características sexuales de un organismo (determinación cromosómica, génica, por nivel de ploidía o ambiental) Diferenciación sexual: procesos necesarios para alcanzar las características sexuales previamente “determinadas” 2. ¿Qué son los cromosomas sexuales y en qué grupos taxonómicos se los encuentra? R: Son los cromosomas que determinan genéticamente el sexo. Se encuentran muy distribuidos en insectos, mamíferos, aves y plantas dioicas. 3. ¿Qué se entiende por región pseudoautosómica (PAR)? Solución: región de homología y apareamiento entre los cromosomas sexuales 4. Los genes relacionados con la diferenciación sexual ¿están ubicados exclusivamente en los cromosomas sexuales? Explique R: Nooo!! Sólo es necesario que se localicen allí los genes regulatorios codificantes para los factores de transcripción maestros que disparan el proceso que se describe en los libros. Existen muchos genes importantes para el sexo (incluso los que codifican para cosas tan importantes como son las hormonas sexuales) que se localizan en los autosomas y pueden verse influidos por los cromosomas sexuales. 5. A la inversa, ¿pueden existir genes que no tienen nada que ver con el sexo localizados en los cromosomas sexuales? Explique. R: Sí, el gen que determina la presencia de pelos en el borde de la oreja, se encuentra en la región diferencial del cromosoma Y.

ptrp gef

plac gef

a) Diseñe una estrategia para construir (mediante conjugación) la cepa de Pseudomonas putida que sea capaz de metabolizar el contaminante 3MB y que luego se autodestruya, indicando cuáles cepas y plásmidos elige y cómo se selecciona la bacteria de interés. b) Justifique las/los que descarta. c) Esquematice mediante un gráfico la curva de crecimiento (número de bacterias en función del tiempo) y el número de bacterias en función de la concentración de 3MB. Considere t=0 al lago conntaminado en el momento del agregado de las bacterias limpiadoras. d) ¿Por qué se debe evitarel escape de la bacteria limpiadora al medio ambiente? 6. ¿Cómo se comportan, en relación con las leyes de Mendel, los genes que se encuentran en los cromosomas sexuales? R: Su herencia difiere de la de los genes ubicados en los autosomas, ya que los alelos se heredan asociados con el sexo de la descendencia. La misma está influida, a su vez por hemicigosis (genes del cromosoma Y), heterocromatinización (genes del cromosoma X), etc. 7. ¿Qué diferencia existe entre genes LIGADOS, caracteres LIMITADOS a un sexo e INFLUIDOS por el sexo? R: Los genes ligados al sexo, son aquellos que se encuentran en la región diferencial de los cromosomas sexuales (ligados al X o Y). Los caracteres limitados a un sexo, son aquellos que se expresan solamente en un sexo aunque los genes que los determinan estén presentes en ambos (ej. distribución facial del vello en hombres). Los caracteres influidos por el sexo, se expresan en ambos sexos pero con diferente relación de dominancia (ej. el alelo que determina la calvicie humana, es dominante en hombres y recesivo en mujeres) 8. ¿En qué consiste la determinación del sexo por equilibrio génico? R: En Drosophila melanogaster, el sexo está determinado por la relación: cromosoma X/conjunto de autosomas. Siendo 1 la relación que determina hembras y 0,5 la que determina machos. 9. ¿Cuál es el mecanismo de determinación sexual en humanos? R: En humanos el sexo se determina cromosómicamente, siendo el cromosoma Y el determinante masculino (portador del gen SRY, factor determinante del desarrollo de los testículos). 10. ¿Qué es la compensación de dosis génica en mamíferos?. ¿Qué establece la hipótesis de Lyon? Dé

14. GENÉTICA DEL SEXO

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una evidencia citológica y una genética de la compensación de la dosis. R: La compensación de la dosis es el mecanismo mediante el cual se iguala, en ambos sexos, la actividad de los genes que se encuentran en el cromosoma X. Hipótesis de Lyon: en mamíferos, la compensación de la dosis ocurre por inactivación, al azar, de uno de los cromosomas X de las hembras (heterocromatinización). El corpúsculo de Barr es la evidencia citológica de esta inactivación. Una evidencia genética puede obtenerse analizando la expresión de Glu6Pdeshidrogenasa en hembras heterocigotas. 11. ¿Cuál es el mecanismo de compensación de dosis génica en Drosophila? R: La compensación de la dosis ocurre por hiperactivación del cromosoma X de los machos. 12. ¿En qué consiste el mecanismo de determinación del sexo por haplodiploidía? ¿En qué grupos taxonómicos se encuentra? R: En este sistema, la determinación del sexo depende de la dotación cromosómica de los individuos, siendo las hembras diploides y los machos haploides. Se encuentra en los himenópteros (abejas, hormigas, termitas) 13. ¿Qué mecanismos de reproducción permiten perpetuar un genotipo mas allá de la existencia del individuo? ¿Conoce alguno que implique la producción de semillas? R: Apomixis Problemas: 1) En los embriones de los mamíferos, la presencia del cromosoma Y determina el desarrollo de testículos y genitales externos masculinos. En 1990 se clonó un fragmento de 14 kpb del cromosoma Y que contiene todo el gen determinante del sexo, al cual se lo llamó Sry (Sex Reversal Y, es decir, revierte el sexo). Como era previsible para un gen regulatorio, Sry codifica para una proteína (SRY) que contiene un dominio de unión al ADN, la misma actúa en el conducto genital precursor de los testículos y el comienzo de la expresión es alrededor de 10 a 12 días post-coito o postreimplantación. Con la intención de obtener ratones transgénicos, se inyectaron óvulos fecundados con una solución acuosa conteniendo el gen Sry clonado. Las cigotas fueron reimplantadas en madres adoptivas seudo-preñadas. Se obtuvo una camada de 93 crías nacidas (machos y hembras). Para determinar rápidamente qué ratones de la camada eran transgénicos, se obtuvo ADN genómico de trozos de cola de toda la camada, y se realizó un Southern-blot con 2 sondas radioactivas. Sonda A = fragmento del gen Sry clonado, revela una sola banda de 3,5 kpb. Sonda B = fragmento del gen Zfy, revela dos bandas de 11 kpb y 5 kpb. El gen Zfy es un gen del cromosoma Y, localizado lejos de Sry y por fuera del fragmento de 14 kpb. a) Dibujar las bandas que se observarían en un Southern hecho con ADN genómico de las crías e hibrida-

do simultáneamente con las sondas A y B. Considere todos los resultados posibles. b) Gracias a estudios previos con cepas de ratones con anomalías cromosómicas, se sabe que la presencia de más de un cromosoma X en el ratón macho, siempre da por resultado esterilidad. ¿Cuáles de las crías obtenidas serían fértiles y cuáles estériles? c) Proponga otras metodologías para la detección de los ratones transgénicos. 2) En un laboratorio de genética de Drosophila melanogaster, se obtuvo por irradiación una población A con alteraciones en la gametogénesis tanto de hembras como de machos, la misma consistía en fallas meióticas durante anafase II. Como resultado de estas anormalidades se observó, por un lado, no disyunción de todo el complemento cromosómico, con la consecuente producción de gametas completamente no reducidas y, por el otro, no reducción de cromosomas sexuales, produciéndose gametas parcialmente no reducidas. Este tipo de gametas se encontraba en una frecuencia elevada, pero también aparecieron gametas normales. Con el objetivo de estudiar la viabilidad y capacidad de fecundación de estas gametas, se realizaron cruzamientos entre hembras y machos de la población A, y se analizaron todos los descendientes obtenidos. Considerando que las gametas pueden fecundarse totalmente al azar, prediga el complemento cromosómico de toda la descendencia posible y su fenotipo sexual. 3) En humanos, el gen Sry (localizado en el segmento diferencial del cromosoma Y) determina masculinidad. Qué fenotipo sexual, y cuántos corpúsculos de Barr presentarán los siguientes individuos: a) 46, XY; b) 47, XXY; c) 45, X 4) Supongamos que una determinada enzima dimérica A, cuyo locus se encuentra en el segmento diferencial del cromosoma X, interviene tanto en el metabolismo de Drosophila como en el del ratón, y que en ambos casos dos variantes moleculares de dicha enzima están codificadas por los alelos A1 y A2. El genotipo de los individuos es distinguible por electroforesis según el siguiente esquema:

A1A1 + -

A2A2

Se hace el siguiente experimento, tanto en Drosophila como en ratón. A partir de un tejido adecuado de una hembra heterocigota A1A2 se obtiene un cultivo celular primario y de este 10 subcultivos unicelulares. ¿Qué patrones electroforéticos se obtendrán en los siguientes casos? a) Cultivo primario de Drosophila. b) Subcultivos de Drosophila. c) Cultivo primario de ratona. d) Subcultivos de ratona. 5) En el ratón existen dos sistemas enzimáticos cuyos productos son detectables en los glóbulos rojos. Los mismos están determinados por las parejas alélicas A,a y B,b, cuyos loci respectivos están situados en el

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segmento diferencial del cromosoma X. Unas hembras diheterocigotas (hijas de machos que presentaban las enzimas A y b) se cruzaron con machos AB, obteniéndose la siguiente descendencia masculina: AB:34; ab:26; Ab:67; aB:73. Teniendo en cuenta la hipótesis de Lyon, de los ocho tipos de hembras que se señalan en la tabla, ¿Cuáles serán las hermanas de los machos antes indicados? ¿Con qué frecuencia aparecerá cada una? Porcentaje de góbulos rojos con Tipo de las enzimas que se indican Hembra AyB Ayb ayB ayb 100 1 2 3 4 5 6 7 50 50 50 50 50 50 50 50 25 25 25 25 100

50 50 8 6) Ni el Zar Nicolas II ni su esposa la Emperatriz Alexandra tenían la enfermedad conocida como hemofilia, caracterizada por estar ligada al sexo. Su hija, la princesa Anastasia, tampoco la tenía, pero el Zarevich Alexius, su hermano, sí. ¿Podria Anastasia haber sido portadora de la hemofilia? Si se hubiese casado con su primo Henry, que era hemofílico, alguno de sus hijos o hija ¿habrían sido hemofílicos? 7) Es de conocimiento popular que todo gato de 3 colores es gata (hembra). A este tipo de gatos se los llama calico. Se sabe que el pelaje blanco presente en sectores o mosaicos proviene de un gen independiente del que produce pelaje naranja o negro. Se realizaron dos cruzamientos: 1) Macho blanco y negro x Hembra blanca y naranja 50% machos blancos y naranjas 50% hembras tricolores 2) Macho blanco y naranja x Hembra blanca y negra 50% machos blancos y negros 50% hembras tricolores a) ¿Cuál es el indicador más evidente de la ausencia de herencia mendeliana? b) ¿Por qué gatos machos no tienen nunca 3 colores? c) Explique la base genética de este comportamiento. d) ¿Cómo sería el resultado de cruzar una hembra tricolor por un macho blanco y negro? 8) ¿Es posible que, en los humanos, un gen mutante recesivo esté localizado en el cromosoma X, si una

mujer que presenta el rasgo recesivo y un hombre normal tienen un hijo varón normal? Explique. 9) En la especie humana la presencia de cierto mechón de pelo blanco es un caracter influido por el sexo, dominante en el hombre y recesivo en la mujer. La protanopia (tipo especial de ceguera al color rojo) está determinada por el alelo recesivo de un gen situado en el segmento diferencial del cromosoma X. Un hombre con mechón blanco y visión normal, cuyo padre carecía de dicho mechón, tiene descendencia con una mujer sin mechón y con visión normal, cuyo padre carecía del mechón y tenía protanopia, y cuya madre tenía el mechón. a) Qué proporción de los descendientes serán hembras con mechón blanco y visión normal? b) Qué proporción de la descendencia serán machos con mechón blanco y protanopia? 10) En la mariposa trébol todos los machos son amarillos, en cambio las hembras pueden ser amarillas si tienen el genotipo homocigota AA, o blancas si poseen el alelo (A'_). Sin tomar en consideración el sexo, qué proporciones fenotípicas pueden esperarse en F1 de la cruza AA' x AA'?

15.- HERENCIA DE ORGANELAS
Guía teórica: 1) ¿Qué es la HERENCIA materna (también llamada uniparental, citoplasmática o extranuclear) y cómo se diferencia de la INFLUENCIA materna? ¿Cuál es su base genómica? ¿Mediante qué mecanismos se multiplican las organelas? R: Herencia materna: genes presentes en organelas con un modo especial de herencia, la progenie hereda los genes de las organelas de uno de los progenitores (herencia uniparental), en la mayoría de los casos de la madre. Debido a que las organelas se encuentran en el citoplasma y que en la formación del cigoto el principal aporte citoplasmático proviene del huevo u óvulo es que las organelas se transmiten por vía materna, también se utiliza el término “herencia citoplasmática”. Además debido a que el ADN de las organelas se encuentra fuera del núcleo también se lo denomina “herencia extranuclear”. Influencia materna: Diferencias en el fenotipo causadas por componentes citoplasmáticos presentes en las gametas. Nuevamente debido a que el principal aporte citoplasmático proviene de la madre es que se lo denomina “influencia materna”. Los componentes citoplasmáticos pueden ser proteínas u otros factores que influyen en el fenotipo del cigoto pero no en su genotipo. Pueden perderse los efectos de la influencia materna luego de una generación si el genotipo del cigoto no posee los genes que codifican para dichos componentes. 2) Explique la organización genómica de mitocondrias y cloroplastos, tomando como base mitocondrias de humanos, levaduras y cloroplastos de plantas superiores. ¿Diría Ud. que su evolución fue lenta o rápida comparada al genoma nuclear? Si dependiera del caso, ejemplifique.

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R: La organización genómica de mitocondrias y cloroplastos es significativamente diferente del ADN nuclear. Ambas organelas se originaron por transferencia horizontal que involucró eventos de endosimbiosis donde células eucariotas adquirieron el genoma bacteriano intacto (ver siguiente pregunta). Cloroplastos: Genoma circular que no posee histonas ni otras proteínas cromosomales presentes en el ADN nuclear. Muchas de las proteínas utilizadas en la fotosíntesis están codificadas en el ADN de los cloroplastos. Comparado con el ADN nuclear vegetal la tasa de evolución es ¼ más rápida (menor velocidad de cambios que las mitocondrias). Mitocondrias: genoma circular que no posee proteínas cromosomales. Las mitocondrias de plantas, hongos y animales difieren en estructura, composición, tasa de evolución y modo de herencia (ver tabla). Tabla. Características del ADN mitocondrial
Plantas Tamaño del Extremadagenoma mente variable (300kb a 2400kb en una misma familia) Estructura Variable, circular o lineal Información rRNA, tRNA, proteínas ribosomales, proteínas involucradas en respiración Presencia de No, pero intrones abundantes regiones no codificantes Modo de Variable, prinherencia cipalmente materna Tasa de dilenta vergencia de secuencia comparada con el correspondiente ADN nuclear Hongos Animales Muy variable Pequeñas y (26,7kb a poco varia115kb en as- bles ≈ 16kb comycertes filamentosos) circular circular rRNA, tRNA ,proteínas ribosomales, proteínas involucradas en respiración Si rRNA, tRNA, proteínas involucradas en respiración No, pocas regiones no codificantes materna rápida

Cualquiera de los dos parentales media

3) ¿Qué origen evolutivo tienen estas organelas? ¿Es el mismo monofilético o polifilético? Explique la teoría de Margulis. R: Una de las principales hipótesis es el origen endosimbiótico (Margulis 1970; 1993). La idea es que las organelas se originaron a partir de bacterias que vivieron como simbiontes internos de las células eucariotas primitivas. La secuencia de los genes de las organelas apoyan esta hipótesis siendo similares en secuencia a los genes bacterianos. Los genes mitocondriales son similares a los genes presentes en proteobacterias y los genes de cloroplastos similares a los presentes en cianobaterias. En el caso de los cloroplastos el origen es polifilético ya que cloroplastos de algas tienen un origen diferente que los cloroplastos de plantas supe-

riores, en el caso de las mitocondrias se encuentra en discusión. 4) Hace unos 10 años una noticia “sacudió los titulares”Eva (sí, la de Adán y Eva) fue negra y vivió hace 200.000 años. ¿En qué se basó el periodista?¿Por qué ignoró olímpicamente al pobre Adán?¿Era feminista? R:La noticia se basaba en la reconstrucción filogenetica de la evolucion humana mediante la secuenciacion de regiones nocodificantes de ADN mitocondrial. Los árboles obtenidos sugieren un orgen africano de la especie humana. Se calcula que el ancestro común a todos los ADN mitocondriales presentes vivió hace 166000 y 249000 años. Los criterio empleados fueron: 1) asumir que las mutaciones en el genoma mitocondrial se acumlan a tasa constante; 2) utilizar secuencias de chimpancé de manera comparativa; 3) usar estimadores de tiempo de divergencia entre humanos y chimpancé basados en la teoría del “reloj molecular” (tasa mutacional constante a lo largo del tiempo, se explicará más adelante) Debido a que las mitocondrias se heredan por la vía materna es que se lo llamó “Eva mitocondrial”. Todos los humanos heredamos nuestras mitocondrias de Eva. Estas comparaciones determinan otros hechos que echan por tierra teorías racistas. Muchas variantes de negros son más distintas entre sí que los blancos de algunos negros (con los que están muy emparentados). Toda la clasificación de “razas” humanas tiene mucho más que ver con la evolución de unos poquísimos genes determinantes de caracteres fenotípicos como el color de la piel y poco tiene que ver con la evolución global del resto del genoma y mucho menos con caracteres como la inteligencia. 5) ¿Cómo se puede hacer mapas genéticos de genomas de organelas?¿Cómo se hace para mapear usando levaduras pètites y bromuro de etidio? R: Hay muchos métodos, sólo veremos el mapeo de pètites que consiste en tratar levaduras con bromuro de etidio (un mutágeno que produce deleciones de segmentos del DNA mitocondrial). Al perder genes mitocondriales, se puede estudiar con qué frecuencia se pierden juntos 2 genes, lo que es proporcional a la distancia en el mapa. Como en general se pierden funciones mitocondriales importantes, la levadura pierde la capacidad de respirar, por lo que crece menos que las normales o grandes (en francés) en medio aeróbico. Por eso, se llaman petites a estas mutantes. Problemas 1) Una enfermedad humana que produce cardiomiopatías muestra el siguiente pedigrí:

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a) Cómo ex xplica el pat trón de heren ncia de esta enfermedad? b) Si el ind dividuo 5 tie hijos con una madre sana, ene n e como esper que sean s hijos var ra sus rones? Y sus hijas mujeres? c) Puede el individuo 10 tener una hija sana? Y un ? hijo? Justifi ique d) La pareja formada po los individ or duos 3 y 4 tu un uvo cuarto hijo sano, como lo explicaría Puede ded a? ducir si ese hijo es v varón o muje Justifique er? e. 2) La polill de la harina Ephestia kuehniella posee la a ojos negros y cuerpo pi s igmentado debido a un p precursor del pigm mento (prote eína kynuren nina) cuyo c control de expresión está dado p el gen do por ominante A. Cuando el genot tipo de la po olilla es aa e fenotipo e ojos el es rojos y cue erpo sin pigm mentar. Si se realiza el cruzamiento de u macho he un eterocigota p una hemb repor bra cesiva el re esultado es ½ de polillas pigmentadas con s ojos negros y 1/2 de po olillas no pig gmentadas co ojos on rojos. Si se realiza el cr ruzamiento r recíproco tod las das larvas nacen pigmentad pero los a n das adultos resul ltan en ½ con ojos negros y ½ c ojos rojo con os. a) Explique los fenotip observad en ambo crue pos dos os zamientos. D que tipo de herencia s trata? De se b) Qué explicación m molecular tie ene este tip de po herencia? c) Que exp perimento rea alizaría para probar la re espuesta dada en 2 Consider que cuenta con herram 2). re a mientas para anular genes de la polilla en estadíos espec cíficos de su ciclo d vida. de 3) Una estrategia comer rcial en la pr roducción de maíz e es la genera ación de híbr ridos con est terilidad del polen. De esta ma anera el productor debe comprar se emillas todo el tiem además de que evita la autofec mpo cundación y la co onsecuente p pérdida de va comercia (por alor al disminución del vigor híbrido). L determi n r Los inantes genéticos de esterilidad del polen es e stán localizados en las mitocon ndrias (en ma se conoce por lo men 20 aíz en nos determinant distintos) Para evita la expresi de tes ). ar ión estos determ minantes en las plantas que actúan como parentales e los cruzam en mientos para generar los híbria s dos, se utiliza un gen n nuclear dom minante resta aurador de la fertili idad (Rf) que permite qu la planta pueda e ue dar polen au unque sea ge enotípicamen androesté Si nte éril. usted tiene una semilla de maíz cu ualquiera de origen desconocido ¿cómo har para sab su genotipo en o ría ber cuanto a est carácter? te 4) El análisis de la correspondencia entre la secuencia a nucleotídica del DNA g a genómico mit tocondrial de plane tas superior y la secu res uencia de am minoácidos de las proteínas co odificadas in ndicó que el codón CGG que l G, "universalm mente" determ mina Arg, lo hace para T en o Trp las mitocon ndrias de plan (el códig "universal para ntas go l" Trp es UGG sugiriend que, al igu que en m G), do ual mamíferos y hong gos, las mito ocondrias ve egetales tien un nen código gené ético propio. Sin embarg un invest . go, tigador argentino e Francia re en evisó esa po ostura y dete erminó que las mito ocondrias ve egetales se rigen por el c código universal. ¿Cómo explic esta contr ca radicción apa arente?

¿C Cuál mecanis smo de los s siguientes pu uede estar in nvoluc crado?: a- Mutación puntual somát tica b- Reordenam miento cromosómico c- Transposici genética ión d- tRNAs supr resores e- Splicing del RNA l f- Corrección (edición) del RNA ("edit l ting") 5) ¿Cómo se e explica que l secuencia de aminoá las as ácidos de la subu unidad III de la citocromo oxidasa ais o slada de: - mitocondrias de mamífer m s ros - mitocondrias de plantas m s - kinetoplastos de tripanosomátidos k s est muy cons tán servadas evo olutivamente, mientras qu ue los genes respe s ectivos guard muy poca homología dan a ent sí? tre 6) La idea del origen proca ariótico de la mitocondr as rias se ve avalada/s por las sigu s uientes evide encias que in ndican similitudes con las bac n s cterias actuales y diferenc cias con el equivale nuclear: n ente a) Grado relati de homo ivo ología de sec cuencias de nucle eótídos de los genes ribos somales mito ocondriales. b) La estructur policistrón del RNA inmaduro mira nica A toc condrial. c) El código ge enético mitoc condrial. d) El sistema d replicación del DNA mitocondrial. de n m . e) La secuenci de aminoá ia ácidos de las isozimas mitocon ndriales, f) El fenómen de "trans no splicing" y/o "editing" del o RN mitocond NA drial g) La herencia materna de l genes mi los itocondriales s. h) E1 fenómen de conjuga no ación mitoco ondrial. Ind dique las op pciones corre ectas y falsas y justifique. . 7) Los prione son agent es tes fecciosos in nvolucrados en inf enfermedades neurodegen nerat tivas en los mamíferos c como la conoci o ida encefali itis esp pongiforme bovina o e enfer rmedad de la “vaca loca” y a ” el “scrapie” en ovejas. En los humano se incluye la n n os e enfermedad de Creutzfelde -Jakob, el ins somio fatal y el ku El aspect más pecul del proce de infecc uru. to liar eso ción por priones es que no tien ácidos nu nen ucleicos asoc ciados, en person sanas y e nas enfermas se encuentran los mi ismos alelos de los genes que codific para la p s can proteína priónica. La naturalez infecciosa de los prio za a ones der de que l proteína p riva la priónica pued existir en dos de est tados confor rmacionales: el normal o no infeccioso (40 de hélice α y casi nada de plega 0% es amientos β) y el anormal o infe eccioso (muy rico en estr y ructuras de t tipo β). Cuando la proteína se encuentra en conformac . n ción inf fecciosa tien propiedade del tipo “chaperona”, en ne es “ , el sentido de q es capaz de convertir proteínas n que r norma en infec ales cciosas (mediante una rea acción en ca adena) produciend los agreg ) do gados neuron nales caracte erísticos de la en nfermedad. E enfermedades como el En o “ku uru” o de la “vaca loca” la conforma ación infecci iosa

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aparece en el huésped como consecuencia de la ingestión de tejido nervioso enfermo. En cambio, en enfermedades hereditarias como la de Kreutzfeld-Jakob ciertas mutaciones en el gen priónico aumentan la chance de aparición espontánea de la conformación infecciosa sin necesidad de ingestión del agente infeccioso. A este último tipo de transmisión se lo considera “herencia infecciosa” (un tipo especial de herencia extranuclear). Hasta hace poco se pensaba que sólo existían priones en mamíferos, pero actualmente se tiene certeza de que también están presentes en levaduras. Uno de estos priones fúngicos (el PSI) tiene una función biológica conocida (es un factor de terminación de la traducción citoplasmático). Esta proteína puede existir en 2 variantes: PSI+ y PSI-. La herencia sigue un patrón de herencia infecciosa como el mencionado anteriormente. a) Esquematice un cruzamiento entre levaduras Psi+ y psi- y su segregación en F1 y F2. No omita las convenciones correspondientes para la ploidía, tipos de apareamiento y proporciones genotípicas y fenotípicas en cada una de las generaciones. Lea atentamente, para ello, el ciclo de vida de las levaduras en su libro de texto. b) ¿Dónde tendría que estar localizado el gen Psi? ¿en un autosoma, en un cromosoma sexual, en un plásmido o en genoma mitocondrial? ¿por qué? Justifique. Guía teórica: 1) ¿Qué similitudes y diferencias tiene el desarrollo embrionario en vertebrados y en moscas? ¿Qué importancia relativa tienen las gametas masculina y femenina (los óvulos o futuros huevos)? 2) ¿Qué diferencias y similitudes existen entre determinación (o compromiso) y diferenciación? 3) Describa la determinación autónoma versus la determinación en comité o grupal. 4) ¿Qué es una cascada regulatoria y los efectos de posición? ¿Sirven para explicar porqué el producto de un mismo gen tiene efectos opuestos en distintos tejidos? 5) ¿Qué características tienen los genes que condicionan y participan en el desarrollo? ¿Son todos genes para factores de transcripción? 6) ¿Son los genes homeóticos un subgrupo de los mismos? 7) ¿Existen efectos maternos (como los que Ud. vio para el caracol del género Limnaea) para alguno de estos genes? 8) Si la mayoría de estas mutaciones (como la del problema 2) son letales. ¿Cómo hacen para mantenerlas (y visualizar su efecto sobre los embriones)? 9) ¿Existen similitudes entre los genes de artrópodos y vertebrados? ¿Implica esto una evolución convergente de estos genes? Problemas 1) Células de fibroblasto cultivadas "in vitro" fueron transfectadas ("transformadas genética-mente") con un gen quimérico conteniendo la secuencia estructural

La herencia de esta proteína fue siempre intrigante porque en ninguna de las decenas de mutantes petite se afecta la herencia de la proteína. En cambio el fenotipo priónico PSI+ podía ser revertido a PSI- con altísima frecuencia al someter a las levaduras a agentes desnaturalizantes de proteínas como el hidrocloruro de guanidina, no sucediendo así con tratamientos mutagénicos. Los tratamientos mutagénicos sí pueden producir que levaduras PSI- se transformen en PSI+. Las mutaciones responsables son puntuales y el gen determinante (Psi) pudo ser ubicado en un cromosoma nuclear. Todo esto llevó a cuestionar la herencia infecciosa-materna del gen y llevó a la hipótesis de que el fenotipo PSI+ depende de la conformación de la proteína como en el mal de la vaca loca. c) Teniendo en cuenta lo anterior y disponiendo de: • una sonda del gen Psi (sabiendo que la mutación puntual que condujo a transformar una levadura PSIen PSI+ coincide con el sitio de restricción EcoRI). • anticuerpos monoclonales que reconocen diferencias conformacionales entre PSI+ y PSI-. Esquematice un experimento para estudiar la herencia del gen Psi en sus dos variantes alélicas. ¿Cómo serían las proporciones genotípicas y fenotípicas en una progenie resultante del cruzamiento de Psi+ y psi- (recordando que la proteína codificada por Psi+ también tiene propiedades de chaperona “infecciosa”)? del gen myoDI (gen que codifica para un factor de transcripción de activa expresión en mioblastos: células musculares) y un promotor constitutivo del virus SV40 (virus animal cuyo promotor funciona en un amplio rango de células de mamíferos). Como resultado, se observó la brusca formación de un mioblasto incluyendo la formación de un sincisio a partir de células uninucledas.

16. GENÉTICA DEL DESARROLLO y EPIGENÉTICA

Gen quimérico Gen virus SV40 Gen myoDI prom Sec. cápside viral prom Sec. estructural promotor Sec. estructural

a) Explique cómo tan abrupta "transdetermina-ción” pudo ser causada por un solo gen. b) ¿Por qué no se utilizó el gen myoDl con su propio promotor para realizar el experimento y se lo cambió por uno constitutivo? c) ¿Podría ocurrir lo mismo con cualquier célula de cualquier otro tejido, como ser una célula neuronal? ¿Por qué? 2) Para estudiar la regulación del gen homeótico "hairy" de Drosophila, se clonó la región promotora del mismo, reemplazando la secuencia estructural por la del gen indicador lac Z (ß-galactosidasa de E. coli). Posteriormente, se transformaron embriones sinciciales de Drosophila y se les suministró X-gal en el momento en que normalmente se expresa el gen "hairy", observándose la aparición de 7 anillos (segmentos)

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coloreados de azul. A continuación se hicieron deleciones en la región 5' de la región promotora para analizar la contribución de cada parte de esta región promotora. Como resultado, se identificaron secuencias * Región promotora gen hairy Región 5'
CAT y TATA boxes

regulatorias específicas que resultaron ser responsables, individualmente, de la formación de cada uno de los anillos. Embrión transfectado

Sec. estruct. lac Z 1234567 1 2 6

transcripción

Para estudiar la acción de estas secuencias, se tomó la construcción responsable de la formación del anillo 6, y con ella se transformaron embriones de moscas mutantes homeóticas deficientes para el gen "knirps" y para el gen "Krüppel", y otra que expresa el gen "Krüppel" en forma constitutiva, con los siguientes resultados: Salvaje - knirps - Krüppel expresión constitutiva Krüppel Con anticuerpos específicos e hibridacción "in situ" del mRNA, se ensayó la concentración relativa de los productos de los genes knirps y Krüppel en el embrión de las moscas salvajes, observándose la siguiente distribución: proteína Krüppel proteína knirps

prot. knirps + prot. Krüppel

Anillo 6

a) ¿Por qué se utilizó una secuencia estructural de ß-galactosidasa en lugar de la secuencia estructural del mismo gen, pudiendo disponer de anticuerpos para detectar la expresión de la proteína "hairy"? b) ¿Por qué no se eliminó la región promotora conteniendo las CAT y TATA boxes en los experimentos de deleción? c) ¿Cómo explica la disminución en número, de 7 a 1, de los segmentos "teñidos" con X-gal en las deleciones? d) En base a los experimentos con mutantes y de detección de productos de los genes knirps y Krüppel ¿qué función cumplen estos productos? En su contestación considere la posibilidad de que sean receptores de membrana, hormonas, factores de transcripción, reguladores positivos, negativos, segundos mensajeros y/o proteínas específicas de tejidos diferenciados como podría ser la hemoglobina de los glóbulos rojos de vertebrados. e) Proponga un modelo de regulación (un esquema al estilo del operón lactosa) para explicar la función de la secuencia regulatoria estudiada en la expresión del gen “hairy”

INTERFERENCIA/SILENCIAMIENTO E IMPRONTA
3) La impronta genómica ("genomic imprinting") es una rara propiedad que presentan algunos genes de transcribir y expresar sólo el alelo derivado del progenitor de un determinado sexo, es decir o del padre exclusivamente, o de la madre exclusivamente y no del otro; mientras que el alelo proveniente del progenitor del otro sexo no se expresa. El alelo que no se expresa es el que se dice que está “imprinteado”. Cada gen tiene su patrón de imprinting específico. Se cree que este fenómeno está relacionado con los casos epigenéticos de silenciamiento pretranscripcional descriptos en plantas dado que la metilación representaría una impronta o marca a nivel molecular para distinguir el alelo paterno del materno (para una revisión del tema: Cell 77, 473-476 [1994]). El gen del factor de crecimiento "insuline-like growth factor" tipo 2 (IGF2) humano, que se expresa en las etapas embrionaria y fetal, está sujeto a "imprinting". El "imprinting" está asociado a un grado de metilación diferencial en cada uno de los alelos, que se establece en las gametas, no siendo claro aún cómo es que un patrón de metilación se mantiene en el DNA de las células somáticas de la descendencia, y cómo es capaz

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de borrarse en la línea germinal de la descendencia del sexo opuesto. Para estudiar este fenómeno en el gen del IGF2, se aprovechó uno de sus polimorfismos -que cae en una región del exón 9 que corresponde a la región 3' no codificante-, que da dos alelos posibles: uno que presenta el sitio para la enzima Apa I, y otro que carece de él (Nature Genetics 4, 98-101 [1993]). Usando dos oligonucleótidos específicos del exón 9, los autores del trabajo amplificaron una región de 236 pb que abarca a dicho sitio. La enzima Apa I corta al fragmento amplificado a partir del primer alelo mencionado, en dos fragmentos: uno de 173 pb y otro de 63 pb, como muestra la figura: Ud. es un biólogo muy riguroso y crítico (eso está bien) y duda de mucho de lo que le dicen sus docentes (eso no está tan bien) con respecto a la existencia del "imprinting", queriendo revisar Ud. mismo lo hecho por los autores del trabajo. Diseñe un protocolo experimental para determinar si el gen IGF2 está sujeto a "imprinting" y si éste es de tipo materno o paterno, indicando: a) ¿Qué individuos analizaría? b) ¿Qué genotipo (homocigota o heterocigota con respecto al sitio Apa I) eligiría en los individuos a analizar? ¿Cómo determinaría esos genotipos? c) ¿Qué técnicas usaría? ¿Qué tipo de muestra usaría de cada individuo (¿DNA o RNA?). 4) Las plantas poseen diversas estrategias de defensa para contrarrestar el ataque de patógenos. En Arabidopsis, por ejemplo, la presencia de un péptido correspondiente a los últimos 22 residuos de la flagelina de bacterias (flag22) sirve de señal para desencadenar grandes cambios en los niveles de transcriptos de ciertos genes. Navarro et al. (2006) hallaron que la respuesta a flag22 involucraba principalmente cuatros genes, cuyos patrones de abundancia de transcriptos se muestran a continuación:
1.25 Cantidad 1 Relativa 0.7 de mRNA 0.50 0.25
Sin flag22 Con

minutos y medir los niveles de mensajero de GFP se observaron los siguientes resultados:
2
Sin flag22 Con flag22

1 Cantidad relativa de mRNA GFP

TIR1 ABF

ABF

miR39

TIR1

ABF

ABF

miR39

TIR1, ABF2, ABF3: receptores de auxinas miR393: microRNA 393 *Todas las diferencias son significativas a) ¿Cómo se modificaron los niveles de mRNA en cada caso? Con el objeto de estudiar la regulación de estos genes en presencia de patógenos se obtuvieron plantas transgénicas que contenían la región promotora de cada uno de ellos río arriba de la región codificante de GFP (Green Fluorescent Protein). Al someter las plantas transgénicas a tratamiento con flag22 durante 30

b) ¿Cómo interpreta los resultados del experimento 2 teniendo en cuenta lo observado en el experimento 1? ¿Qué tipo de regulación estaría siendo ejercida en cada caso? El análisis de secuencia de la región codificante de TIR1, ABF2 y ABF3 reveló que los tres genes poseen una región conservada de 25 pb que puede ser reconocida por microRNAs. c) Proponga un mecanismo para explicar los cambios observados en los niveles de transcriptos de los cuatro genes en respuesta a flag22. 5) La ingeniería genética de plantas para conferir resistencia a enfermedades virales tiene larga data. Las primeras transgénicas resistentes a virosis, lo fueron por expresión de funciones (proteínas) virales (como la cápside) las cuales interfirieren la estrategia de multiplicación de los virus. También se intentó bloquear la traducibilidad de los mensajeros virales expresando secuencias de ARN complementario (llamadas de orientación antisentido). En los últimos tiempos se enfocó en el aprovechamiento del mecanismo de defensa llamado silenciamiento post-transcripcional mediante la expresión de secuencias nucleotídicas virales. En un trabajo reciente, Vazquez Rovere y col. (Arch. Virology 146:1337, 2001), obtuvieron papas transgénicas que expresaban las siguientes 3 construcciones genéticas conteniendo el gen de la replicasa del virus PLRV (ORF2b): Aclaraciones: ATG-rep: Construcción que contiene el gen de la replicasa con el codón de iniciación (ATG AUG); No codific-rep: Idem sin ATG; Anti-rep: construcción antisentido (la secuencia se encuentra invertida); RB y LB: bordes derecho e izquierdo del segmento T de Agrobacterium tumefaciens; 35S, mas5’: promotores constitutivos fuertes; t-nos, mas3’ terminadores de transcripción; ORF2b: gen de la replicasa; nptII: gen de resistencia a kanamicina; Flechas: indican la orientación 5’ 3’de la secuencia.

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a) ¿Para qué se usó la resistencia a kanamicina? Las plantas transgénicas fueron desafiadas con el virus y se encontraron plantas con resistencia (y también con susceptibilidad) con cualquiera de las 3 construcciones. Para caracterizar el mecanismo que media esta resistencia, se bombardearon hojas de las papas transgénicas utilizando un cañón génico y una construcción que codifica para una proteína de fusión GUS::replicasa (Fig. 2, la GUS –ß-glucouronidasa– es detectable en forma similar a la ß-lac). La fusión, sin embargo, afecta parcialmente la actividad enzimática. Es decir, la enzima funciona un poco peor, pero fun-

ciona. De esta forma se consigue la expresión (transitoria) de las construcciones genéticas bombardeadas en las células impactadas y su fácil visualización en forma de puntos azules (fig.2). Nota: No se grafican las transgénicas con la construcción ATG-rep porque dan casi igual que las no codific-rep. b) ¿Para qué se hicieron los experimentos de la Fig. 2? Interprete los resultados: i) ¿Cómo me doy cuenta de cuánto afecta a la actividad GUS la fusión con la replicasa? ¿Qué resultados comparo para evaluarlo? ii) ¿Para qué sirven, además, los experimentos realizados con la construcción 2 (GUS sólo)? iii) ¿A qué atribuye las diferencias entre A1 y A2 y entre S1 y S2? ¿Qué relación tiene con la resistencia? iv) ¿Cuál mecanismo (mediado por proteína, mediado por bloqueo de la traducción –antisentido-, mediado por silenciamiento posttranscripcional) media la resistencia? Aclaraciones: GUS-rep: construcción genética capaz de expresar una proteína (y su mRNA) de fusión GUS+replicasa, GUS: Idem sólo GUS. uid-A: gen codificante para GUS; A1 y A2 son 2 plantas transgénicas representativas para la construcción antisentido (Anti-rep); S1 y S2 plantas con la construcción “sentido” (no codific-rep). (S) y (R) representan plantas susceptibles y resistentes. Ken (NT) es un control de la misma variedad de papa que el resto (Kennebec) pero no transformada.

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16. EVOLUCIÓN, BIODIVERSIDAD Y MEJORAMIENTO
tocondriales de sus hospedantes. De esta manera se puede tener una relativa precisión para evoluciones que, se supone, tienen menos de 100 años de antigüedad. A partir de un estudio utilizando RT-PCR de secuencias nucleotídicas virales de distintos aislamientos de HIV y sus variantes en humanos, así como los virus del tipo SIV en monos, se identificó una región que muestra un gran polimorfismo, la cual se quiere usar para hacer un análisis filogenético y un estudio poblacional de cuantificación de la variabilidad genética. a) ¿Por qué se utilizó RT-PCR y no clonado molecular de cDNA (y posterior secuenciación de los clones)? ¿Cómo se relaciona esto con el concepto de las cuasiespecies en virología? b) Se muestran las secuencias de cuatro aislamientos:

1) La epidemia global del SIDA es provocada por el HIV, un retrovirus que infecta linfocitos. Se conocen al menos 2 variantes llamadas HIV-1 y HIV-2, siendo el HIV-1 el causante principal de la epidemia) Se especuló mucho sobre su origen y ha habido muchas versiones como que el virus fue diseñado en un laboratorio de ingeniería genética hasta otras en las que médicos “a la antigua” se inyectaron suero de monos para probar protección (vacunas) contra determinadas enfermedades y permitieron así el ingreso del HIV al huésped humano ayudando a cruzar barreras interespecíficas.

1. 2. 3. 4.

AGGCC AAGCC ATAGC TGTCC AGGCA AAGAC ATACC TGACC AGGCC AAGAC ATAGC TGTCC AGGCA AAGAC ATACC TGTCC

Mono verde africano Mono sootey mangadey Mono sykes HIV-2 Mandril

chimpancé ZR59

HIV-1
Independientemente de esta última hipótesis, siempre se especuló acerca de la relación evolutiva con la familia de SIVs (virus de inmunodeficiencia de simios) que presentan chimpancés, mandriles y otros simios, los cuales no son patogénicos en sus huéspedes pero que, al transferirse a los humanos, pudieron haber adquirido propiedades patogénicas hacia el mismo. Debido a su particular sistema de replicación, las enzimas que intervienen no tienen mecanismos de corrección eficientes para los posibles errores de copia de ácidos nucleicos. Por lo tanto, el reloj molecular es mucho más rápido que para los genes nucleares o mi-

Construya una matriz de distancia genética simple expresada como el número de diferencias nucleotídicas por sitio polimórfico para cada par de secuencias comparadas (por ejemplo, las secuencias 1 y 2 tienen 20 nucleótidos y tienen 4 diferencias 4/20 = 0,2). c) ¿Qué secuencias se encuentran más relacionadas entre sí? d) Construya un fenograma con estos datos e) ¿Podría proponer una posible secuencia evolutiva de cambios? ¿Qué tiene que ver esto con el principio de parsimonia? f) ¿Podría asignar a una de las secuencias el papel de “primitiva” y otras de evolucionadas? ¿Qué necesitaría para poder hacerlo? En un trabajo publicado por Wain-Hobson (Nature 391:531, 1998) se propone un árbol filogenético como el que se muestra a continuación. g) ¿Opina que la 1 2 3 4 clasificación en HIV-1 y 1 0,2 HIV-2 refleja 2 correctamente la 3 taxonomía de este virus? 4 ¿El origen del HIV, es monofilético o polifilético? Discuta. h) En 1998 causó mucho asombro el análisis de una muestra de sangre conservada desde 1959 perteneciente a un individuo africano de sexo masculino (ZR59). Si bien no se pudo secuenciar completamente, fue suficiente para ubicar su relación evolutiva en el centro de HIV-1. Como Ud. sabe, el SIDA se hizo conocido (por afectar a actores como Rod Hudson) a fines de los ’80 y principios de los ’90 (en ese momento se lo llamó “peste rosa”) ¿Qué conclusiones puede sacar sobre la antigüedad de la enfermedad y su evolución?

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Paciente C Paciente A Paciente G Paciente B Paciente E Dentista CL 1 CL 2 Paciente F CL 3 CL 4 Paciente D

i) ¿Cuán altas le parece que pueden ser las probabilidades de contagiarse de SIDA de un chimpancé infectado con SIV? ¿Porqué? La rapidísima velocidad de evolución se puso de manifiesto en un sonado estudio a nivel de epidemiología molecular con pacientes de un dentista en Florida, Estados Unidos, en la década del ‘90 (ver figura, CL son controles locales de pacientes de las inmediaciones, con SIDA, pero que no tuvieron ningún contacto o relación con el dentista y sus pacientes). j) ¿Podría Ud. confirmar con estos datos que las prácticas dentales hechas sin las debidas precauciones deben ser consideradas como un factor de riesgo? ¿Considera que todos los pacientes se enfermaron por esta causa? ¿Para qué se utilizaron controles? ¿Porqué fueron locales y no externos? ¿Le permite esto inferir que todos los casos analizados provienen de un origen común (monofilético)? 2) En un trabajo de un grupo de investigación interesado en filogenia de hominoides, publicado en Mol. Biol. Evol. 7, 203 (1990), se muestran las secuencias alineadas de una región transcripta (3500 pb) del gen rRNA 28S de varios primates. En la tabla se presentan los valores tabulados como diferencias encontradas entre los diferentes pares.La parte del gen elegida es lo suficientemente conservada para no dar variaciones intra-especie (entre individuos) y relativamente variable para dar pequeñas diferencias (puntuales) comparando con otras especies o géneros.
Hum. Chimp gorila humano chimpancé gorila orangután ratón 19 31 53 242 Orang ratón

b) Sobre la base de los datos, los autores concluyen que el chimpancé es el primate más cercano al humano. ¿Está Ud. de acuerdo? c) Los autores no incluyeron "gaps" (huecos que aparecen en alguna de las secuencias al alinear todas) en el análisis porque dicen que uno no está seguro de que los "gaps" fueron consecuencia de eventos simples únicos de mutación? ¿Ud. esta de acuerdo con esa decisión de los autores? d) ¿Conoce algún otro método molecular que pudiera aportar más datos para confirmar la teoría concluida en b? 3) Otro caso evolutivo de interés epidemiológico es el de la BSE (encefalopatía espongiforme bovina o “mal de la vaca loca” causada por priones) y que ya se comentó en un problema de la guía de herencia no mendeliana. Se sabe que la proteína normal debe estar involucrada en la señalización nerviosa dado que se encontraron alteraciones en los niveles de GABA en ratones “knock-out” para el gen correspondiente. Una de las particularidades epidemiológicas de esta enfermedad es que la misma es transmisible desde ovejas enfermas de “scrappie” a bovinos que se alimentan de tejidos ovinos infectados. Los humanos desarrollan la enfermedad de Creutzfeld-Jacobs (o kuru) si consumen tejidos bovinos infectados, pero nunca pudo demostrarse la infección por consumo de carne ovina. Los genes para priones de 33 especies distintas han sido secuenciados y permitieron construir un fenograma como el de la figura.

a) La topología del árbol es bastante inusual en algunos aspectos de relaciones entre primates Orangután Humano Gorila Chimpancé Gibón Cabra Oveja Vaca (comparar con el obtenido en el problema 2) ¿Cuáles aspectos?
b) Independientemente de ello, la posición de los rumiantes (respecto de los primates) es coherente. ¿Permite este árbol inferir la cadena epidemiológica oveja vaca humano? ¿Por qué? c) Una peculiaridad llamó mucho la atención. Los OTUs marcados en negritas subrayadas tienen una serina en la posición 143 y una histidina en la 155, mientras que la mayoría de los otros priones tienen asparragina y tirosina en dichas posiciones. ¿Cómo se puede explicar este resultado? ¿Le parece que, para el

29 57 245

59 239

250

a) ¿Para qué se incluye al ratón?

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caso de este gen, vacas y humanos tienen un origen filogenético común? ¿Surge de estos resultados alguna nueva interpretación epidemiológica? d) Opine si el resultado experimental observado: que ratones y ovejas pueden ser infectados con BSE (aunque carecen de las 2 modificaciones mencionadas) contradice las conclusiones de c). 4) Se postula que los cromosomas sexuales de los humanos evolucionaron a partir de autosomas. Se cree que los actuales (y escasos) pares de genes que aún recombinan entre su posición en el cromosoma X e Y son fósiles moleculares de una homología mucho más extensiva del pasado evolutivo. En un trabajo de Lahn y Page (aparecido en Science 286:964, 1999) se estudió la evolución comparando secuencias genes autosómicos ancestrales (llamados ancestrales porque su homología con genes autosómicos actuales es muy baja) que persisten en los cromosomas X e Y. Se tomaron en cuenta 2 variables: 1) la posición de los genes en el mapa y 2) la divergencia de la secuencia nucleotídica. a) El mapeo se realizó mediante la utilización de híbridos somáticos irradiados. El mapa se ilustra en la figura de la izquierda. En el cromosoma X estos genes se concentran en la región distal del brazo corto. En cambio, aparecen mucho más dispersos en el cromosoma Y. b) La comparación de secuencias se hizo analizando las mutaciones silenciosas (también llamadas sustituciones sinonímicas) que no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína. A partir de este análisis se hizo una cuantificación mediante el parámetro Ks (promedio de sustituciones sinonímicas por sitio, estadístico que sirve para estimar el tiempo evolutivo transcurrido desde que las secuencias que se comparan empezaron a divergir por ausencia de recombinación homóloga; en este caso, entre cromosomas X e Y). i) ¿Por qué se considera que las sustituciones sinonímicas o silenciosas son prácticamente neutras respecto a la selección? ii) ¿Porqué se eligieron estas mutaciones en particular (y no otras) para este cálculo de "edad" de genes? Sorprendentemente, encontraron 4 grupos bien diferenciados de genes: 1) con valores de Ks de 0,94-1,25; 2) 0,52-0,58; 3) 0,23-0,36 y 4) 0,05-0,12. Las diferencias son estadísticamente significativas. Más sorprendentemente, los genes pertenecientes a cada uno de los 4 grupos mapean juntos en el cromosoma X y se ordenan en el mismo por “edad”. Es decir, el grupo 1 se ubica en el brazo largo, el 2 en el brazo corto (cerca del centrómero), el 3 en el medio del brazo corto y el 4 en el extremo del brazo corto (ver de nuevo la figura de arriba). En cambio, en el cromosoma Y no se observa este ordenamiento. Ud. sabe (de cuando vio alteraciones estructurales) que las inversiones cromosómicas constituyen un mecanismo que impide la re-

combinación homóloga, porque los alelos de los a genes homólogos dejan b de aparearse en la meio- 4 sis. c iii) ¿le ayudan estos co- 3 nocimientos a entender las diferencias de “edades” de los genes contenidos estos 4 segmentos 2 cromosómicos? Por lo tanto, se postula a que estos resultados reflec jan 4 eventos evolutivos puntuados de inversión cromosómica (y eventual b pérdida de DNA de los segmentos) del cromosoma Y, que llevaron a la 1 pérdida de ordenamiento por grupo de edades de estos genes en el cromosoma Y (ver segunda figura). Esto sugiere que la inversión más reciente (grupo 4) ocurrió hace 30-50 millones de años (en la línea de los primates), la del grupo 3 hace 80-130 Ma, etc. Desde el punto de vista de la evolución de los grandes grupos, esto significa que el sistema de determinación del sexo basado en cromosomas X e Y apareció muy tempranamente en la línea evolutiva de los mamíferos. iv) Indique si estos datos corroboran (o no) que el sistema de determinación Z-W de las aves es independiente (o no) del de los mamíferos. ¿Qué podría decir del sistema de determinación del sexo de los reptiles de los que se originaron mamíferos y aves? Otro resultado de interés es que los genes SOX3 y SRY (genes que primariamente determinan el sexo) tienen valores de Ks que los ubican entre los genes más antiguos (es decir, genes originalmente homólogos y que divergieron en el transcurso de la evolución). v) ¿ Por qué estos genes son importantes? Finalmente, otro resultado de interés es el del gen XIST, involucrado en la heterocromatinización de uno de los cromosomas X en las mujeres. Este gen se ubica en el grupo de genes más reciente, contrariando hipótesis preexistentes que indicaban que surgió contemporáneamente con la determinación del sexo basada en el sistema X-Y. vi) ¿Qué función cumple la heterocromatinización del cromosoma X y cómo supone que era la situación antes de que ésta apareciera? ¿Podría postular si esta heterocromatinización es evolutivamente tardía o temprana?

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Emergencia de los cromosomas sexuales después del primer evento inversión cromosómica del cromosoma Y (320-240 Ma) Expansión de la zona pseudoautosómica (120-130 Ma) Segunda inversión del Y (130-170 Ma) Tercera inversión del Y (80-130 Ma) 3 2 4 3 2

2

2

1

1

1

1

Cuarta inversión del Y (30-50 Ma)

1

Autosomas Autosomas reptiles

X Y XY monotremas

X

Y XY marsupiales

X

Y

X Y X Y XY en mamíferos placen- XY humanos tarios no simios

MEJORAMIENTO
5) La κ (kappa) -caseína es una proteína presente en la leche bovina y juega un papel importante en el proceso de elaboración de quesos. Un alelo del gen de la κcaseína, llamado “A”, produce un tipo de caseína que da un queso de calidad superior a la que da otro alelo,
gtgctggag(t/c)aggtatcctag

llamado “a”. La única diferencia entre ellos radica en una base que abarca el sitio de restricción para la endonucleasa Hind III, lo cual hace que el sitio esté presente en “A” y ausente en “a”:

sitio Hind III +/región 3’ no codificante región codificante DNA amplificado (874 pb)
ggtcacaacaa cgtg agatg

Al hacer PCR con iniciadores ("primers") específicos (indicados en la fig.) sobre muestras de sangre de cinco toros y posterior tratamiento con Hind III, se obtuvieron los siguientes resultados (Animal Genetics 22, 11 [1991]):

1

2

3

4

5

pb 874 521 353

a) ¿Qué clase de marcador estamos analizando: dominante o codominante? b) ¿Cuál es el genotipo de los toros testados? c) Si Ud. fuera un rico y poderoso productor agropecuario que abastece leche a una importante fábrica de muzzarella, - ¿cuáles bovinos elegiría para realizar apareamientos dirigidos? - ¿seleccionaría además basándose en otras características fenotípicas? - ¿financiaría un proyecto de investigación a realizar por un Licenciado en Biología para optimizar (por ejemplo automatizar) la tipificación genotípica?

d) ¿Qué ventajas tiene este método sobre el clásico de RFLP? e) ¿De qué otros tejidos se podría extraer DNA de los toros? f) ¿Se podría determinar el genotipo de vacas, haciendo PAGE no desnaturalizante de proteínas en muestras de leche? 6) Varios trigos argentinos portan la translocación 1BL/1RS trigo-centeno (es decir son “transgénicos” con muchos genes de centeno). El segmento de centeno translocado lleva genes de resistencia a roya de la hoja, del tallo y a oidio. Además, algunos autores encontraron una asociación positiva entre dicha translocación y el rendimiento. Por otro lado, evidencias más recientes muestran un efecto detrimental sobre la calidad panadera debido a la presencia de un gen en el 1RS que codifica para una secalina (proteína de reserva de centeno) que afecta a la interacción de las gluteninas (proteínas de reserva de trigo) que constituyen el gluten. Por eso muchos programas de mejoramiento están tratando de eliminar esta translocación de las variedades comerciales más modernas sin desaprovechar el resto de los alelos fijados en las variedades que están bien adaptadas. a.- Conociendo el método de retrocruza. ¿Cómo haría para obtenerlo? b.- Evalúe las siguientes técnicas para hacer la selección pertinente en cada generación de retrocruza en cuanto a:

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i) descripción de cómo sería el modus operandi de la técnica involucrada ii) complejidad del equipamiento y del personal involucrado (es decir, ¿qué instrumentos y nivel de capacitación se requiere?) iii) posibilidad de masificar el análisis (relación tiempo empleado por muestra) • Citológicas: recuento cromosómico, análisis cariotípico, bandeo C • Bioquímicas: electroforesis de proteínas de reserva (secalinas vs. gluteninas-gliadinas), isoenzimas, ELISA de secalinas. • Moleculares: Microsatélites, hibridación in situ • Inoculación con roya c.- ¿Cuál recomendaría? ¿Por qué? Nota: el satélite del brazo corto 1RS del cromosoma de centeno no se expresa en el fondo genético del trigo. El cultivar de trigo que lleve centeno tendrá una constitución 42-2 (cromosomas-satélites) en lugar de 42-4 de un cultivar sin genoma de centeno. 7) El vigor híbrido o heterosis es una interacción que se produce en genotipos heterocigotas muy buscada en mejoramiento animal y vegetal por su asociación con caracteres productivos como el rendimiento. Además, en muchos casos se producen relaciones epistáticas positivas importantes cuya base bioquímica o molecular está lejos de ser entendida. Las especies autotetraploides como la papa ofrecen la posibilidad de obtener tetrahíbridos (heterocigosis con hasta 4 alelos diferentes).

A la papa común (Solanum tuberosum spp tuberosum) se le pueden aplicar muchas técnicas biotecnológicas como son: i) cultivo de anteras (es decir, polen) para reducción del número cromosómico ii) fusión de células somáticas (de protoplastos) iii) cruzamientos amplios (cruzamientos interespecíficos con otras especies de número cromosómico compatible) Además, tiene especies silvestres relacionadas con genes interesantes para el mejoramiento pero que, en general, son diploides y autógamas (por lo tanto con un alto grado de homocigosis), pero que también admiten la realización de cruzamientos interespecíficos mediante castración e inoculación de polen. Ud. dispone genotipos caracterizados de 4 especies (Solanum tuberosum tuberosum -4n-, Solanum tuberosum andigena -2n-, Solanum chacoense -2n- y Solanum phureja -2n-, todas cultivadas en distintos países) con varios genes agronómicos de interés y quiere combinarlos de alguna manera. a) Diseñe un método para la obtención de tetrahíbridos de estas 4 especies. b) Sabiendo que existe un mapa genético de RFLPs muy bien caracterizado (con sondas que detectan bandas en todos los cromosomas) en Solanum tuberosum tuberosum y que hay mucho polimorfismo para este tipo de marcadores, indique una forma sencilla de evaluar el grado de éxito que obtuvo con la estrategia diseñada en a).

BIODIVERSIDAD

8) Ud. es un biólogo muy preocupado por la conservación de la biodiversidad y le han encargado tratar de armar una colección de germoplasma de una especie vegetal o seleccionar un grupo de animales en peligro de extinción para su conservación en un área protegida. Como está interesado en mantener la mayor cantidad de diversidad genética pero el número de individuos que puede seleccionar es pequeño, está tratando de establecer parámetros objetivos para su selección. Decidió probar con los marcadores RAPD y debe evaluar qué “primers” y bandas son los más informativos.Con el primer “primer” que prueba obtiene el siguiente patrón de bandas:

sencia o ausencia de banda. ¡Felicitaciones! Acaba de construir una MBD (matriz básica de datos). b) Calcule la frecuencia de presencia de cada banda (alelo). c) Calcule el contenido de información polimórfica (PIC) de cada una mediante la fórmula de Anderson (1993):
2 PICi = 1 − ∑ j =1 pij n

a) ¿Cuántas bandas diferentes pudo detectar (ayúdese de una regla)? Numérelas y arme una tabla con ellas, en la que pondrá este número en la primera columna y los nombres de los individuos (A, B, C, etc.) en la primera fila. Rellene el cuadro con 0 y 1, según pre-

donde p es la frecuencia del alelo j para el marcador i. d) Como Ud. está bastante ansioso, y considera que la muestra de individuos aquí analizados es representativo, como así también confía en el patrón de bandas obtenidas, quiere avanzar y tener una medida de la diversidad genética, se decide a estimarla. Para ello utiliza la fórmula de Weir (1996). Ésta está formada por la suma de cuadrados de las frecuencias de los alelos

D = 1−

1 ∑∑i L l

p

2

i

en promedio para L loci, donde p es la frecuencia del alelo i en el locus.

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Anexo: Compendio de preguntas de parciales anteriores (cursos 2000-2006 de verano):
Nota: la inclusión de las siguientes preguntas y, particularmente, las respuestas esperadas que sirvieron de guía para la corrección de los parciales por parte de los docentes, no tienen otro propósito didáctico que el de orientar a los estudiantes acerca de cómo son los parciales de la materia y de cómo se corrigen. Aquellas preguntas de parciales que los docentes consideramos que aportaban a la mejor comprensión de algún capítulo de la materia, fueron incluidas en la guía de problemas y no se repiten aquí. Algunas de las preguntas de parciales integran más de un capítulo de las clases de problemas. Las preguntas de los parciales de la presente cursada tendrán el mismo espíritu pero serán diferentes en sus enunciados. El orden de los temas no es el mismo que en la guía. Regulación e Ingeniería Genética 1) Los operones mce de Mycobacteβ-gal rium tuberculosis (bacteria que produce la tuberculosis) codifica para 500 pP3Rv 200 100 proteínas potencialmente involucraRv das en la virulencia de este patógePromotor mce no. En el genoma de M. tuberculosis hay 4 operones mce similares en pP3 β-gal secuencia y organización, que codifican para proteínas secretadas o de membrana y una proteína de tipo β-gal pJEM15 invasina. Estos genes son exclusivos de las micobacterias y no se encuentran en otras bacterias mejor caracA terizadas como Escherichia coli. Santángelo y col (del INTA CasteB lar) publicaron en Microbiology (2002, 148:2997–3006) un trabajo C en el que estudian la regulación de este operón en base a la información genómica dispo- a) ¿Qué tipo de efecto tiene la presencia del gen Rv nible. Por un lado conocían las secuencias estructura- sobre la regulación del gen quimérico? les de los genes mce pero no tenían bien caracterizado b) Si la construcción que interesa analizar es pP3Rv su promotor. Por otro lado, les llamó la atención un ¿para qué se hicieron los experimentos con pP3 y con gen (llamado Rv) ubicado hacia 5’ de uno de los ope- pJEM15? rones dado que codificaba para una proteína cuya es- c) ¿Por qué se reemplazó la secuencia codificante de tructura predicha por los modelos bioinformáticos era mce por la de la β-gal? similar a la de algunos factores de transcripción. Para Para investigar la localización del sitio de unión de la estudiar la función de este gen realizaron las siguien- proteína codificada por Rv hicieron gel-shifting en los que se diferencian electroforéticamente los DNAs tes construcciones quiméricas: pP3Rv contiene el gen Rv completo (incluyendo el “sueltos” de los que tienen “pegados” una proteína porque ésta les repromotor de Rv), la región intergénica completa hasta A B C el codón de iniciación del primer gen mce (es decir, 1 2 3 1 2 3 1 2 3 - trasa su migración en el gel. Los donde debería ubicarse el promotor de mce). La seDNAs se detectan cuencia codificante para mce fue reemplazada por el por hibridación con gen lac una sonda del pP3 es igual, pero sin Rv segmento interpJEM15 es el vector vacío (salvo por el gen lac) génico. Se incubaA, B y C representan segmentos de la región interron los siguientes génica (1-100, 1-200 y 200-500 pb hacia 5’ del ATG, productos de PCR: respectivamente) A) nucleótidos 1Lo primero que hicieron fue estudiar el efecto de in+ 100 B) 1-200, troducir las construcciones quiméricas en E. coli obteC) 200-500 con 1) niendo los siguientes resultados: búfer 2) ex tractos de bacterias transformadas de Efecto del gen Rv sobre el promotor mce: E.coli conteniendo la construcción pP3Rv; 3) extracMicobacterias transformadas con tos de bacterias de E. coli conteniendo la construcpJEM15 (vector sin insertos) [barras blancas] ción pP3 pP3 (construcción sin Rv) [barras grises] d) ¿Dónde se localiza el sitio de unión de la proteína? pP3Rv (construcción con Rv) [barras negras]

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e) ¿Por qu se utiliz ué zaron extrac ctos de E. coli (transforma adas con las construcci iones) y no de o micobacteri ias?

7 kb

3 kb

12 kb E2 370 pb E3 0 pb 8 E4 4 130 pb 0

prom m otor 21 de actina a de tomate t

E1 pb

vector

Respuesta esperada a) Activad as as dor b) La com mparación e entre la ac ctividad de p3 y p3Rv es lo que permi determin que Rv es un o ite nar elemento a activador (o represor si lo hubiese sido). o i pJEM15 es un control negativo. s

rn s s con en un Souther de DNAs genómicos digeridos c nientes de: a) tomate normal, b) A n Aloe HindIII proven ver c) tomate transgénico hibridando con una son ra, e o; o nda de cDNA de lo ongitud comp pleta. 2) ¿Por qué h habrá elegido tomate y no tabaco, por o eje emplo? 3) Analizando la expresión de los mRN de aloe n NAs everin en distinto tejidos de tomate tran na os el nsgénico por la r téc cnica de Nor rthern, usand como son al cDNA de do nda A alo oeverina de longitud co ompleta, se observó lo siRNA de RNA d tomate transgénico de

c) Porque e fácil de de es etectar enzim máticamente y los Aloe vera: hoja ra v aíz hoja r raíz fruto flor resultados n son afect no tados por la expresión d los de _ genes mce endógenos ( (cromosómic cos) de las m micomRNA I A bacterias tra anformadas. d) 100-200 mRNA II A e) Porque n necesito extra de una cé aer élula que exp prese la proteína Rv, porque si no, nunca podría estu a udiar su efecto. + 2) El Dr. Cu ureta, en su e eterna búsqu ueda de la pó ócima gu uiente: de la juvent eterna, es tud studió la estr ructura y exp presión a) ¿Cuáles son los tamaños del mRNA I y mRNA II s I? del gen de la aloeverina que produc una prote a ce eína de b) En el prime esquema u er ubique (con flechas) la p promaravillosa propiedade curativas y rejuvenecedoras as es bab ubicació del codón de iniciaci y la del de ble ón n ión en Aloe ver (planta no comestible). Este gen d orira o da ter rminación. gen a dos proteínas dife erentes en las hojas y las raíces s c) ¿Por qué el Dr. Cureta r reemplazó en su experim n mende la planta por splicin alternativo Sin embar a ng o. rgo, la to el promotor de la aloev r verina por el de la actina de a única que ti iene propieda ades especia es la de l hoja ales la tom mate? ¿Le p parece que eligió el prom motor más a adeque se prod duce en cantidades muy p pequeñas. Ad demás, cuado para sus propósitos? ¿Por qué? su purificac ción es inefic ciente, con e agravante d que el de d) ¿Qué concl lusiones saca a partir de los resultados a e sus propiedades se ven a afectadas po las fenolox or xidasas del Northern e cuanto a la especificidad tisular del en que se liber de los liso ran osomas cuan estas org ndo ganelas spl licing del RN del gen d la aloeveri NA de ina? se rompen en el proces de homog so genización. E es Esta e) ¿Qué suger rencias expe erimentales le haría al Dr. la estructura del gen de la aloeverina a a: Cureta par mejorar la performanc de sus ex ra a ce xpekb 3 kb 12 kb 7 rimentos y así obtener los resultado deseados? os Respuesta 1) tomate, no da nada Aloe vera 3 as a. a: bandas de 7, 3 y 12 kpb. Toma transgéni ate ico: E2 E3 E4 E1 1 promotor ídem. 2) Porque el tabaco tampoco es comestib 0 pb 130 pb o ble. 210 pb 70 pb 8 3 El tomate, sí. Respues alternativ Si la idea es sta va: a Las flechas indican sitio para la en os nzima HindII Los II. vidad, el taba (por su a aco alta dos mRNAs difieren po s orque en uno está present y en la de mejorar la productiv o te oducción de biomasa) po odría haber si una alter ido rnapro el otro está ausente el ex E3 de 80 pb. El Dr. Cureta xón 0 va e. decidió obt tener tomate transgéni es icos transfec ctando tiv interesante 3) a) 790 y 710, b) ATG: Una flecha un poco a la de n erecha del ex xtremo del exón 1 (no en el e n con un plás smido recom mbinante con el gen clona de ado ext tremo porqu siempre ha un extrem 5´ de mRN ue ay mo NA la aloeverin en el que h na había reempl lazado al pro omotor no codificante) o al principio del exó 2. Stop: u ón una nativo de la aloeverina por el de la actina de to a a omate, echa un poco a la izquier del extremo derecho del o rda fle con el fin de analizar la expresión d mRNAs de aloede e exón 4 (siempr hay un se re egmento 3´ no codificant a n te verina en lo distintos te os ejidos: e o 1) Sabiendo que los to o omates no t tienen ningú gen 3´ del codón de terminación), c) El promotor nativo es ún poco eficiente y lo reemp e plaza por uno constitut u tivo endógeno h homólogo a de la aloeverina, dib al buje el fue erte, pero po odría haber elegido mejo el promot or tor: patrón de bandas de hib bridación que esperaría o e obtener por ej. uno es specífico de fruto de tom mate, que es el s

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tejido de interés para alimentación. d) Aparentemente, el sistema que permite reconocer al exón 3 como tal, es específico de hoja y de especie y, tal vez, de gen (pero eso no lo podemos determinar con estos datos). e) Usar una construcción SIN intrones para evitar el procesamiento incorrecto. 3) Para el operón lactosa de Escherichia coli, indique el genotipo de al menos uno de los diploides parciales posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codificada por el gen Z) constitutivamente y permeasa (codificada por el gen Y) en forma normal (es decir inducible con análogos de la lactosa) usando la nomenclatura practicada en las clases de problemas. Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+ lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede ser lacI-) 3) En la película Blade II, el héroe (Blade) es un “semi”vampiro que lucha a favor de la humanidad con los vampiros “malos” que quieren dominar el mundo. En una escena trascendental de la película, Blade es capturado para poder extraer su sangre (y su ADN) porque los vampiros estaban diseñando nuevas variantes transgénicas clonadas con mejor adaptación. Si bien ya habían logrado obtener vampiros resistentes a la plata modificando el gen de la metalotionina, querían extraer de Blade un gen de resistencia a la luz solar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como forma de pago) y dispone de un laboratorio de ingeniería genética excelentemente equipado que le permite, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos (células equivalentes a los fibroblastos humanos). Los vampiroblastos extraídos de vampiros comunes se lisan en presencia de luz solar, mientras que las células extraídas del cuerpo de Blade son luminoresistentes. No se dispone de información alguna sobre la secuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias parciales de aminoácidos de la proteína. Tampoco se pueden planear cruzamientos genéticos de Blade con vampiresas para estudiar su progenie porque llevaría mucho tiempo. Inspirándose en el ejemplo histórico del clonado molecular de los primeros oncogenes ¿qué estrategia de clonado y caracterización funcional del gen de resistencia a luz solar propondría? Respuesta: En caso de seguir los pasos históricos descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.: se extrae ADN total de Blade (sólo o con una “etiqueta” –tag- de secuencia nucleotídica conocida ligada) y se lo usa para transfectar vampiroplastos por la técnica de coprecipitación con fosfato de calcio. Después se exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN total de las células transgénicas resistentes y se fabrica una genoteca en fago lambda. Se releva (“screenea”) la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equivalente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma la identidad del clon de lambda por transfección de vampiroblastos que se convierten en luminoresistentes.

Con técnicas más modernas se aislaría el ADN de Blade y se lo clonaría en BACs (se puede aceptar que sea en otros vectores como cósmidos o en fagos lambda). Con mezclas (“pooles”) de clones recombinantes se transfectan vampiroblastos para identificar células luminoresistentes (por electroporación o usando liposomas). A las mezclas que producen clones positivos se las separa en clones individuales hasta identificar el clon conteniendo el gen de interés. Una vez identificado el clon se subclona y secuencia el inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales son testados funcionalmente de la misma manera. 4) La Dra. Romántica está intentando encontrar genes que aceleren la floración. Con este objetivo en mente procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana mediante la utilización de Agrobacterium, con la siguiente construcción:

LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA, 35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de resistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, tnos: terminador Entre las miles de plantas generadas encuentra una mutante (M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo revela con una sonda radiactiva correspondiente al TDNA completo. Cuando cruzó esta planta con una planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas plantas presentaron floración temprana y otras no. Al repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se obtuvieron los siguientes resultados:

a) ¿Para qué se incluyó el gen quimérico npt II en la construcción? b) ¿Cuál fue el objetivo de introducir un enhancer “suelto” no acompañado de un promotor o de una secuencia estructural? c) ¿Cree que el hecho de que se observen dos bandas en el mutante parental se deba a que BamHI corte dentro del TDNA o a qué se insertaron dos T-DNAs (en lugar de uno) en más de un lugar en el genoma? Analice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la F1. d)¿Qué plantas de la F1 seguiría analizando? Justifique. El hecho de conocer la secuencia de la construcción utilizada le permitió a la Dra. Romántica median-

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te PCR, secuenciación y finalmente comparación con la base de datos del genoma de Arabidopsis, identificar el sitio exacto de inserción del T-DNA. Este sitio de inserción se encuentra 1 kpb río arriba (5’) de un marco de lectura abierto aún no estudiado (ORF4329). e) ¿Qué efecto cree que tiene la inserción del T-DNA sobre el ORF4329? ¿Qué experimento haría para comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los resultados esperados. f) ¿Cree que el ORF4329 es un gen inductor o represor de la floración? Diseñe un experimento complementario al realizado por la Dra. Romántica que, mediante ingeniería genética, le permita comprobar su hipótesis, indicando los resultados esperados. Recuerde que en la transformación mediante Agrobacterium el T-DNA no se integra mediante recombinación homóloga (en biobalística tampoco). g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bastante feas, un estudiante de doctorado de la Dra. Romántica está interesado en ver si los rosales también tienen un gen homólogo al ORF4329. ¿Cómo lo haría experimentalmente sabiendo que el genoma del rosal no está secuenciado? En caso de que haya un gen homologo al ORF4329 presente, ¿cómo clonaría el gen homólogo completo? Respuestas esperadas a) Como gen marcador selectivo que permite seleccionar las plantas transgénicas de las no transgénicas durante la regeneración de plantas en un medio conteniendo el antibiótico kanamicina b) Porque el objeto del experimento es que este enhancer estimule constitutiva y fuertemente los promotores cercanos al sitio de inserción del segmento T con la esperanza de que alguno de ellos estimule la floración temprana. c) No puede haber ocurrido que haya sólo un sitio de inserción y que BamHI corte dentro del DNA-T pues en la F1 las dos bandas segregan independientemente. Seguramente el DNA-T se insertó en 2 sitios distintos. d) Seguiría analizando alguna de las siguientes plantas: 1, 6 o 9 ya que presentan floración temprana, pero no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con la inducción temprana de la floración. El descartar las plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identificación del sitio de inserción. e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el promotor mínimo, pero sí se ubica cercano al promotor, la inserción del DNA-T estaría aumentando la transcripción del ORF4329 mediante los enhancers 35S. Para comprobar esta hipótesis habría que realizar un Northern partiendo de mensajeros de plantas normales y mutantes (sería interesante comparar también tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es constitutivo) utilizando una sonda complementaria al ORF4329. f) Es un inductor de la floración pues al aumentar su expresión se adelanta la floración. Para comprobarlo se podría hacer un antisense del ORF4329 y espero

ver un retraso o ausencia de floración. Si repito el Northern vería menos mensajero que en el normal. g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los alumnos sería realizar un knock out de ese ORF. En realidad teóricamente no sería correcto pues en plantas no suelen realizarse knock outs, pero ellos probablemente no lo sepan (conceptualmente no importa, técnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en bacterias, se hacen por interferencia transformando transitoriamente con RNAi o establemente con construcciones que expresen iRNA). Además está la aclaración de que la integración del T-DNA no es por recombinación homóloga y sí saben que para hacer un knock out dirigido se requiere recombinación homóloga. h) Haría un Southern usando como sonda al ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la hibridación. Para clonarlo haría una genoteca y localizaría el gen homólogo mediante hibridación con la sonda de Arabidopsis. 5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos de aproximadamente 24 horas permiten a los organismos regular su actividad con la alternancia díanoche. Aunque estos ritmos son autónomos, algunos estímulos externos, tales como la luz, pueden “poner en hora” este reloj interno. En mamíferos, existe un marcapasos central, ubicado en el núcleo supraquiasmático (NSQ) del hipotálamo anterior. Varios genes están involucrados en el mecanismo molecular del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroalimentación positiva y negativa a nivel de la expresión y de la actividad de las proteínas que codifican. Se sabe que la fase de este marcapasos central se puede adelantar con un estímulo lumínico durante la “noche” relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a través del tracto retino-hipotalámico (que libera el neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase está asociado a un aumento rápido de la expresión del gen Per1. Río arriba (hacia 5’) de este gen se encuentra una secuencia cre (elemento de respuesta a cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones el factor de transcripción CREB. Se realiza el siguiente experimento: a un cultivo sincronizado de células del NSQ de ratón se lo estimula durante la noche relativa con concentraciones adecuadas de glutamato (provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o db-cAMP (dibutiril cAMP: análogo del cAMP que puede atravesar la membrana celular) o con solución salina (control). Después de 30 minutos se extraen RNA y proteínas. Northern Blot con sonda para Per1: Control Glut db-cAMP

Relación entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado Relación CREB-P/CREB Control Glut. db-cAMP 0,3 4,2 2,2

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Esta relación se determinó realizando Western Blot con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P. Para poder confirmar el rol de CREB se construyó el siguiente sistema indicador (reportero) y se transfectó en células del NSQ en cultivo. Prom: promotor del gen Per1. cre
Prom

Sec estr.gen luc

La luciferasa (codificada por la secuencia estructural del luc) es una enzima que reacciona con el agregado de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la actividad de estas células en las siguientes condiciones: + inhibidor de AC - (baja expresión) - glutamato - sin inhibidor - (baja expr.) +++ (alta expr.) + inhibidor de AC + (expr. media) + glutamato - sin inhibidor AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a partir de ATP, responsable del aumento de cAMP durante la transducción de señales de diversos estímulos. Interpretar estos resultados. Se sospecha que el glutamato ejerce su acción vía cAMP pero que esta podría no ser la única vía en que lo hace. ¿Qué opina acerca del rol de CREB en los dos tipos de estímulo? Justificar. Respuestas a) Esta respuesta implica un mínimo de detalle de descripción de para qué se hicieron los 3 experimentos y qué datos aporta cada uno. Conclusiones: tanto glutamato como cAMP inducen la expresión de Per1. La inducción por glutamato es más fuerte que por cAMP. Además, el glutamato es capaz de activar el promotor de CREB aún en presencia de inhibidores de la AC. b) La contestación a esta pregunta puede tener algunas variantes de respuesta y se evaluará en función de la coherencia del razonamiento que se emplee. La respuesta esperada es que puede deberse a que el glutamato activa la misma vía de señal del cAMP y además otra (u otras) o a que activan vías totalmente separadas que terminan en el mismo efecto (siendo la de glutamato una vía más fuerte). En cuanto a CREB, se ve que la fosforilación de CREB se corresponde con una alta expresión, por lo que podría pensarse que CREB está implicado en la activación de Per1. El menor efecto de cAMP también se ve en este caso, lo que lleva a pensar en principio que la menor expresión vista con cAMP se debería a una menor activación de CREB y no a que falte activarse otro factor de transcripción además de CREB que sí se active con glutamato.

presentan a los cobayos negros y los blancos a los cobayos de fenotipo blanco. Se dispone del siguiente árbol genealógico, en el cual los individuos II1 y II4 pertenecen a líneas altamente endocriadas (asumir que pertenecen a líneas puras). a) Represente I 2 1 el genotipo probable de cada indiviII 1 2 3 4 duo (en los casos de que III 1 2 ? pueda ser más de uno, represente con un guión bajo, i.e. B_) b) Calcule la probabilidad de que un descendiente del cruzamiento entre III1 y III2 sea blanco. Para contestar es suficiente que escriba los genotipos al lado de los símbolos en el esquema y las probabilidades (sólo de las que se usarán para hacer los cálculos) sobre el esquema (puede dibujarlo o escribir sobre este enunciado). De lo contrario, explique su razonamiento Respuestas esperadas:

I BB II III

Bb 1

2

Bb

2/3 BB ---Bb 1 2 bb 3 4 ½b ½ BB ½b Bb 1 2 ½ Bb ?

Mendel y extensiones
1) En los cobayos, el color de pelo (negro vs blanco) es determinado por el gen B. Los símbolos negros re-

En caso de respuesta con explicación: I1 y I2 tienen que ser heterocigotas (Bb) porque si no, no podrían tener un hijo blanco II1 y II4 son BB por definición de líneas puras, II2 bb porque su fenotipo refleja su genotipo II3 es B_ porque no podemos saber qué segundo alelo recibió. Tiene 1/3 de posibilidades de ser BB y 2/3 de ser Bb (son tercios y no cuartos porque se descarta que pueda ser bb dado que su pelaje es negro). III1 es Bb porque deriva de un BB y un bb III2 es B_ dado que, como se explica arriba, existe una probabilidad de 2/3 que su padre II3 sea Bb Si II3 era BB, III2 es BB. Si II3 era Bb, existe ½ de probabilidad de que III2 sea BB o Bb. Sólo si III2 resulta Bb, podrá tener ¼ de posibilidad de tener un hijo blanco con III1 Por lo tanto, la probabilidad de que se produzca un cobayo blanco es (2/3)(1/2)(1/4) = 2/24 = 1/12 2) La anemia de células falciformes (ACF) es un proceso hereditario humano causado por un alelo autosómico recesivo de muy baja incidencia en las poblaciones occidentales. Un matrimonio quiere conocer la probabilidad de tener un hijo afectado. Con sus conocimientos sobre herencia mendeliana ¿qué podría decirles si: a) ambos miembros de la pareja son normales, pero cada uno de ellos tiene un padre afectado y el otro progenitor no tiene historia familiar de ACF?

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b) el marido está afectado por la enfermedad pero la mujer no tiene antecedentes familiares de ACF? I) Para cada caso construya las genealogías posibles para esta familia indicando los genotipos y fenotipos de todos los individuos involucrados. II) ¿Sobre qué fundamento(s) incluido(s) en la/s ley(es) de Mendel) se apoyan sus predicciones en los casos anteriores? Nomenclatura: S alelo determinante de hemoglobina falsiforme, N de Hb normal, _ puede ser cualquiera de los 2 alelos (N o S) Respuesta: a) ¼ b) 0 I) a) abuelos SS (enfermo) x NN (sano) padres SN (sanos en ambos casos) hijos posibles NN, SN o SS b) abuelos en un caso: S_ x S_ (ambos sanos o enfermos) padre SS (enfermo), abuelos en otro caso NN x NN padre NN (sanos todos) II) En el concepto de segregación de los alelos al formar las gametas que darán origen a la progenie explicitada en la primera ley de Mendel. 3) La corea de Huntington es una enfermedad rara, mortal, que aparece normalmente a mediana edad. Se debe a un alelo dominante. Un hombre fenotípicamente normal, de poco más de 20 años, advierte que su padre ha desarrollado la corea de Huntington. a) ¿Cuál es la probabilidad de que más tarde él mismo desarrolle la enfermedad? b) ¿Cuál es la probabilidad de que la desarrolle su hijo al cabo del tiempo? (Nota: Para sus cálculos asuma que la frecuencia del alelo que produce la enfermedad en la población humana es insignificante). Respuesta Suponiendo que el padre que desarrolla la enfermedad fuese heterozigota para el alelo mutante (dado que la probabilidad de que también lo tenga la madre es insignificante): a) ½ b) ¼. Si suponen que el padre también podía ser homocigota (además de heterocigota) y se hacen los cálculos correctos [a) 1 b) ½ ] para esta segunda posibilidad el problema se considerará bien contestado. Si ponen homocigota como única posibilidad aún cuando se hagan los cálculos correctos, el problema está mal contestado. 4) Dos plantas enanas de maíz (E1 y E2) tenían origen distinto, pero eran fenotípicamente idénticas. Se cruzaron cada una de estas plantas enanas con una línea altamente endocriada de plantas altas que, se sabía, son homozigóticas para todos los genes que determinan el tamaño. Ambos cruces dieron lugar a una F1 constituida únicamente por plantas altas. Al autofecundar cualquier planta de la F1, la proporción de la F2 fue de 3 altas: 1 enana. Los cruzamientos entre las dos líneas enanas paternas E1 x E2, solo dieron lugar a plantas altas en la F1. A pesar de este resultado, en la F2 reaparecieron las variantes enanas. La proporción de plantas enanas en la F2 fue de 7/16. a) Explicar los resultados obtenidos, indicando todos los genotipos implicados.

b) ¿Qué proporciones genotípicas y fenotípicas esperaría si se realizase el cruzamiento prueba de la F1 del cruzamiento E1 x E2 con el progenitor E1? Respuesta a) Dos genes afectan al tamaño A (normal)> a (enanismo 1) B (normal)> b (enanismo 2) [Es un caso de epístasis complementaria] P E1=AAbb x E2=aaBB F1 AaBb (altas) F2 9 A_B_ (altas) vs 7 aa__ o __bb (enanas) b) AaBb x AAbb AABb ¼, AaBb ¼, AAbb ¼, Aabb ¼. Proporciones fenotípicas: A- B- 1/2 altas; A- bb 1/2 enanas 4) Un joven de 35 años se acerca a un consultorio médico con el fin de investigar cuáles son las chances de desarrollar la enfermedad que aquePedigrí de la familia. El individuo 4 ja generación es el que se acercó al consultorio. tras generación a su familia. Su abuelo materno y su madre murieron de una rara enfermedad neurodegenerativa que los sorprendió a la edad de 45-50 años, y que ahora también aqueja a su hermana mayor, pero no así a sus otros dos hermanos, ambos ya en sus 50’s. Lo primero que hace el médico es analizar el árbol genealógico de la familia: a) ¿Qué tipo de herencia tiene esta enfermedad? b) Determine los posibles genotipos de todos los individuos esquematizados en el pedigrí (con excepción del 4).

A partir de la descripción de la enfermedad y del árbol genealógico el médico sugiere que el paciente se haga un análisis de DNA para tratar de detectar la posible existencia de una enfermedad de esas características, para la cual, afortunadamente, se tienen marcadores moleculares que se sabe que cosegregan perfectamente con el gen mutado. c) ¿Qué características esenciales debe tener un marcador molecular para que sirva en el análisis de cosegregación? ¿Qué tiene que permitir distinguir? De esta forma el médico analiza resultados de los exámenes del individuo en cuestión y de todos sus hermanos, obtenidos con el marcador PV123:

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d) ¿Qué sonda se utilizó para revelar el Southern? Esquematizar la región cromosómica correspondiente y marcar dónde híbrida la sonda. e) A la luz de estos resultados, ¿qué le diría al muchacho? Justifique su respuesta analizando los resultados del Southern. Respuesta: a) Debida a un alelo dominante b) Aa x aa ↓ Aa x aa ↓ (1) Aa , (2) aa, (3) aa, (4) ? (por lo que se ve más abajo es Aa) c) Estar localizado (mapear) lo más cerca posible (estrechamente ligado) al locus a diagnosticar. Me tiene que permitir distinguir no solamente al enfermo (o que potencialmente se va a enfermar) del no enfermo (fenotipo) sino también homocigotas de hetrocigotas (sobre todo en enfermedades recesivas, que no es este caso). d) El marcador PV123 tiene 2 alelos: uno que se visualiza como una banda de 5 kb (alelo “sano”) y otro como 2 bandas de 3 y 2 kb (alelo “enfermo”), respectivamente. [El polimorfismo probablemente se deba a la aparición de un nuevo sitio de restricción en el segundo caso] e) Que comience un tratamiento para amortiguar la aparición de la enfermedad dado que es portador del alelo que predispone a la enfermedad. 5) Se presentó ante los tribunales de justicia el siguiente caso: la familia Pérez reclama que cierto bebé (Juan), que les dieron en la maternidad, no les pertenece y que, en cambio, el bebé Felipe, que tiene la familia García, es el suyo y se lo cambiaron. La familia García niega este hecho, y el tribunal ordena el examen de los grupos sanguíneos de los bebes y de los padres, con los siguientes resultados: Ma- PaBebé dre dre Familia Pérez AB O A (Juan) Flia. García A O O (Felipe) ¿Qué familia tiene razón y por qué? Respuesta: la García. Si escribimos los genotipos completos de los padres resulta claro que el primer podría ser resultado de cualquiera de las 2 parejas, pero el segundo bebé sólo de la segunda Ma- Pa- Bebé dre dre Familia Pérez AB OO AO Flia García AO OO OO

Mapeo
1) En una determinada especie animal los loci A,a; B, b y C,c se localizan en el mismo autosoma. El locus B,b es el central. La distancia entre A,a y B,b es de 20 unidades de mapa, la distancia entre B, b y C, c es de 10 unidades de mapa y el coeficiente de coincidencia es 0,6. Indicar la proporción esperada de individuos obtenidos con el fenotipo Abc.

Respuesta: Cc = Frecuencia de dobles observadas (FO) / Frecuencia de dobles esperados (FE) = 0.6 ⇒ FO= 0.6 x FE= 0.6 x 0.2 x 0.1=0.012 Nº de dobles observados = 0.012 x 100 = 1,2% individuos dobles recombinantes: AbC y aBc distancia. A-B = Nº de Individuos recombinantes entre estos marcadores + Nº de dobles recombinates x 100 / nº total de individuos = 20⇒ nº ind. rec. entre estos marcadores + 1,2 = 18,8 Es decir, 18,8 % son recom. Abc y aBC por lo tanto aproximadamente tendremos la mitad de individuos de cada tipo: 9,4 % 2) Se está estudiando una nueva especie de plantas descubierta recientemente. Se sabe que el alelo Q codifica para hojas verdes, y el q para hojas moteadas (Q domina sobre q); por su parte el alelo R codifica para hojas redondas, y el r para puntiagudas (R domina sobre r). Todavía no se sabe la función del gen E/e. A estos investigadores les resultó raro que, a pesar de haber muestreado una gran región en la que este tipo de planta habita, no se encontró ninguna planta con hojas verdes y puntiagudas simultáclases Nro neamente. Para dilucidar esta cuesEqR 280 tión, se realizó un cruzamiento eqr 203 prueba, y los resultados fueron los EQR 199 siguientes: eqR 7 a) ¿Qué genes están ligados? 67 b) ¿Hay interferencia? Contestar si Eqr 279 o no, no hace falta calcularla eQr numéricamente (lo mismo en a) eQR 73 c) ¿Por qué piensa que no se observan individuos de uno de los genotipos posibles? e) Analizando los resultados, discuta qué supuestos de los que se utilizan para este tipo de estudio para calcular las distancias génicas en base a las frecuencias observadas pueden no estar cumpliéndose. Rta: a) Q/q y E/e están ligados, E/e y R/r están ligados, q/Q y R/r no parecerían estar ligados porque el porcentaje de recombinación es del 50%. Sin embargo, se encuentran en el mismo cromosoma (están “ligados” a 50 um o más) Para hacer los cálculos (no pedidos para responder la pregunta), primero tienen que sacar el locus central que es el E/e. Después: dist Q/q – E/e = 36,9 um dist E/e – R/r = 13,27 um dist q/q – R/r = 50,07 um (“no” están ligados) Lo correcto para calcular la distancia entre los genes de los extremos es sumar las distancias internas (da 50,07 um), en vez de realizar una prueba de dos puntos (da 48,92 um), pues de lo contrario no se estarían considerando los dobles recombinantes. b) Si. Para hacer los cálculos (no pedidos para responder la pregunta) Cc = 7 / 54,25 = 0,12 Por lo tanto I = 1- 0,12 = 0,88 Siendo 7 el nro de dobles rec observados

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Siendo 54,25 el nro de dobles rec esperados (0,369 * 0,1327 * 1108) Siendo 1108 el total de individuos c) Una posibilidad es que, como sugería el enunciado, la combinación de alelos Q/q r/r sea letal, siempre y cuando a su vez el genotipo sea E/e. En el campo abierto podría presentarse el mismo fenotipo generado por el genotipo anterior por ejemplo por la combinación de QQ Ee rr, Qq EE rr ò Qq eE rr (pues se pueden dar todas las combinaciones posibles, al no tratarse de cruzamientos prueba). Dado que en el enunciado se menciona que a campo abierto no se observa ese fenotipo (hojas verdes y puntiagudas) se puede pensar que tanto Q/Q r/r como Q/q r/r son combinaciones letales en presencia de por lo menos un alelo E. (y no en presencia de ee, ya que se observan parentales del cruzamiento prueba que son Qq ee rr) d) Hay que recordar que para calcular distancias en base a frecuencias fenotípicas, se supone que todas las gametas son igualmente viables. En este caso vemos que no es así. Respuestas esperadas a) Las gametas de los caballos tendrán 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32 +31 = 63 (¡el “2n” de la mula es impar!). b) A los problemas de apareamiento y segregación meiótica derivados de cromosomas tan disímiles y de número impar.

cas células se convertirían en “Hfr”). Sin embargo, tendrá el mismo problema que la cepa b).

2) Se realizaron experimentos de conjugación interrumpida entre cepas Hfr AmpS leu+mal+trp+ y F- AmpR leu-mal-trp-. Los resultados se exponen en la siguiente figura: (mal: capacidad de metabolizar la maltosa)

Genética Bacteriana
1) ¿Cómo esperaría que fuera la transferencia heredable del gen lac+ en cruzamientos entre cepas donoras de E. coli lac+ a) Hfr, b) F+ y c) F'lac con cepas receptoras F- lac- incapaces de recombinar (rec-)? Justifique su respuesta Respuesta: El único cruzamiento capaz de transferir el gen lac+ en forma heredable es aquel en el que interviene la donora c) F'lac debido a que el gen lac+ forma parte del plásmido transferido que no requiere de recombinación (entrecruzamiento) para mantenerse establemente en la célula receptora.. La cepa b) es capaz de transferir lac+ pero la cepa receptora requiere de las funciones de recombinación homóloga para que se produzca el reemplazo alélico (entrecruzamiento) para integrar establemente el gen recibido. Como el segmento transferido es inestable (es lineal, no puede replicarse correctamente y es susceptible a degradación por nucleasasas) termina perdiéndose. La cepa a) F+ sólo puede transferir lac+ con muy baja frecuencia si en alguna de sus células el factor F se integra previamente al cromosoma principal (esas po-

1) ¿Por qué los recombinantes para leu y mal aparecen con mayor número de recombinantes? 2) Explique en qué medios se hicieron crecer las bacterias para analizar su genotipo, y qué tipo de bacterias (qué genotipo) crece en cada uno. 3) ¿A qué distancia del ori de transferencia mapea el gen que codifica para trp? Y los que codifican para leu y mal? 4) ¿Qué experimento haría para determinar el orden entre leu y mal? 5) Dibuje, indicando Origen de transferencia y terminación, el modo en que el plásmido F se integró al cromosoma bacteriano y dio origen a esta HFR. 6) ¿Qué tipo de recombinación ocurre para que las bacterias leu- pasen a ser leu+? ¿Qué tipo de recombinación ocurre cuando el plásmido F se integra en el cromosoma bacteriano? (15 ptos) Rta: 1) Porque al estar más cerca del origen de transferencia pasan antes y le dan menos tiempo a las bacterias conjugantes a que se separen espontáneamente e interrumpan la transferencia. 2) MM + ampicilina + los 2 aac que no se analizan en cada caso F- AmpR aac+ donde aac+ es leu+, mal+ (que en realidad no es un aminoácido) o trp+, respectivamente. Para los otros 2 genes cuyos aac están presentes en el medio, los genotipos pueden ser + o -. Por ej, en el primer caso el genotipo es F- AmpR leu+ mal+/trp+/-

B

B

B1

N

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3) 10’, 5’ S19 bp26 bmp18 / 1 4) una prueba de recombinación equiva990 bp 696 bp p26f p26r p18f p18r lente a una prueba de 3 puntos con los 3 B + B marcadores de este experimento. 5) Diluc Primer evento bujito R pKS26L Kn de entrecruza3) Un tema de interés para la medicina sac humana y veterinaria es el desarrollo de Integración del plásmido suicida vacunas más confiables. En el caso de la R 2 Kn brucelosis (que es una zoonosis, es deluc bp26 bp26 bmp18 / sacB cir, enferma a animales y a humanos) se a b desarrollaron vacunas para el ganado Segundo evento Selección con sacarosa vacuno que consisten en bacterias vivas de entrecruzaatenuadas por diferentes procedimientos N B de cultivo. En este contexto, en la Arluc bmp18 3 / 1837 bp 990 bp gentina se utiliza la cepa S19 que tiene p26f p26r p18f p18r algunos problemas porque no está sufi+ Δbmp18 cientemente atenuada. Con el adveniR Primer evento pSD18 miento de la ingeniería genética se puAp de entrecruzadieron caracterizar genes como el bp26 sacB y el bmp18 que, al ser mutados, práctiIntegración del plásmido suicida camente eliminan la virulencia, tal como 4 lo publican Campos y col (Veterinary R sacB Ap Δbmp18 bmp18 luc Microbiology, 2002). En un trabajo pre/ a vio, lo demostraron mediante el desarrob Segundo evento llo de mutantes knock-out para ambos Selección con sacarosa de entrecruzagenes. a) Indique una estrategia de cómo 5 Δbmp18 hubiese obtenido Ud. esta mutante INTA2 luc / 694 bp 1837 bp knock-out. Utilice exclusivamente esp26f p26r p18f p18r quemas para su respuesta distinguir animales vacunados de infectados en forma Debido a que no resulta deseable la liberación de organismos modificados genéticamente conteniendo sencilla, barata y masiva. Tradicionalmente, el diagenes de resistencia a antibióticos (y menos si éstos gnóstico se realiza mediante la detección de anticuerson patogénicos), para la construcción de la cepa mu- pos anti-Brucella en sangre porque la bacteria es muy tante vacunal Δbp26::luc Δbmp18 (Δ simboliza dele- difícil de detectar y no resulta sencillo diferenciar ención y :: simboliza inserción y que bautizaron IN- tre los animales que tienen estos anticuerpos debido a TA2) usaron una técnica de contraselección (ver Figu- que estuvieron infectados o porque fueron vacunados. ¿Qué solución le parece que proponen los diseñadores ra). de esta vacuna? Aclaraciones: El gen sacB (de Bacillus subtilis) codiRespuestas esperadas: a) Se podría usar el mismo fica para una levansacarasa que metaboliza la sacarosa esquema del enunciado (parte izquierda) reemplazanen un levano que es tóxico para Brucella. Es decir que do el gen luc por un gen de resistencia a antibiótico las bacterias que contienen este gen se mueren cuando (por ej. a Tetraciclina) y manteniendo el gen de resisse agrega sacarosa al medio de cultivo. a y b señalan tencia a kanamicina (o el SacB) para seleccionar el secuencias homólogas (probables sitios de entrecrudoble recombinante. zamiento). El gen luc codifica para la luciferasa de b) i) Suponiendo que se quiera ir paso a paso (como luciérnaga, los genes ApR y KnR para resistencia a sugiere el flujo de esquemas) y seleccionar primero el ampicilina y kanamicina, respectivamente. En varios cointegrado (construcción 2) y recién después el doble de los genes se especifican, con flechas, oligonucleórecombinante (construcción 3): KnR serviría para setidos diseñados para PCR y el tamaño del fragmento leccionar en un medio conteniendo kanamicina (en de amplificación esperado. ausencia de sacarosa). En un segundo paso, se pasarb) ¿Qué función específica cumplen los siguientes ían las bacterias a un medio conteniendo sacarosa, en genes marcadores en el esquema de obtención de la ausencia de kanamicina. [De hecho, esto fue lo que cepa vacunal? hicieron los autores del trabajo]. Lo mismo con ApR i) ApR y KnR (2 ptos); ii) luc (2 ptos); iii) sacB para el gen bmp18. c) ¿Porqué se usaron plásmidos suicidas? Otra respuesta correcta: Suponiendo que se quisiera d) Diseñe un sistema molecular de detección para dis- seleccionar directamente la construcción 3, sin pasar tinguir los 5 genotipos posibles entre sí. Explíquelo. por la construcción 2 (doble recombinante directo), e) Un punto importante en cualquier campaña de erra- KnR no tiene función alguna en el experimento del dicación de enfermedades como la brucelosis es poder

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problema. Al utilizarse el sistema de contraselección PCR. En la realidad, esta última variante no es practibasado en SacB podría no estar presente, sin afectar cable, porque la cepa vacunal sobrevive muy poco a con su ausencia el resultado. En este caso, su única las defensas del animal y resulta muy lento, peligroso función es ser un marcador selectivo en E. coli (otorga y poco práctico el aislamiento de bacterias patogénial plásmido una ventaja selectiva que ayuda a mante- cas. nerlo, evitando su pérdida, durante su multiplicación 4) Bacterias de una cepa de E. coli Hfr rec+ bio+ his+ en E. coli). En el caso del segundo plásmido conte- StrS son mezcladas junto a bacterias de otra cepa de E. niendo ApR, esta aproximación es mucho más difícil coli F- rec+ bio- his- StrR. A diferentes tiempos, se (aunque no imposible) porque no tengo un gen indica- inter-rumpieron las conjugaciones, se plaqueó en los dor y sólo puedo distinguir dobles recombinantes siguientes medios selectivos (todos conteniendo Str) (construcción 5) de salvajes (construcción 3) mediante y al día siguiente se contó el N° de colonias. (MM = PCR de las colonias, por ej. medio mínimo) Tiemp Nº de colonias en ii) Este gen sirve para distinguir las mutantes “knock (min) M MM+b MM+h MM+bio+ out” para el gen bp2 que quiero seleccionar (consM io is his trucción 3) de las revertantes salvajes (construcción 5 0 0 0 503 1), dado que ambas sobreviven en el medio conte10 0 0 34 487 niendo sacarosa. 15 0 0 44 499 iii) Como dice el enunciado, este gen sirve para con20 0 0 50 503 traseleccionar (seleccionar en forma negativa) las 25 0 0 59 498 construcciones 2 y 4 en presencia de sacarosa. 30 20 30 80 501 c) Básicamente, el que el plásmido sea suicida me a) El experimento anterior se aprovechó para mapear permite seleccionar más eficientemente al recombilos genes involucrados en la síntesis de biotina. nante. Suponiendo que la selección de las construcUbique en el mapa genético el gen bio. Se aclara la ciones se hizo paso a paso [como se explica en “b) posición donde está integrada la secuencia del i)”], si el plásmido replicara en Brucella, la selección plásmido F en esta cepa Hfr, y además la del gen his, en presencia de kanamicina solo me daría muchísimas previamente mapeado. bacterias con el plásmido sin integrar y me sería exb) Un amigo suyo, estudiante de Biología, le cuenta tremadamente dificultoso aislar el recombinante que hizo un experimento de conjugación -mientras (construcción 2) por su baja probabilidad de ocurrenmiraba videoclips de Britney Spears- con una cepa cia. Hfr diferente a la anterior, la cual, al conjugar con la Ahora, suponiendo la alternativa de selección directa misma F- que en el experimento del doble recombinante [como se explica en “otra resanterior, le transfiere el gen his a puesta correcta” en “b) i)”], el primer plásmido podría los 20 min y el gen bio a los no ser suicida, porque sería seleccionado en forma F 40 min. ¿Le creería a su negativa en presencia de sacarosa. amigo o pensaría que se d) Por PCR usando los primers flanqueantes de los distrajo mientras hacía los his genes. Las construcciones 1, 3 y 5 darían una sola experimentos? banda por primer (total 2 bandas), a saber 696 + 990 c) Un fago que hace en 1, 1837 + 990 en 3 y 1837 + 694 en 5. Los cointetransducción generalizada grados darían 2 bandas, para el par de primers p26 en puede encapsidar fragmentos de 2 o para el par de primers p18 en 4. En total 3 bandas. DNA genómico de una cepa bacteriana infectada y También se considerarán correctas respuestas con lisada que tengan un tamaño de hasta 30.000 pb. Si otras variantes (detección de fluorescencia en lugar de ese fago es usado para infectar una cepa de E. coli la banda de 1837 combinada con PCR de los otros salvaje, y el lisado resultante es usado, a baja genes; RFLPs usando bp26 y bmp18 como sondas, multiplicidad de infección, para infectar a la Fdetección de las proteínas codificadas mediante Wesmencionada antes. ¿Esperaría observar colonias en tern, etc.), siempre y cuando la respuesta permita difeMM? Justifique (1 min equivale a 20 kpb aprox) renciar claramente los 5 genotipos. e) ¿Usaría Ud. la cepa F- en MM para testear la mutae) La presencia de anticuerpos anti-luciferasa diferengenicidad de una sustancia en un test de Ames? cian animales vacunados con esta cepa respecto de los que se infectaron con una cepa salvaje no recombinan- Respuestas esperadas a) El gen bio entra a los 10’ te. La ausencia (versus presencia) de anticuerpos con- y el his a los 30’, por lo tanto el gen bio se encuentra a 1/3 de la distancia entre F e his.b) Le creo, seguratra bp26 y bmp18, es otra variante de la respuesta. También se considerará correcta (con la mitad de la mente tiene un Hfr distinto con el F integrado apunnota = 2,5 ptos) la respuesta que proponga el aisla- tando al revés y en otra posición. Nótese que la dismiento de bacterias del animal, las cuales deberían no tancia entre his y bio es de 20’ (igual que en este exser fluorescentes en presencia de luciferina en el caso perimento). c) No, están demasiado lejos para ser code la cepa de campo y ser fluorescentes en el caso de transducidos. d) No, porque es una doble auxótrofa y la cepa vacunal. Idem si la técnica seleccionada es una por lo tanto requiero de la mutación (reversión) si-

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multánea de al menos 2 bases distintas y cuya reversión no necesariamente requieren del mismo mecanismo de mutación Respuesta alternativa que, en caso de aparecer, debe ser considerada correcta: Sí, si utilizo MM+ bio (o MM+ arg) 4) Un investigador está interesado en mapear y estudiar 3 genes bacterianos a, b y c involucrados en la biosíntesis de aminoácidos. Se sabe que los productos de los genes a, b y c catalizan las siguientes reacciones: C
Leu A X B Val Ile

vectores
Alu I

que
P

se
Alu I

muestran.

AmpR Vector 1

AmpR

P = promotor del operón Vector 2 lac

donde X es un compuesto que puede ser sintetizado por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio mínimo (MM). Para realizar el estudio dispone de 2 cepas de bacterias: Hfr a+b+c+ StrS y otra F- a- b- c- StrR con las cuales realizó un experimento de conjugación interrumpida obteniendo los siguientes resultados:
Nº recombinantes

c+ StrR

a+ StrR b+ StrR

a) ¿En qué medios se seleccionaron cada uno de los genotipos de bacterias del gráfico anterior? b) ¿A qué distancia del origen de transferencia de la cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c? c) Grafique y explique los resultados que hubiera tenido en el experimento de conjugación interrumpida si el genotipo de la cepa dadora hubiese sido: i) Hfr a+b+c+ StrR ii) F+ a+b+c+ StrS iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr se encontrara entre el gen b y el c. El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran parte de una misma vía metabólica le sugirieron al investigador que a y b pertenecen a un mismo operón. Con el objeto de estudiar esta posibilidad realizó el siguiente experimento: A) Se digirió ADN genómico de una cepa salvaje con la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitantes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los

4

8

12

16

20

24

t (min)

B) Luego se transformaron bacterias a- b- c+ AmpS con uno de los vectores y se plaquearon las bacterias transformantes en ágar + MM + ampicilina + un aminoácido. Cada una de las colonias que crecieron en estas placas fueron luego cultivadas en ágar + MM + ampicilina obteniéndose los siguientes resultados: Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu crecieron también en MM+Amp. -De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el 60% crecieron en MM+Amp. Vector 2: De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp +Lac. -De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+ Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac. d) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que crecen en cada uno de los 3 medios? e) ¿Cómo interpreta los resultados de este experimento? Demuestre que estos resultados son compatibles con la hipótesis de que a y b están en el mismo operón. f) ¿Cuál de los genes está más cerca del promotor: a o b? Justifique. g) ¿Cómo haría, utilizando la técnica de PCR, para demostrar que a y b pertenecen al mismo operón? Indique los resultados esperados tanto si a y b forman parte de un operón como si se transcriben independientemente. Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile c+ StrR = MM + Str + Leu + Val b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min. c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras por lo que no hubiera habido diferencias entre los distintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos. ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes (aquellas en las que el plásmido F+ se hubiera incorporado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b o c se hubieran transferido a la cepa aceptora). iii) Dependiendo de la orientación del OriT hay dos posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante tiempo después salga c -que c salga primero y bastante tiempo después salgan a y b. En el gráfico tienen que quedar claro esto, y además que la frecuencia de recombinantes para los genes que

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salen primero debe ser bastante mayor que la de los genes que salen al final. d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, b+ AmpR MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, a+ AmpR MM+Amp = a+ b+ AmpR La lactosa no importa, sólo se usa para inducir la expresión mediada por el promotor lac. e) De las bacterias transformadas con el vector 1 todas las bacterias b+ también eran a+, pero sólo el 60% de las a+ eran b+. En cuanto a las bacterias transformadas con el vector 2 el 55% de las bacterias b+ también eran a+, y el 50% de las a+ eran también b+. La diferencia en los resultados obtenidos con ambos vectores radica en que el vector 1 no contiene un promotor por lo que la expresión de los transgenes se dará solo si vienen acompañados de su promotor. El hecho de que todas las bacterias b+ sean también a+ nos indica que b se transcribe utilizando el promotor de a sugiriendo que a y b forman parte de un operón. En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor (y éste está encendido debido a la lactosa) sí se obtienen bacterias a-b+. f) Dado que, cuando se transformó con el vector 1, no se obtienen bacterias a-b+ pero sí a+b- esto nos sugiere que no se necesita que se transcriba b para que se transcriba a (pero sí al revés). Esto indicaría que a se encuentra más próximo al promotor que b. g) RT-PCR usando primers de la región 5´ del gen a y de la región 3´ del gen b. Si amplifico es porque hay transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras posibilidades que se evaluarán caso por caso… 5) Se realiza un experimento de transformación con una cepa bacteriana donante resistente a cuatro antibióticos: A, B, C y D. La cepa receptora es sensible a las cuatro drogas. La población de células receptoras tratada se divide y se Antibióticos Nº colonias siembra en placas de meA 1.156 dios suplementados con B 1.148 varias combinaciones de C 1.161 las drogas. Los resultados D 1.139 fueron: AB 46 AC 640 a) Uno de los genes está AD 942 claramente alejado de los BC 51 otros tres, los cuales pareBD 40 cen estar estrechamente CD 786 ligados. ¿Cuál es el gen ABC 30 distante? ABD 42 b) ¿Cuál es el orden de los ACD 630 tres marcadores que están BCD 36 ligados? ABCD 30 Rta: a) B es el gen distanTotal 7.877 te; b) A D C.

Mutagénesis y Transposición
1) En levaduras, el tratamiento con mutágenos permitió seleccionar, en forma independiente, varios tipos

de mutantes auxótrofas incapaces de utilizar galactosa como nutriente. El mapeo de las mutaciones responsables de esta característica permitió clasificarlas en 2 grupos de ligamiento distintos (mendelianamente independientes). a) ¿Significa este resultado que los genes involucrados se encuentran en 2 cromosomas distintos? ¿Por qué? b) ¿Cuál será el fenotipo resultante del diploide resultado del cruzamiento entre mutantes (haploides) pertenecientes a distintos grupos de ligamiento? ¿Por qué? c) ¿Cómo serán las proporciones fenotípicas de las levaduras (haploides) derivadas de las ascosporas una vez producida la meiosis? d) ¿Qué clase de mutagénesis es la más apropiada para este tipo de experimentos? ¿la producida por radiación γ (gamma) o por algún compuesto químico como el EMS o la nitrosoguanidina? Justifique muy brevemente. Respuesta: a) En principio sí, los grupos de ligamiento pueden comprender y extenderse más allá de 50 u de recombinación y pertenecer al mismo cromosoma [es decir, si bien 2 genes o marcadores pueden comportarse mendelianamente como independientes por estar a más de 50 unidades de mapa, a través de otros marcadores o genes intermedios puedo incluirlos a ambos en el mismo grupo de ligamiento = cromosoma. Sin embargo pueden existir 2 grupos de ligamiento pertenecientes al mismo cromosoma si no tengo la suerte de encontrar marcadores o genes intermedios]. b) Protótrofa. Por complementación. [Si a es el alelo mutante de A y b de B: Ab x aB AaBb fenotipo salvaje] c) 3 a 1, auxótrofas a protótrofas [¼ ab, ¼ Ab, ¼ aB vs ¼ AB] d) Usualmente se utiliza algún mutágeno químico (como EMS o nitrosoguanidina) que producen mutaciones puntuales y se pueden dosificar más fácilmente. La radiación γ produce rupturas, deleciones y rearreglos cromosómicos groseros, por lo que sería menos conveniente. 2) Se estudia el efecto de 2 conocidos mutágenos en levaduras: el etil metanosulfonato (EMS) y el bromuro de etidio (EtBr) observando la frecuencia de aparición de petites (levaduras que forman colonias de crecimiento mucho más lento que las normales o grandes, debido a un malfuncionamiento del sistema de fosforilación oxidativa). A primera vista, los resultados parecen similares ya que ambos mutágenos inducen una abundante aparición de mutantes. Sin embargo, más del 99% de las mutantes obtenidas con EMS, segregaban en una proporción mendeliana de 50% grandes a 50% petites, al ser cruzadas con levaduras salvajes (grandes). Nota: recordar que las levaduras son usualmente haploides y que los fenotipos descriptos se refieren a lo observado con ese nivel de ploidía. En cambio, más del 90% de las mutantes obtenidas con EtBr “segregaban” 100% de petites o 100% de grandes. Es decir, a pesar de tener un parental petite y

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un parental grande, la progenie era toda petite o toda grande. ¿Cómo se explican estos resultados? Solución: el EMS afecta, fundamentalmente a genes nucleares (que pueden afectar a las funciones mitocondriales para resultar en un fenotipo petite -no realizan fosforilación oxidativa- porque éstas importan ciertas proteínas codificadas en el núcleo) y el EtBr tiene mayor especificidad por los genes mitocondriales que se heredan uniparentalmente. 3) En un estudio sobre mutaciones inestables de maíz, un investigador propuso los siguientes genotipos para dos plantas distintas de esta especie: I) C/cd ; Ac+/AcII) C/ca ; Ac- /AcC: alelo silvestre que permite la expresión del color del grano; cd: es un alelo inestable producto de la inserción de un elemento móvil no autónomo Ds que inactiva la expresión del gen. ca: es un alelo inestable producto de la inserción de un elemento móvil Ac autónomo que inactiva la expresión del gen. Ac+ presencia/ Ac- ausencia del elemento móvil (atención que esta nomenclatura es distinta a la empleada en algunos libros de texto). Se realizaron los siguientes cruzamientos: a) plantas con genotipos I y II se cruzaron con plantas c/c; Ac- /Ac-, en donde el alelo c representa una forma mutante incolora, producto de una sustitución de bases. b) planta con genotipo I) se cruzó con planta con genotipo II). ¿Qué fenotipos y en qué proporciones aparecerán en la descendencia de los cruzamientos a) y b)? NOTA: Asumir que Ac y C no están ligados, y que la frecuencia de rupturas cromosómicas es despreciable.

LTR ⇑ Promotor

Sec abierta lectura ⇑ Intrón

LTR

Mediante sondas específicas para el intrón y para la secuencia abierta de lectura de Ty, es posible seguir, mediante Southern blots, la transposición de Ty en el genoma de levaduras. Cuando las levaduras se cultivaron usando glucosa (es decir en ausencia de galactosa) no se evidenciaron cambios importantes (es decir no hubo -o hubo muy poca- aparición de nuevas copias de Ty). En presencia de galactosa (inductor), en cambio, la sonda de Ty permitió detectar la aparición de numerosas bandas (copias) nuevas en las células. Sin embargo, la sonda para el intrón gal falló en revelar la aparición de bandas nuevas. Los Northern blots del mRNA confirmaron estos resultados (detección de una banda por parte de la sonda Ty y falta de detección de la misma banda por parte de la sonda para el intrón). a) ¿Cómo explica estos resultados? b) ¿Porqué y para qué se reemplazó el promotor presente en el LTR por el promotor inducible por galactosa? c) ¿Porqué y para qué se introdujo un intrón? d) ¿Hubiera sido lo mismo (para lo que se quiere demostrar en este experimento) reemplazar el promotor de levaduras inducible por galactosa por el promotor del operón lactosa de E. coli e inducir con lactosa o IPTG? ¿Por qué? e) ¿Y reemplazar la secuencia abierta de lectura por el gen de la β-galactosidasa, sabiendo que es muy

Respuesta: a) I) ½ púrpuras, ¼ blancas, ¼ mosaico II) ½ púrpuras, ½ mosaico; b) ¾ púrpuras, ¼ mosaicos [Todos los genotipos C_, homo- o heterocigotas, son púrpuras; la probabilidad de que un transposón (por ej. del locus Ac) justo vaya a insertarse en un locus específico del genoma es extremadamente baja. Todos los genotipos “dobles” recesivos (conteniendo c, cd o ca) son mosaicos si está ca_ o cd_, Ac+_] 4) Se desea estudiar el mecanismo de transposición genética de los elementos Ty ("transposons of yeast") caracterizando la función de una secuencia abierta de lectura (ORF, open reading frame) con homologías con el gen de la replicasa de retrovirus. Para ello se introduce en una levadura un plásmido conteniendo el transposón. El transposón fue modificado mediante inserción (cortando con enzimas de restricción y ligando) de un promotor gen inducible por galactosa en el LTR izquierdo desplazando el promotor nativo del transposón. Curiosamente, como no se encontraron intrones en el gen de la replicasa, se introdujo uno procedente de otro gen de levaduras resultando la siguiente construcción: Plásmido Ty modificado

sencillo detectar de esta manera la transcripción colorimétricamente usando X-gal?
Posteriormente, se realizó un experimento similar en moscas M (carentes de elementos P en su genoma). En este caso se dispone del cDNA del gen que se desea estudiar, el cual se fusionó con un promotor de un gen de moscas inducible por calor (“heat shock protein”). Igual que para las levaduras, se introdujo un intrón de otro gen de dípteros y se dispone de una sonda para su detección, así como de otra pára el cDNA incógnita. Plásmido con elemento P modificado

IR

Prom HSP

Sec abier lect ⇑ Intrón

IR

Cuando se tranfectaron embriones y se cultivaron a 20°C no se evidenciaron cambios importantes (es decir hubo muy poca aparición de nuevas copias de P). A 37°C, en cambio, la sonda del cDNA permitió detectar la aparición de numerosas bandas (copias) nuevas en las células. Sin embargo, contrastando lo ocurrido en levaduras, la sonda para el intrón reveló las mismas bandas nuevas que el cDNA. Sin embargo, el Northern blot del mRNA dio como en levaduras. Es

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decir, se detecta una banda con la sonda para P y no se detecta nada con la sonda para el intrón. f) ¿Cómo explica Ud. este resultado? Respuestas: a) Hubo transcripción inducible por galactosa del ORF, splicing con pérdida de intrón, lo cual permitió la retrotransposición (RNA cDNA integración cromosómica) del Ty mediada por la RT endógena o codificada por el mismo gen. b) Para poder convertir el sistema de expresión de la RT en inducible y poder atribuir diferencias de comportamiento de la transposición a la transcripción inducible del gen. c) Porque si se quiere demostrar que la transposición es mediada por el RNA transcripto, el intrón debe procesarse y desaparecer. Si lo que se transcribe es un gen de una transposasa la cual después “mueve” el transposón a nivel de DNA, el intrón debería aparecer en las copias. d) No, por 2 razones: 1) los promotores bacterianos muy raramente funcionan en eucariontes como las levaduras y 2) porque la construcción introducida en levaduras no incluye el gen del represor del operón lactosa ni el de la proteína CAP que deberían estar presentes (convenientemente modificados genéticamente para su funcionamiento en levaduras) para que el sistema regulatorio del operón lac esté completo. e) No, porque la beta-galactosidasa no es capaz de reemplazar la función del gen incógnita 8la transposición). Los genes indicadores (“reporteros”) sirven para estudiar la función de los promotores. Aquí no estoy estudiando el funcionamiento de un promotor, sino de una secuencia estructural. f) El cDNA codifica para una transposasa que reconoce los IR y transpone el elemento P tal cual está en la construcción (incluyendo el intrón). Si bien el mRNA de la transposasa probablemente esté procesado, por los datos del Northern, la transposición en sí misma del DNA no produce procesamiento (“splicing”) de intrones. Una cosa es la expresión del gen de la enzima y otra muy distinta es la acción de esta enzima en la transposición. 5) Se confeccionaron varios mutantes del Tn5 mediante ingeniería genética. El mapa y el fenotipo se muestra más abajo: grafica una deleción del DNA entre los extremos de la llave. grafica un fragmento de 800 pb de DNA foráneo que se insertó en la posición O. Las capacidades del mutante de transponerse y de resistir a neomicina (NeoR) se indican a la derecha de cada mutante. WT significa wild type (normal o salvaje). y indican las regiones repetidas invertidas (IR) del Tn5. NOTA: Para su respuesta suponga que entre los valores de la tabla 90 y 100 o entre 0 y 0,5 no existen diferencias estadísticamente significativas.

cepa

¿Qué conclusiones puede sacar acerca de: a) la(s) region(es) requerida(s) para la transposición y region(es) no requeridas? b) ¿Por qué estos resultados son inesperados y se contradicen con lo que Ud. aprendió en la materia? c) la(s) regio(es) requeridas para NeoR?

Solución: a) Para la transposición:

completo,

sólo el extremo izquierdo (aquella parte afectada en la mutante 135). b) Porque hubiera esperado que TODO el hubiera sido imprescindible para la transposición. c) El gen NeoR (completo o su extremo 5’) está ubicado en algún lugar entre el extremo derecho de y su región derecha adyacente (es decir, parte o todo el fragmento afectado por la deleción en la mutante 138). [Con los datos suministrados no puedo afirmar que TODO el gen NeoR esté en ese segmento. Tampoco puede concluirse, con estos datos, que haya una superposición entre parte del gen y el IR izquierdo, pero resulta altamente sospechoso. Para confirmarlo, deberían hacerse mutaciones dirigidas usando deleciones más pequeñas o sustituciones nucleotídicas puntuales]. 6) En un trabajo reciente (Mol Gen Genomics, 2006, 275: 231-241) un grupo japonés estudia la coloración de las flores en Gentiana scabra, una planta ornamental muy difundida en Japón. Para ello analizan tres cultivares de G. scabra: cv. Momokorin (flores rosadas), la línea mejorada 13-98 (flores rosadas) y el cv. Alta (flores azules); y G. triflora cv. Macyri (flores azules). Primero, miden la acumulación de antocianinas mediante HPLC de extractos obtenidos de los pétalos de las flores. Los perfiles de HPLC obtenidos fueron los siguientes: a y d) cv. Alta: dos picos, uno mayor correspondiente a delfinidina y otro menor a cianidina. b,c y e,f) Línea 13-98 y cv. Momokorin: un único pico correspondiente a cianidina.

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i) ¿Qué le i indican estos resultados en cuanto a la des terminación bioquímic del colo de las f n ca or flores?

La enzima clave en la b biosíntesis d delfinidina es la de a flavonoidil 3’5’-hidroxi ilasa (F3’5’H que cata H) aliza la hidroxilació en 5’ del anillo B d esqueleto de la ón l del o antocianina. La expresi génica d esta enzi ión de ima se muestra en la siguiente f figura: a) Análisis de Norts hern blot usando t RNA total de pétalos de los tres cultivares de G. sc cabra. La membrana fue hibridada con ca una de ada las sondas correspondientes a los genes F3’5’H y F F3’H (codifica para una enzima que c cataliza la hidroxilació en 3’ ón del anillo B de flavonoides). rR RNA: control de ca antidad de RNA riboso omal teñido con br romuro de etidio. b) Análisis de RTs PCR para amplificar el ORF d F3’5’H de usando RN NA total extraído de pétalos. Los números a la derecha in s ndican los tamaños de los fragm s mentos ampli ificados. Nota: por 3 3’RACE amp plifican trans scriptos men nores a 1,4 kb en la línea 13-98 a c) Análisis de PCR para amplif s ficar la secuencia genómica d F3’5’H c los inici de con iadores emp pleados para la RT-PCR. Los nú úmeros a la derecha indi ican lo mismo que en b.

ii) ¿Cuál fue e objetivo d los experim el de mentos most trados en a y b? iii) ¿Para qué s realizó la h ) se hibridación con F3’H? c iv) ¿Qué explicación mole ) ecular podría dar a los ca a ambio en el perfi de los trans os il scriptos? A continuación, a partir de ADN ge enómico de las pla antas amplif fican fragme entos conten niendo el O ORF F3’5’H (ver pa c de la figura anterior arte r): v) ¿Cuál fue el objetivo de este experim l mento? vi) ¿Qué evidencian estos r ) resultados? Lo fragmento de 4 kb y 3,3 kb fue os os eron clonado y os sec cuenciados. El fragmento d 4 kb de la línea 13-98 presentaba en de a 8 a el exón 1 una inserción (a la que llama aron dTgs1) cuya secuencia c contenía un sitio blanco de duplicac ción (TSD) de 8 p y repetici pb iones termin nales inverti idas (TI de 14 pb La secuen IR) b. ncia TIR pre esentaba una regió palíndrom imperfe ón mica ecta y exhibía similitud p parcia con un ele al emento dTph de petunia (el cual se sabe h qu es reconoc ue cido por la tra ansposasa Ac c). El fragmento d 3,3 kb de cv. Momo de el okorin conte enía un inserción en el exón 1, a la qu denomina na ue aron Gs sTRIM. Esta secuencia p a presentaba repeticiones dir rec ctas terminales (TDR). Esta inserción no conte enía sec cuencias que codificaran para alguna proteína. A e n a Asimi ismo, presen ntaba similitu con secue ud encias de Lo otus japonicus, designadas LjTRIM. , vii) ¿Qué le permiten confirmar estos datos de n secuencia? ¿Cuál es e ? entonces la explicación p e para los diferen fenotipo observados? ntes os Como los elementos T TRIM fueron identificado a n os partir de a análisis de ba ases de dato de secuenc os cias nucleotídi icas y mostra aron la pecul liaridad de es star conservad en distint especies de plantas, r dos tas realizaron un análisis f n filogenético empleando las secuencias TDR y usa s ando los pro ogramas CLU USTAL W y TREEVIE EW. El árbol obtenido se muestra a continuación n:

vii ¿Qué pued concluir d agrupam i) de del miento mostra ado en el árbol? vii Sugiera u experimen simple para analizar la ii) un nto p r existencia de los elemento dTgs1 y GsTRIM en el os n noma de otra especies d Gentiana. as de gen Rt Aclaració Las gent ta: ón: tianas rosada vienen sien as ndo obtenidas por mejoramien a partir de mutacio nto ones esp pontáneas a partir de ge entianas azu ules, pero el/ /los

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mecanismo/s involucrado/s eran desconocido/s hasta el momento. i) Estos resultados indican que hay diferencias en la acumulación de las distintas antocianinas en ambas plantas (azules y rosadas), en particular, las plantas rosadas carecen de delfinidinas. Pero la acumulación de cianidinas es similar para ambas. ii) Como los autores saben que la F3’5’H es la enzima clave en la síntesis de delfinidina y viendo los resultados anteriores, analizan si hay diferencias en cuanto a la expresión del gen para esta enzima entre los dos tipos de plantas y analizan si esto podría explicar los fenotipos observados. iii) La hibridación con F3’H es usada como control. Tanto en plantas azules como rosas se obtiene el mismo patrón de expresión. Es otra enzima involucrada en la síntesis de pigmentos pero que produce otro compuesto (que no tiene nada que ver con las delfinidinas, si bien pertenece a la misma ruta biosintética). También prueban con otros genes relacionados con la síntesis de flavonoides y ven que exhiben los mismos patrones que la F3’H pero esto tampoco lo muestran en el trabajo original. iv) Los resultados evidencian que: No se observa transcripto de F3’5´H para la planta rosada, línea 13-98 tanto por Northern blot como por RT-PCR (Aclaración: los primers para esta RT levantan el ORF por completo, full length). Además se aclara que por 3´RACE obtienen fragmentos menores a 1,4 kb. Para la planta rosada cv. Momokorin, el transcripto de F3’5´H es de tamaño mayor que el observado para la planta azul cv. Alta (Northern). Por RT-PCR este cultivar muestra dos fragmentos de 1,3 y 2,1kb que difieren del de 1,6kb observado para la planta azul. En conclusión: ninguna de las plantas rosadas acumulan el transcripto de tamaño normal esperado (1,6kb) v) El objetivo de este experimento fue examinar la estructura del gen para F3’5´H en estas plantas a partir de amplificación sobre el ADN genómico de las mismas, para ver si existen diferencias que puedan explicar los resultados a nivel de transcriptos. vi) Se obtienen fragmentos de amplificación de distinto tamaño para las distintas plantas. Estos resultados muestran que el cv. Alta (azul) muestra un fragmento de 2,8kb mientras que para la línea 13-98 y el cv. Momokorin (rosadas) las bandas son 1,2 y 0,5kb mas grandes, respectivamente (sus tamaños eran 4 y 3,3 kb, respectivamente). Es probable que en el gen de las plantas rosadas haya alguna inserción. vii) Estos resultados, dadas las similitudes de las secuencias con elementos transponibles, evidencian que las inserciones observadas corresponderían a transposones (dTgs1 y GsTRIM1). La explicación para los diferentes fenotipos observados es que estos transposones interrumpen la secuencia del gen, resultando en transcriptos anormales (o ausencia de transcripto) que no permiten la síntesis de la enzima F3’5´H y por lo

tanto no se sintetizan el pigmento que produce la coloración azul (delfinidina). vii) Los resultados claramente muestran que GsTRIM1 y LjTRIM se agrupan juntos y apartados del resto de los TRIMs reportados previamente, indicando que estos dos transposones son evolutivamente diferentes de los otros elementos TRIM de plantas. vii) Al inicio del problema, en el enunciado, se indica que también disponen de G. triflora cv. Macyri. Por lo tanto, el experimento sería hacer Southern blot de ésta conjuntamente con las 3 plantas analizadas de G. scabra e hibridar con dTgs1 y GsTRIM1 (Southerns separados, obviamente) y observar la aparición de muchas bandas (esto mostraría que, como la mayoría de este tipo de transposones, son miembros de una familia de alto número de copias, y que están distribuidos por todo el genoma de Gentiana).

Alteraciones cromosómicas y cromosomas
1) El caballo (Equus caballus) tiene un complemento diploide de 64 cromosomas, de los cuales 36 que son acrocéntricos. El burro o asno (Equus asinus) tiene 62, de los cuales 22 son acrocéntricos. a) Indique el número (diploide) de cromosomas que tendrá el híbrido interespecífico (la mula) b) ¿A qué atribuye la usual esterilidad (incapacidad de producir gametas viables) de la mula? R: a) Las gametas de los caballos tendrán 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32 +31 = 63 (¡el “2n” de la mula es impar!). b) A los problemas de apareamiento y segregación meiótica derivados de cromosomas tan disímiles y de número impar 2) Describa un ejemplo de alteración cromosómica estructural que afecte la fertilidad en individuos heterocigotas para la alteración. Justifique brevemente su respuesta. Respuesta: Cualquiera de los ejemplos de alteraciones estructurales que dio Liliana o figuran en los libros (translocaciones recíprocas, por ejemplo) que impliquen la formación de configuraciones meióticas como trivalentes, tetravalentes, etc. y que afecten la correcta migración de los cromosomas en la anafase meiótica. La inclusión de algún esquema reemplaza buena parte de la explicación. 3) Se desea localizar en qué cromosoma se localiza el locus para un marcador molecular de tipo codominante (microsatélite) ligado a un carácter de interés agronómico (QTL). La especie vegetal tiene un número diploide de 2n=10 cromosomas y se dispone de la serie monosómica completa. Se cruza una planta disómica homocigótica (muestra una banda de 200 pb) por cada uno de los diferentes monosómicos todos los cuales muestran una banda de 180 pb. Algunos de los descendientes muestran ambas bandas (200/180 pb) y otros sólo una (la de 200 pb). Las descendencias obtenidas se desglosan en la tabla clasificadas de acuerdo a su constitución cromosómica, es decir si poseen 9 cromosomas (es decir, monosómicas) o 10

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cromosomas (disómicas, ver columna 1) y a su patrón de bandas (columnas 2 a 5): Descendencia de los 5 cruCromosoma en zamientos analizados condición moDisómicos Monosómicos nosómica 200/180 200 200/180 200 1 140 0 139 0 2 97 0 93 0 3 193 0 0 196 4 58 0 57 0

sionar gametas desbalanceadas. Luego repitió los cruzamientos arvejas de flores blancas por arvejas de flores rojas. ¿Qué proporciones de plantas con flores blancas y rojas obtuvo en la F2? Describa los genotipos simplificados de dicha F2, de la F1 que le dio origen y de los parentales poliploides (usar guiones bajos para ejemplificar casos en que ambas variantes genotípicas resultan en fenotipos equivalentes) Respuesta correcta:

5

158

0

145

0

Explique los resultados obtenidos e indique en qué cromosoma se localiza el marcador molecular. Solución: Si el locus no está en un cromosoma cualquiera de los que se encuentran en 2 copias (es decir no está en el monosómico) tendrá una segregación 1:1 mendeliana normal y todos sus descendientes serán heterocigotas 200/180. Si el locus está en el cromosoma crítico lo que realmente estamos cruzando es 200/200 x 180, y de esta descendencia, los individuos con 9 cromosomas serán 200 y los de 10 cromosomas serán 200/180. Si observamos la tabla vemos que este razonamiento se compatibiliza con los resultados del cromosoma 3. Por ej. para el cromosoma 1: 200/200 x 180/180 todos 200/180 (sean mono- o disómicos) Para el cromosoma 3: 200/200 x ---/180 50% 200/180 (disómicos) y 50% ---/200 (monosómicos) 4) En una enfermedad genética humana se observa la siguiente conformación cariotípica de los pares de cromosomas 7 y 21 (notar las similitudes de bandeo mostradas por las llaves). a) ¿Cual fue el origen de esta anomalía y qué nombre recibe? b) En caso de examinar la gametogénesis de este individuo ¿esperaría observar alguna peculiaridad durante la meiosis? ¿Cuál? c) ¿Podría implicar una reducción en la fertilidad de las gametas? ¿Por qué? Respuesta: a) Translocación recíproca desigual 7:21 b) Sí. Multivalentes formados entre el 7, el 21 , el 21 translocado, que se denomina 217, y el 721, que es el otro producto recíproco de la translocación desigual. c) Sí, como consecuencia de lo descripto en b) se afectaría la migración a los polos provocando aneuploidías capaces de inviabilizar las gametas 5) Un investigador trató con colchicina las famosas arvejas de Mendel y obtuvo los tetraploides correspondientes. Por otro lado, también introdujo un transgén proveniente del trigo que estabiliza una forma de herencia diploide evitando la formación de multivalentes (por ej. tetravalentes) que puedan oca-

Como los bivalentes se forman al azar, ya que son producto de autoploliploidía por tratamiento con colchicina, la frecuencia de individuos aaaa en la F2 es 1/ 36 (1:35). Todos los cromosomas son homólogos, si no estuviera el transgén se formarían todos cuadrivalentes.
6) En un reciente trabajo de Learmonth y colaboradores se estudiaron los efectos a largo plazo de las artroplastías (injerto o reemplazo de partes óseas por prótesis metálicas) que generan debris (restos) en linfocitos de sangre periférica. Estos restos metálicos se suelen alojar en las adyacencias de la prótesis, ganglios linfáticos, hígado y páncreas. Para ello realizaron hibridación in situ (FISH: preparados cromosómicos a los cuales hibridaron) con sondas específicas del cromosoma 1 marcadas con un fluoróforo (rodamina) que lo tiñe específicamente de rojo, contrastando con el color azul del resto de los cromosomas (teñidos con DAPI). Observaron que cuando se utilizan prótesis con cromo-cobalto se observa un aumento de 3,5 veces de conformaciones cromosómicas del tipo de la figura 1 y 2,5 veces de las de la fig. 2 respecto a la utilización de prótesis de acero inoxidable. a) Defina el tipo de mutaciones cromosómicas estructurales y numéricas detectadas en las figs. 1 y 2. b) En el trabajo se hizo un especial esfuerzo para que el muestreo realizado se independizara de factores como el hábito de fumar, el número de radiografías, etc. ¿Por qué?

Fig. 2

Fig. 1

c) De acuerdo a lo que muestra este trabajo. En principio, las prótesis de cromo-cobalto inducen mutaciones ¿somáticas o germinales? Es decir, ¿podrían aumentar la probabilidad de que se produzcan malformaciones genéticas en la descendencia de estos pacientes?

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d) En este trabajo solo se examinaron mutaciones de tipo estructural y no aquellas de tipo puntual? ¿Se le ocurre algún modelo experimental (no humano) para estudiar este aspecto. ¿Le serviría este modelo para contestar con más certeza la pregunta c)? Rta a) traslocación y aneuploidía (triploidía) del cromosoma 1 b) Porque son otros factores mutagénicos comprobados que también aumentan la tasa de mutaciones y podrían interactuar sinérgicamente (o no) con el factor que estoy estudiando. c) Somáticas. En principio, no. (los debris no se acumulan en tejidos reproductivos) d) Los sistemas basados en ratones transgénicos vistos en clase de problemas injertados con prótesis o inyectados con debris metálicos en sangre, analizando distintos tejidos incluyendo el reproductivo. Pueden contestar otros sistemas como pueden ser los de intercambio de cromátides hermanas (por ej) pero este sistema no detecta tan bien mutaciones puntuales sino las cromosómicas o el test de Ames pero no podrían examinar tejido reproductivo.

Genética cuantitativa
1) La longitud media internodal en espigas de cebada de la variedad gran cervecera es de 4,24 mm (con baja variancia). En la variedad imperial la media internodal es de 6,34 mm (con baja variancia). La media de la F1 de un cruce entre las dos variedades tiene, aproximadamente, 5,4 mm (con baja variancia). La F2 da también 5,4 mm pero con un rango de variación continuo desde un extremo parental al otro (alta variancia). El análisis de la progenie de la autofecundación de cada uno de los individuos de la F2 mostró 3 distribuciones entre sus descendientes: i) tipo gran cervecera con media de 4,24 mm y baja variancia, ii) tipo imperial de 6,34 mm y baja variancia y iii) igual a la F2. La longitud internodal en espigas de cebada, ¿es un carácter discontinuo o cuantitativo?¿Cuántos loci están involucrados en la segregación del carácter?¿Por qué? Respuesta: La respuesta puede ser de distintas maneras (ver más abajo) pero se debe concluir que la herencia involucra un único locus y es típicamente mendeliana (en este caso semidominante ) y no de tipo “cuantitativa”. Si gran cervecera es AA e imperial aa, la F1 es Aa (semidominante) y los individuos de la F2 son AA, aa o Aa, como lo demuestra el comportamiento de las respectivas pruebas de progenie. Se puede contestar que es un carácter discontinuo (medido cuantitativamente) o que es cuantitativo (por su forma de medición) pero formado por un único locus (QTL). 2) Una población vegetal silvestre es sometida durante muchas generaciones sucesivas a un proceso de selección artificial basado en sembrar cada año únicamente las semillas procedentes de plantas incluidas en el 20% de mayor producción. Como consecuencia de la selección practicada, la producción media aumenta gradualmente. Los valores de heredabilidad del carác-

ter producción en dicha población a lo largo del proceso selectivo serán a) creciente, b) decreciente, c) primero creciente y luego decreciente d) constante. Justifique su respuesta. Respuesta: Decreciente. La heredabilidad está en función directa con la variabilidad genética (varianza genotípica), la cual disminuye con el proceso de selección.[Respuesta alternativa: debería ser decreciente y después constante, una vez agotada la variabilidad genotípica]. 3) Dados los excepcionales conocimientos de Genética que adquirió en tiempo récord en este curso de verano y gracias a la devaluación y sus bajas pretensiones salariales, una exitosa empresa textil exportadora de productos regionales decide contratarlo para mejorar la productividad y la calidad de la lana de sus rebaños de llamas. El establecimiento del NOA dispone de una población de animales cuya producción de lana y calidad de la fibra siguen una distribución de tipo normal y que se muestran en A y B, respectivamente. Tal como aprendió en Genética I, lo primero que hace es estudiar la heredabilidad del carácter y para ello dividió la población en 3 subgrupos cada una (denominados 1, 2 y 3 en la figura) de acuerdo a los valores promedio de producción o calidad X1, X2 y X3, respectivamente). Seguidamente dejó que los individuos de cada una de las subpoblaciones creadas se aparearan entre sí y analizó la distribución de valores de la siguiente generación. Como se ve en la figura, los valores promedio de la nueva generación coincidieron con los valores promedio de cada una de las subpoblaciones paternas en A (productividad). En cambio en B (calidad) coincidieron con el promedio de la población original sin seleccionar.

a) ¿Cómo fue la heredabilidad de los 2 caracteres? Debido a que es un profesional muy serio, antes de hacer un diagnóstico prefirió esperar un par de años más y ver que ocurre en una segunda generación antes de emitir un diagnóstico y una estrategia de mejoramiento. Para ello, sin aplicar nueva selección, dejó cruzar entre sí a los nuevos individuos pertenecientes a las subpoblaciones. b) ¿Cómo serían las distribuciones en esta segunda generación? c) ¿Cuál fue su diagnóstico y qué plan de mejoramiento presentó a la empresa? Aprovechando su estancia en el NOA decidió hacerse un viajecito a Bolivia y, en el lago Titicaca observó unas llamas con una fibra de excepcional calidad (muy superior a cualquiera de las del establecimiento

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argentino) aunque de productividad de lana muy inferior. Indeciso, compra esas llamas y vuelve al establecimiento a realizar nuevos cruzamientos entre ellas y las argentinas. Para su sorpresa, entre los descendientes no sólo obtiene individuos con un aumento de la calidad de la fibra, sino que algunos (muy pocos) animales tienen una productividad superior a la observada en la subpoblación seleccionada de “A”. Desconfiado, supone que los valores de estos pocos individuos podrían estar influidos por el ambiente, por lo que los pone aparte, deja que se crucen entre sí y analiza sus hijos. Resultado: la alta productividad se mantiene y obtuvo las mejores llamas de la historia. d) ¿Cómo explica su buena suerte? Es decir, ¿a qué fenómeno genético atribuye este resultado? A todo esto, ya pasaron varios años y decide ir con sus resultados a pedir un considerable aumento de sueldo. Sin embargo, a esta altura del partido, vuelve Cavallo al ministerio de Economía, reimplanta la convertibilidad y la empresa entra en crisis, entre otras cosas porque, durante los años en Ud. hacía estudios genéticos, la productividad no aumentó y decidieron prescindir de sus servicios por “ineficiente” (no vale la pena hacer investigación y desarrollo en la Argentina, le argumentaron) y le vendieron las llamas a Telecom para su famosa propaganda (porque observaron que llamaban por teléfono muy seguido a sus familiares bolivianos). Mientras tanto, su hermanito más chico decide seguir sus pasos y en la facultad aprende que un grupo en Australia, publicó un trabajo en el que encuentra una asociación entre un RFLP correspondiente a un gen que interviene en la síntesis de la queratina en la lana en ovejas y que explica el 90% de la variabilidad (varianza genética) del carácter calidad de la fibra. e) En base a toda esta experiencia y en no más de 10 renglones ¿qué hubiera hecho distinto (además de votar con conciencia) para evitar este final? Nota: se castigará con -1 punto si la respuesta excede los 10 renglones. Respuesta: a) 1 (100%) y 0, respectivamente, b) igual, c) Que, dada la alta heredabilidad de A, puedo tratar de seguir seleccionando individuos en base a producción y que, dada la nula heredabilidad de B, no hay variabilidad genética y no tiene sentido seleccionar para este carácter. Deberían buscarse otras fuentes de variabilidad. d) Segregación transgresiva. e) Hubiera tratado de hacer mis primeras evaluaciones utilizando la mayor diversidad genética disponible (y no limitarme a los animales del establecimiento) y, en paralelo, hubiera buscado la literatura científica relacionada para evaluar la factibilidad de encontrar marcadores moleculares para el carácter estudiado que me sirvan para seleccionar con más eficiencia. Por ejemplo, intentaría usar el gen de oveja como sonda que, si hibrida con el gen homólogo de la llama, podría servir para observar si encuentro un polimorfismo útil en llama para RFLP (u otra técnica como STS, SSCP, etc.), es decir, ver si hay cosegregación de un marca-

dor con mi característica de interés para así usarla en selección asistida por marcadores. Respuesta alternativa: llamas transgénicas con el gen de la oveja. 4) En el mejoramiento bovino se busca un aumento más rápido del peso de los animales en determinados ecosistemas de pasturas semitropicales. Se trata de un carácter cuantitativo y aditivo. Para ello se cruzaron vacas con cebúes (de aumento más rápido, pero cuya calidad de carne es menor) obteniéndose una F1 con valores intermedios (la media se ubicó equidistante entre la media de las vacas y la media de los cebúes). La varianza fue muy similar tanto a la de vacas como de cebúes (que a su vez se parecían entre sí). Los integrantes de la F1 se cruzaron entre sí para obtener una población segregante. a) ¿Cómo supone que fue la media de esta población segregante? ¿mayor, menor o similar a la de la F1? b) La varianza fue ¿mayor, menor o igual a la de la F1? Entre los individuos de esta población se encontraron algunos que superaron en aumento de peso a los mejores cebúes. c) ¿Conoce alguna explicación genética a este fenómeno? Respuestas esperadas: a) Similar, b) mayor, c) segregación transgresiva 5) Un conocido protagonista de Los Simpsons que habitualmente se disfraza de Vaquita de San Antonio se dedicó a la lucrativa venta de dichos coleópteros pero, para hacerlos más atractivos, necesitaba aumentar su tamaño dado que naturalmente tienen una media de tan solo 5 mm. Seleccionó los machos y hembras más grandes que encontró (promedio de 8 mm) pero como eran muy pocos decidió reproducirlos para así disponer de volumen para la venta. Para su sorpresa, la descendencia no mantuvo la esperada longitud media de 8 mm sino que bajó a 6,5 mm. Muy enojado por la baja performance de los bichos, los tiró y se fue a recoger coleópteros nuevos y repitió el procedimiento de selección (con idénticos resultados). a) ¿Por qué bajó la longitud promedio de la descendencia? b) ¿Puede calcular la heredabilidad de este carácter? Después de admirar el tamaño de las cucarachas del bar de Moe, abandonó la idea de seleccionar y se le ocurrió criarlas con una dieta que le recomendó Homero. De esta manera logró aumentar el promedio de longitud de 5 a 6,5 mm (¡lo mismo que arriba!) c) ¿Es casualidad que ambas medias hayan coincidido? Finalmente decidió contratarlo como consultor d) ¿Qué hubiera hecho Ud en caso de querer convertirse en vendedor de vaquitas de San Antonio super size, disponiendo únicamente de una regla milimetrada y sabiendo que en Springfield NO existen laboratorios de marcadores moleculares o ingeniería genética? Respuestas esperadas 1) a) Porque el tamaño observado es la combinación de una estructura genética poblacional particular (va-

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riancia genética) que puede segregar y de la influencia ambiental (no heredable) o variancia ambiental. b) La selección diferencial fue de 8 – 5 = 3 mm y la respuesta selectiva 6,5 – 5 = 1,5 mm. Por lo tanto, la heredabilidad fue de h2 = 1,5/3 = 0,5 (50%) c) Sí (o no, en el sentido de que se reduce a un mínimo la variancia ambiental permitiendo expresar el máximo potencial genético; de todos modos sigue siendo casualidad que coincida una media general únicamente debida a factores genéticos de una población sin seleccionar con los de una población seleccionada en la que no se afectó la influencia ambiental) d) Volver a seleccionar en la descendencia y en las siguientes generaciones hasta que la heredabilidad se acerque a 0 (además de darles la dieta de Homero). 6) La resistencia al patógeno Sclerotinia sclerotiorum en girasol es un carácter complejo que involucra distintos loci y se evalúa cuantativamente mediante un índice de daño en el capítulo floral. Para evaluar la heredabilidad del carácter se sembraron 100 plantas de una línea moderadamente resistente (no existen variedades totalmente resistentes al patógeno) en Balcarce, obteniéndose una media de índice de daño de 0,20. De esta población, se seleccionó un grupo de individuos de mayor resistencia, con una media para el índice de daño de 0,10, como padres para la siguiente generación, siendo la media de esta última generación de 0,13 para la variable evaluada a) ¿Cuál es la heredabilidad del carácter resistencia? Cuando el mismo experimento, utilizando el mismo material y presión de selección se realiza en otra localidad, la heredabilidad obtenida fue de 0,50 b) ¿A qué se debe la diferencia en la heredabilidad obtenida en ambos casos? Sobre una población segregante F2 proveniente del cruzamiento de la línea resistente estudiada arriba y una línea susceptible al patógeno, se realizó un estudio con marcadores moleculares codominantes, detectándose 2 marcadores estrechamente ligados a 2 QTLs, uno en el grupo de ligamiento 8 (GL8) y el segundo en el grupo de ligamiento 6, que explican el 50 y 35 % de la varianza genética del carácter resistencia respectivamente. En base a estas conclusiones, c) ¿Descartaría la presencia de otros QTLs para este carácter en la población en estudio? El siguiente esquema representa el patrón para el marcador asociado al QTL del GL8 en el padre moderadamente resistente (MR), en el sensible (S) y en 10 individuos F2, evaluados como moderadamente resistentes o sensibles (ver fila superior) Padres Resistentes Susceptibles MR S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ------- ---------------- ---- ---- ---- ---- ---¿Cómo explica el patrón encontrado para el marcador en estudio en los individuos 3 y 5 cuya evaluación fenotípica es moderadamente resistente? Rta: a) h2 = Xf –Xo = 0,7

Xs - Xo b) a la varianza ambiental e interacción genotipoambiente (carácter cuantitativo, con alta componente ambiental). c) Dado que entre los dos QTLs explican el 85 % de la varianza genética, es muy probable que haya otro/s QTLs de efecto menor en otros grupos de ligamento no detectados d) Se esta evaluando con un marcador ligado a un solo QTL y la resistencia moderada observada puede deberse a la presencia de otro/s QTL/s en esos individuos. También pueden decir que hubo recombinación entre el marcador y el QTL, pero dado que se dijo que estaban estrechamente ligado se espera que deduzcan la primera respuesta

Genética de poblaciones 1) La apolipoproteína E (apoE) fue implicada como
un factor de riesgo en las enfermedades cardiovasculares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos comunes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la distribución poblacional de los distintos genotipos: ¿Cuál es la frecuencia del alelo apoE2? a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175 Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040] GenotipoE2E2E2E3 E2E4 E3E3E3E4E4E4Total N° indiv 2 64 7 684 169 11 937 2) Uno de los riesgos científicamente aceptados en el uso de las plantas transgénicas Bt (es decir, conteniendo un transgén que codifica para la entomotoxina de una cepa de Bacillus thuringiensis) con resistencia a los insectos, es el que se refiere a la predecible selección de mutantes de insectos resistentes. Varios factores contribuyen a predecir este desarrollo de resistencia: la historia previa de uso de insecticidas químicos y, ya más específicamente, la selección de insectos resistentes en cultivos orgánicos que utilizan este insecticida como método de control biológico, el uso generalizado de plantas resistentes que reemplazarían a las sensibles (alta presión de selección), la presencia de un único transgén codificante para una única proteína (en lugar de varias) lo que implica que con una única mutación de un gen contra esa proteína se obtendrían mutantes específicamente resistentes para esa proteína, y datos de selección en condiciones de laboratorio. Por ejemplo, el grupo de Gould (PNAS 89:7986, 1992) seleccionó la cepa mutante YIID2 mediante alimentación artificial en medios conteniendo dosis subóptimas de la toxina por nueve generaciones. El análisis genético de la mutante utilizando marcadores moleculares indicó la presencia de un gen de resistencia mayor de expresión recesiva. El modo de acción del gen es disminuir la capacidad de unión de la toxina a las proteínas intestinales. Que son blanco de la toxina. También se demostró que esta mutante es capaz de atacar exitosamente al algodón transgénico comercial en condiciones de invernáculo. Si bien ninguno de los datos anteriores demuestra que vaya a haber resistencia funcional en condiciones de campo,

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los mismos contribuyen a la construcción de posibles modelos teóricos que pueden ayudar a manejar el desarrollo de estas resistencias y, por lo tanto, el impacto ambiental sobre la estructura genética poblacional de la plaga. El escenario que se predice en los modelos es la presencia de frecuencias poblacionales muy pequeñas de genes de resistencia (r), recesivos o semirecesivos, que requieren estar en homocigosis para conferir una resistencia eficiente (rr). En otro trabajo publicado por el mismo grupo (PNAS 94:3549, 1997), se trató de estimar la frecuencia de alelos de resistencia en poblaciones no expuestas a la entomotoxina de B. thuringiensis mediante el siguiente procedimiento: i) colocaron trampas en regiones geográficas diversas conteniendo feromonas femeninas para atrapar insectos machos, ii) cruzaron estos insectos con la cepa de hembras mutantes de laboratorio YIID2 descripta arriba, iii) de esta manera analizaron 1028 familias derivadas de los cruzamientos, de las cuales 4 mostraron segregar cerca de un 50% de resistentes. a) ¿Cuál son las frecuencias génicas suponiendo equilibrio de Hardy-Weinberg? Es decir, calcule p y q. b) ¿Qué frecuencia de individuos resistentes (rr) esperaría encontrar? c) En base a su respuesta anterior, ¿por qué le parece que utilizaron un procedimiento tan complicado como es hacer estos cruzamientos (y evaluar su genotipo mediante pruebas de progenie) en lugar de tomar directamente insectos a campo y probar (también directamente) su resistencia? d) ¿Por qué era tan importante hacer el experimento con poblaciones naturales no expuestas previamente a la toxina? e) Todo esto es previo a la introducción de las transgénicas Bt, las cuales actuarían seleccionando ¿qué genotipos? i) los rr, ii) los rs, iii) los ss, iv) los rr y los rs. Explique. f) Dentro del esquema de utilización de refugios para el control de resistencia ¿qué proporción de plantas no transgénicas debo mantener para que haya suficientes insectos sensibles (ss + sr) para garantizar que sobrevivan para mantener algo parecido a un equilibrio de Hardy-Weinberg si se quiere mantener una frecuencia de alelos r menor al 10% (frecuencia de r = 0,1)? Se presupone que las polillas se aparean y distribuyen al azar sin distinguir si los huevos que depositan están sobre plantas transgénicas o no transgénicas, por lo que la proporción de plantas es sinónimo de proporción de insectos que deben quedar vivos. Para hacer el cálculo suponga, además, que no hay un efecto de selección importante a lo largo de las generaciones que cambie las proporciones previamente calculadas, como ser que todas las resistentes sobrevivan independientemente de que les haya tocado en suerte crecer y alimentarse en una planta transgénica como no transgénica.

Solución: Datos: 1024 de los 1028 insectos machos colectados fueron SS (porque mediante el cruzamiento pruba con las hembrasdoble recesivas rr, el 100% de la descendencia dio susceptible, es decir Sr). Por lo tanto p2= 1024/1028 = 0,996 (observado). Los heterocigotas fueron 4 (Sr x rr 50% rr + 50% Sr). Por lo tanto H = 2pq = 4/1028 = 0,004. No se observaron homocigotas recesivos (rr) por lo que el q2 observado (no el esperado) fue 0. a) p = raíz cuadrada de 0,996 = 0,998, 2pq = 0,004 q = 0,004/ 0,998 x ½ = 0,002 b) R = q2 = 0,000004 es decir, el valor esperado es de 4 resistentes (homocigotas rr) cada 100.000 insectos. c) Sin contar los errores de muestreo, habría que haber muestreado un mínimo de 25.000 insectos para pescar (con suerte) uno resistente. Si además se quiere calcular un error estadísticamente confiable, la muestra tendría que haber sido aún mucho mayor. El método empleado es más engorroso, pero con un poco más de 1000 insectos recolectados se pudieron obtener datos relativamente fiables. Respuesta esperada: porque al detectar heterocigotas (en vez de los homocigotas recesivos) se necesita analizar una muestra menor. d) Porque la selección distorsiona el equilibrio de Hardy-Weinberg. e) Los rr. Los rs son, selectivamente iguales a los ss. Si bien van a aumentar, lo hacen porque al aumentar rr aumentan automáticamente los rs. f) q = 0,1 R = q2 = 0,12 = 0,01. Es decir, que tengo que garantizar un nivel de resistentes menor a 0,01 cuando tengo una proporción real (sin usar plantas Bt) de 0,0004%. Quiere decir que dejando muchísimo menos que un 1% de plantas no transgénicas me garantizaría dichas proporciones (para ese gen en particular). 3) Hagamos un poco de ciencia-ficción. Supongamos que la ciencia médica avanzase hasta el punto de que, con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida, la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones. Admitamos también que tal tratamiento se aplica a toda la humanidad en el intervalo de una sola generación, y se mantiene así en lo sucesivo. ¿Qué ocurriría con la variabilidad genética en las sucesivas generaciones? ¿Aumentaría? ¿Desaparecería? ¿Se mantendría? Explíquese tanto como pueda. Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de selección y el alto número poblacional de la especie, la variabilidad debería mantenerse constante (en equilibrio de HW). Por lo tanto, se mantendría. Lo que se impediría es el surgimiento de potenciales nuevos alelos inexistentes en la población actual. 4) Según algunos las rubias (no teñidas) están condenadas a la extinción cuando la población humana mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante del color rubio del principal gen involucrado en el color del cabello es de expresión recesiva. Si mediante un cálculo arbitrario estimamos que la cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-

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blación mun ndial de 6.60 millones y hay 50 mill 00 lones de heterocig gotas. a) ¿Cuál ser la proporc rá ción de rubios cuando la p población llegue a equilibrio de Hardy-W Weimberg? b) ¿Qué pro oporción de r rubios de la p población ten ndrán los dos padr no rubios res s? Rta: p=R+1 1/2H= 22/6600 +50/6600 0*1/2= 0,007 71 q=1-p= =0,9929 En equilibrio H-W la población de rubios será n s p2=5*10-5 b) NO era n necesario con ntestar. La re espuesta era q2 2pq=0,014. La proporc ción de matr rimonios (0,0 2= 014) -4 2*10 Hijos ¼ * 2 2*10-4 = 5.10-5

En B se sombr n rean: II 2, 3, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV , tod dos 2) El siguiente árbol mues una fam e stra milia que hereda un forma seve de hidroc na era cefalia causa por una m ada mutac ción en el gen L1CAM (l localizado en el cromoso n oma X) y que pres ) senta una he erencia reces siva. Utilizan ndo un marcador in n ntragénico qu tiene tres alelos (12, 8 y ue s 7) se hace el d diagnóstico del propósit (nombre q to que rec ciben los “p pacientes” p parte de los genetis por e stas mé édicos y que se in ndica con una flech ha).

Genéticas no Mendel lianas
1) La neuro opatía óptica hereditaria de Leber (N a NOHL) es una enfer rmedad rara en la especie humana qu proue duce una rá ápida atrofia del nervio ó óptico y que g genera ceguera en adultos jóve enes. Esta en nfermedad es castá racterizada por una pérd dida bilatera de la visió cenal ón tral mientra que se ma as antiene la visión periféri La ica. genealogía de la izquier muestra la herencia d esta rda de enfermedad en una fami bastante amplia: d ilia

¿Cuál es el tipo de he erencia más probable p s para la NOHL en la especie h humana? Ex xplique su ra azonamiento. Según su hi ipótesis com mplete la gene ealogía de la derea cha indicando los indivi iduos afectad dos. Respuesta: Observamo que todos los descend os dientes

independien ntemente de su sexo, mu uestran el fe enotipo de la madre [Esto no p e. podemos exp plicarlo si el carácter estuvier en los cro ra omosomas se exuales, ya que el fenotipo de la descenden no depe ncia ende de si el carácter es domin nante o recesivo, o de la dirección del crua zamiento, s sino sólo del fenotipo de la madre]. Por lo l e tanto podría amos asegura que este c ar carácter es u caso un de herencia materna.

¿C fue el resultado del d Cuál diagnóstico? a) La propósito es portador del alelo mutante o ra m b) La propósito es heteroci o igota no portadora c) La propósito es homocig para el alelo normal o gota a d) El resultado no permite dar un diag o e gnóstico prec ciso sob el genotipo. bre Re espuesta: b) 3) En el antig guo testamento, Dios dispuso que los d hijos de Isaac y su mujer c constituirían la nación jud día. Sin embargo, l esposa de Isaac era ba n la astante mayo y or sup puestamente infecunda. Según las co ostumbres lo ocales de la época ella eligió u mujer al s a, una lternativa con la n qu Isaac tuvo un hijo: Esa Un día, la anciana mu ue aú. a ujer le comentó a I Isaac que est taba encinta y tuvo un h hijo: cobo. Poster riormente, Ja acobo se casó con 5 herm ó maJac nas (de otra fa familia) y tu 13 hijos y varias hij uvo jas. uponiendo qu pudiera ac ue cceder a mu uestras de tej jido Su de Isaac, Esaú Jacobo y de los hijos de Jacobo y, ú, o además, pudie extraer D ese DNA y analizarlo: a) ¿Cuántos ha aplotipos o s secuencias nucleotídicas din fer rentes en la región del c cromosoma Y en la reg gión del gen Sry obt tendría? Justifique. b) ¿Cuántos tip de secue pos encias nucleo otídicas difer rentes del D-loop de DNA mi s itocondrial obtendría? Ju o ustifiq que. So olución: a) Uno sólo: el que prov viene de Is saac (he erencia ligad al sexo, etc da c….) b) 4: el de Isaa (donado po su madre) el que prov ac or ), viene de la madre de Esaú, e que provie de la ma e el ene adre de Jacobo y el que provien de la mad de las 5 h ne dre herma anas (herenci materna...) ia 4) Aproximada amente el 0, ,3% de la hu umanidad tiene na ad leve llamada LHON pro a oduun enfermeda genética l cid por una m da mutación que substituye una Asn por u u una As en el comp sp plejo NADH mitocondria H al.

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a) ¿Cuáles son las frec cuencias gen notípicas par este ra carácter? ¿S Serían distin ntas a las fre ecuencias alé élicas? ¿por qué? b) Si aparec ciese una cor rriente eugen nésica que pr reconice “mejorar la raza hu r” umana que p proponga eliminar las enfermedades gené éticas por m métodos drá ásticos ¿deberían p prohibir tene hijos a tod los indiv er dos viduos con síntomas de LHON N?¿por qué? Atención: ignore ? los datos qu se enumer a continu ue ran uación para c contestar esta preg gunta. Gracias a lo conocimie os entos adquiridos en genét I y tica para buscar argumentos científicos para enfren r s ntar al movimiento eugenésico a Ud se le o o ocurre hacer 2 estudios: i) diagnóstico molecular c confirmatorio y ii) cuantificaci de la fre ión ecuencia de aparición es spontánea de esta mutación. E el primer caso encontr que, En ró además de los enfermos, existen individuos c con la mutación p pero asintom máticos (debi idos a heter roplasmia: presen de mitoc ncia condrias con genotipo normal y mutante en una única c célula) y en el segundo que la ignificativa. misma es si c) Argumen por qué estos estudio demostrar nte os rían la inutilidad p práctica de encarar la s selección ne egativa propuesta por los eugen nésicos. Respuestas a) Este es u carácter m s: un mitocondrial por lo que, salvo a algún caso r raro de heter roplasmia, el alelo está presen o ausente (como si fuera una e nte e especie monoploide Por lo t e)]. tanto, las fr recuencias a alélicas son iguales a las ge enotípicas f( f(LHON) = 0,3% F(normal) = 0,97% b) A las mu ujeres (y no a los varone porque s trata es) se de una herencia materna no hay nec a, cesidad de ev vitar la reproducció de los varo ón ones dado qu no transm ue miten la enfermedad d c) Despué de la sele és ección negati la segreg iva gación somática de los heteroplásticos y la aparición co e onstante de nueva mutacione similares llevarían la enferas es medad gené ética a las mismas cif fras actuales (después de algunas pocas generaciones) 5) El señor señalado con un círcu rojo ulo tiene una ra enferara medad gené ética y le pregunta: -V que Vos hiciste un cu rápiurso do de genét ¿me tica podrás aver riguar qué probabilidad tengo de d transmitirle esta enfermedad a mis futuros hijos? M señora Mi no posee est enferta medad pero ¡con la o genética nun se nca sabe!. ¿Me tendré que hacer un análisis yo o m señora? mi

¿L podrá cont Le testar sin nec cesidad de pe edirle un aná álisis genético detallado (pedi s igrí) a la señora? Justifique bre evemente.

Rt La proba ta: abilidad es n nula porque se trata de un cla ejemplo de herencia materna. No requiere de aro a N má análisis. ás Re espuestas alt ternativas vá álidas a esta pregunta (no a pedidas): a) Imprinting m materno b) podría ser un gen autonó n ómico recesiv vo En el caso b), SÍ debería h n hacer análisis genéticos. s

Evolución Mejoram n, miento, Biod diversidad 1) La papa-oca es un culti andino de origen pre a ivo d ecolom mbino (fue, para los inc tan impo cas, ortante como la o pap común) q se cultiv en el NOA y es de g pa que va gran int terés evolutivo, antropol lógico y eco onómico. Per rtenece a la esp pecie octoploide Oxalis tuberosa. El s nú úmero básico de cromoso o omas permit agrupar e tió esta esp pecie con otr dentro d género y postular su o ras, del origen evolutivo por alopolip n ploidía o aut topoliploidía de a esp pecies del gé énero. Para c corroborar es agrupami ste iento mediante est tudios de ev volución molecular y cuantific la similitu genética c otras esp car ud con pecies del gé énero, Tosto y co (Plant Sy , ol. ystem Evol 2000) utiliza 2 aron

AF FLP para ob btener patron de banda polimórfi nes as icas par así genera un dendrog ra ar grama.

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a) En la comparación se incluyó a O. articulata, la cual no pertenece al agrupamiento. ¿Por qué? b) En la comparación se incluyeron varias accesiones (individuos) de cada especie ¿Por qué? c) Observando el dendrograma y comparando distintas especies ¿podría intuir si la variabilidad genética de la especie cultivada es relativamente muy baja debido a la poliploidización, mejoramiento y selección? ¿Por qué? Respuestas esperadas: a) Es un control externo (outgroup) y sirve para relativizar las distancias genéticas o los índices de similitud que se obtienen dentro del agrupamiento en estudio. b) Para tener una idea del grado de variabilidad intraespecífica y compararlo con la interespecífica. c) Salvo por 2 individuos que parecen idénticos, el resto parece ser muy variable. A juzgar por el largo de las ramas, la variabilidad intraespecífica de O. tuberosa es no es menor a la variabilidad intraespecífica de las otras especies no cultivadas analizadas. 2) Existen teorías en conflicto acerca del origen del hombre. Existe consenso en que una especie anterior, llamada Homo erectus, se originó en África y se movió hacia otros continentes hace más de un millón de años. Posteriormente a este suceso empieza la controversia. La evidencia paleontológica parece apoyar la llamada teoría de evolución multiregional que postula que el Homo sapiens evolucionó local y paralelamente en Europa, Asia y África a partir del Homo erectus. Cuando se realizaron estudios moleculares con DNA mitocondrial surgió otra hipótesis (llamada out of Africa igual que la famosa película) que postula un origen único africano del Homo sapiens hace apenas 200.000 años. El hombre moderno se habría movido (igual que el Homo erectus) fuera de África, desplazando (y posiblemente extinguiendo) a otros homínidos. Los fósiles de los hombres de Neandertal ofrecen una oportunidad para confrontar ambas hipótesis. Los neandertales son homínidos descendientes del Homo erectus que vivieron en Europa entre 300.000 y 30.000 años atrás que, de acuerdo con la teoría africana, fueron desplazados por el hombre moderno (hombre de Cromagnon) procedente de África (o Asia central) hace unos 50.000 años atrás, mientras que la teoría multitregional apoyaría una relación evolutiva entre neandertales y los pueblos europeos más antiguos (como por ejemplo, los celtas). A partir de huesos fósiles se aisló DNA cuyas secuencias mitocondriales mostraron que sobre 994 nucleótidos analizados, un promedio de 27 posiciones mostraban diferencias entre humanos y el neandertal, mientras que los DNAs humanos de muestras de los más diversas procedentes de todos los rincones del mundo tienen diferencias en 8 posiciones. El fenograma obtenido se muestra a continuación. a) ¿A cuál de las 2 hipótesis apoyan estos resultados? Explique b) ¿Podría afirmar, con estos datos, que los neandertales (hasta ahora llamados Homo sapiens sbp neander-

talensis) pertenecieron a una especie distinta al Homo sapiens sbp sapiens? ¿Por qué?

Neandertal Humanos modernos (incluyen blancos, negros, australianos, amerindios, etc)
c) ¿Por qué se utilizaron secuencias mitocondriales y no secuencias nucleares? Respuestas: a) A out of Africa porque muestra que neandertales y cromagnones forman clusters (agrupamientos) muy separados entre sí. Si fuera cierta la hipótesis multiregional se esperarían mayores similitudes. De todos modos, hubiese sido interesado usar un outgroup (control externo) para relativizar estos valores. b) Sí, por lo explicado en a) aunque para estar seguro necesitaría comparar con, por ejemplo, el chimpancé. c) Porque las secuencias nucleotídicas mitocondriales tienen una tasa de mutación (velocidad de evolución) mucho mayor y permiten ajustar con mejor precisión el reloj molecular en estas distancias evolutivas. [Sin embargo, también se usa una secuencia nuclear ubicada en el cromosoma Y].

Genómica
1) Mediante el uso de marcadores moleculares se construyó un mapa de ligamiento del ratón, usando como genotipos parentales de la población de mapeo a dos líneas endocriadas que presentan una marcada diferencia respecto a su predisposición a contraer Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada por una acelerada desmielinización a nivel cerebral). Se localizó en dicho mapa de ligamiento, además, un locus (gen de expresión recesiva) involucrado en dicha predisposición. El mencionado gen (al que se denominó alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado a 10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (Nota: fue posible usar sondas humanas ya que muchas sondas de esta especie hibridan con DNA de ratón debido a su alto grado de parentesco). Recientemente, un grupo de investigación, clonó molecularmente en humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulación de la producción de mielina a nivel cerebral y lo mapeó en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM, por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publicación de dicho trabajo, los autores reportaron la localización cromosómica del gen y su secuencia completa. Al leer este trabajo, se sospechó (y con fundamento) que el gen de ratón podría ser un homólogo del gen

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humano. La amentableme ente ambos g grupos nunca colaa boraron par que esto se pudiera dem ra e mostrar. a) ¿Cuáles fueron los fu undamentos de la sospech ha? b) ¿Qué est trategia utilizaría usted p para clonar, al menos parcialm mente, al gen supuestam mente homólo de ogo ratón (recue erde que el g de ratón está mapead pero gen do no está secu uenciado y n se sabe si la similitud de seno cuencia es a alta, ni tampo si hibridan entre sí)? oco c) ¿Cómo verificaría, funcionalme ente, si el g de gen humanos cu umple la mis sma función que su hom n mólogo en ratones? Diseñe un experiment recordand que ? to do los genes y las proteína humanas s funciona en as son ales ratones y vi iceversa.
Fig. F 1
cM cM c

10 13

hs3 gdm hs1

12 15 1

hs3 alz hs1

Hum mano

Ratón

Respuesta: a) La sint tenia evolut tiva (conserv vación filogenética de mapas g a genéticos ent especies empatre rentadas) y, tal vez, las caracterís, ticas de los genes en cu s uanto a su rol fisiológi ico. b) Clonado posicional ( (cualquiera de sus va ariantes es correcta). Otras altern nativas de clonado ingeniosas pu ueden llegar a aceptarse. c) Hacer es studios de co omplementación en ratones tra ansgénicos (alz/alz, es decir homoc cigotas recesivos) us sando el gen humano n como transg gén. Espero que a ninguno se le ocurra hacer humanos r transgénicos para Alzhe eimer….. 2) El clonad molecular de genes do r de resistenc (R) a enfe cia ermedades en plantas e un viejo ob es bjetivo de los fitopatól logos que tra abajan en interacción huésped-pat tógeno. A fines de los ’90 se clona aron los primeros ge enes R por es strategias de clonado p posicional (v figura) ver y en la actualidad ya hay decenas y de estos gen en el Gen nes neBank y otras bases de datos. Ud se invod lucra en un proyecto de este tipo

ra solver un núm mero de cues spar su tesis y tiene que res tio ones: En el paso s identificar marcador moleculares n se ron res lig gados al locus a distancias genéticas del orden de los d 10 cM. En el p paso se obt tuvieron mar rcadores más s cer rcanos de for tal de di rma isminuir las distancias fís d sicas para que en el paso p s n poder trabaja con un ar nú úmero no muy grande de clones. y a) ¿Con qué tip de colecci po iones (librar ries) de clone es se trabaja para hacer esto? i) genómicos g ii) o de cDNA y ¿por qué? ¿ b) ¿Qué tipo de vectores se utilizan (plá e e ásmidos, fagos, cósmidos, BAC o YAC) y porqué? C c) Suponiendo que los marcadores mole eculares emple eados (M1, M M3 y M4 son RFLP ¿Cómo se M2, 4) Ps hace (metodoló ógicamente) para identifi los clone icar es 1, 2, 3 y 4 de la figura y su ordenamien posicional a nto (m mapa fisico)? d) ¿Cuál es el t tamaño físico aproximad (en kiloo do par de bases) de 1 unidad de mapa ge res ) d enético (1 cM M) en el ejemplo d la figura? de ¿Por qué esta d diferencia de unidades? ¿Cómo se mide ¿ cad una de ell da las? Un vez identificados los c na clones corresp pondientes a est región cromosómica, s insertos se subdividen ta sus s n en tamaños má chicos (paso ) para su subclonado y ás s tra ansferencia a plantas (pas so ) para ev valuar a estas últ timas fenotíp picamente co omo R (resist tentes) o S (se ensibles) a la enfermedad a d.

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e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas ¿se requiere de algún paso de subclonado en vectores especiales? ¿Se requiere, dentro de lo anterior, modificar el promotor y el terminador? ¿Por qué? ¿Se debe tener alguna consideración acerca del genotipo que se va a transformar? Es decir ¿se puede usar un clon de la misma planta que se usó para clonar el gen de resistencia? En el último paso (el ) se secuencian los insertos, se identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura) presentes, las que se constituyen en candidatos a genes R. f) ¿Cómo se identifica una secuencia ORF en un inserto? g) ¿y si hay más de una, cómo me doy cuenta de la correcta? h) Bioinformáticamente ¿de qué manera puedo asignarle una posible función al gen? Rta: a) Genómicos porque tengo representada una copia exacta del segmento cromosómico que estoy identificando, incluyendo regiones no codificantes que me van a servir para empalmar (identificar solapamientos entre clones) las secuencias con las que se arma el mapa físico de la región. Si usara clones de cDNA, no podría empalmar un clon con otro porque no habría secuencias comunes entre ellos. b) BACs o YACs porque son los que me permiten contener insertos más grandes y así poder tener reprensada la región cromosómica en el menor número de clones posible. c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse como sondas para inspeccionar (“screenear”) la genoteca y así identificar los clones que se corresponden al segmento cromosómico en estudio. El ordenamiento de los insertos lo puedo deducir de estas hibridaciones. Sé que el orden deducido del mapa genético es M1-M3-M4-M2. El mapa físico, en cambio, sólo me permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del clon 1 (que sólo hibrida con M3) tiene que estar ubicado en un extremo y así sucesivamente. La ocurrencia de insertos que hibridan un marcador y al gen (clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento. d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 – 3500 kpb Porque uma proviene del mapeo genético que se realiza mediante cruzamiento y recuento de recombinantes (unidades de recombinación o cM) y la otra por mapeo de restricción donde se comparan los tamaños de los insertos com estándares de tamaño molecular en kilo pare de bases. e) Si se decide utilizar transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo en un vector Ti. En el caso de usar biolística (cañón génico), no haría falta subclonar en ningún vector es-

pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias porque estamos trabajando con genes y secuencias nativas y el experimento no requiere cambiar la regulación de su expresión. No se puede elegir un clon de la planta de la cual se clonó el gen porque sería resistente independientemente del inserto que se le introduzca. Debería elegirse un genotipo susceptible a la enfermedad. f, g y h) Identificando codones de iniciación (ATG) y terminación (alguno de los 3 codones STOP) con programas informáticos. Esto se podría complementar mediante la identificación de secuencias consenso de promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el uso de BLAST y comparación con otras secuencias ya publicadas.

Desarrollo, epigenética, etc.
1) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster participan varias moléculas conocidas como morfógenos, siendo en las primeras etapas, de origen materno ( los mRNAs que codifican para dichos morfógenos se traducen en el huevo, pero provienen de las células nutricias maternas). Ejemplo de esto y responsables del establecimiento del eje anteroposterior son: -en la parte anterior del embrión, BICOID (bcd) y más tardíamente HUNCHBACK (hb), productos de los respectivos mRNA maternos. -en la parte posterior del embrión, NANOS (nos) y más tardíamente CAUDAL (cd), productos de los respectivosmRNA maternos. Se demostró también que: -la proteína bcd reconoce el 3’UTR del mRNA de cd y enla región promotora del gen hb -la proteína nos reconoce el 3’UTR del mRNA de hb. I) ¿Qué tipo de acción presentan bcd y nos según lo comentado anteriormente? Para contestar complete el siguiente esquema con flechas de unión: (convenciones: → activación, ---| inhibición).

II) Con toda la información que tiene acerca de bcd, complete los fenotipos que espera observar en los experimentos de la Fig asignando en cada caso, alguna de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura, en donde se ha ensayado el agregado de mRNA bcd en embriones con diferentes fondos genéticos En la Figura siguiente, complete (con flechas) el esquema de los resultados de inyección de mRNA de bcd.

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Rta I) bcd nos

gen HB

mRNA

hb

cd

mRNA cd

hb

Explicación: bcd y nos son los morfógenos de la parte anterior y posterior: bcd actua como factor de transcripción para hb regulando positivamente su transcripción, pero también es un inhibidor de la traducción del morfógeno cd, que es más tardío. Análogamente, nos es un inhibidor del morfógeno más tardio de la parte anterior, hb. II) Explicación: bcd es el morfógeno principal anterior, ya que donde se coloca, se generan zonas que darán lugar a estructuras anteriores (cabeza y torax). El esquema del primer experimento sería análogo a una complementación (mutante bcd-, con fenotipo WT por el agregado del morfógeno anterior en la zona correspondiente).
Desarrollo normal Desarrollo en mutante bcdinyectado adelante inyectado al medio iny. atrás en salvaje

?

?

?

Las 4 opciones para los 3 casos incógnita 2) Muchos tipos de cáncer humano tienen su causa en la hipometilación del ADN. Para estudiar este fenómeno se generaron ratones transgénicos conteniendo alguna de estas construcciones: i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente de un adenovirus) controlando la expresión de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la

expresión de la secuencia de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación sentido iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago λ controlando la expresión de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación sentido iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago λ controlando la expresión de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido

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Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilación del ADN en ratones y que su sobre-expresión permite metilar exhaustivamente todo potencial ADN metilable y que su disminución causa una sustancial hipometilación del ADN en todos los tejidos. a) ¿Cuál de los 4 vectores usaría? ¿Por qué? b) En base al vector elegido, ¿cómo espera que sea el grado de metilación general del ratón transgénico? Explique el mecanismo c) ¿Con cuál de las siguientes técnicas corroboraría que el ADN está hipometilado? Justifique: i) digestión con sendas ER que reconocen sitios metilados y no metilados, respectivamente, seguido de Southern Blot con la sonda Dnmt1 ii) ensayo de protección a la digestión por ADNasaI iii) preparación de ARN de ratón salvaje y ratón transgénico, seguida de Northern Blot con la sonda Dnmt1 iv) digestión con ER que reconocen sitios metilados, seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insulin-like growth factor-2, conocido gen que sufre impronta génica) v) secuenciación bisulfítica genómica directa de Dnmt1y/o igf2 vi) secuenciación bisulfítica del cDNA de Dnmt1y/o igf2 Para la/s técnica/s elegida/s indique los controles que haría. El ratón transgénico desarrolló tumores en varios tejidos. Se determinó que el gen Tm, candidato a causar tumores en hígado, se encontraba hipometilado en estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI. d) ¿Cómo haría para probar que Tm sufre impronta (imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con ratones homocigotas como con heterocigotas. e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm en el macho ¿cómo sería la proporción de Tm1 y Tm2 metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos de un cruzamiento entre ratones ♂ homocigotas para Tm1 y ♀ Tm2? Respuesta a) El i) porque es el único que tiene un promotor que se expresa en células eucarióticas y tiene potencialidad de reducir la actividad de mutilación bloqueando la traducción del gen que codifica la enzima Dmnt 1. Contestación no necesaria: Podría venir bien usar al vector ii) pero sólo como CONTROL

contrastante del experimento. Las construcciones de los vectores iii) y iv) no se expresarían en células eucarióticas porque λ sólo funciona en bacterias. b) Altamente reducida. El RNA antisentido (complementario) de Dmnt 1 formará una doble cadena de RNA con el mensajero nativo dificultando su traducibilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce también el efecto de la misma. c) La v) dado que este tipo de secuenciación permite detectar nucleótidos metilados. Se debe secuenciar un gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si éste es el caso del gen Dmnt1 y lo más probable es que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como control (no metilado). En realidad, el control más importante es comparar con la secuenciación común (que es insensible a la metilación) y (como se indica después) ratones transgénicos vs no transgénicos. La iv) sirve si se compara el patrón de restricción de ratón transgénico vs no transgénico. También podría ser aceptada como válida si se explica que se usa ER que NO reconocen sitios metilados, además de los metilados para así comparar ambos patrones, dado que usar sólo una enzima que sí reconoce sitios metilados, no es capaz de diferenciarlos de los no metilados. Una complicación (que no es necesario explicitar en la respuesta correcta) es que los genes metilados por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y otro no metilado. d) Cruzaría 2 homocigotas: por ej. ♂ homocigotas para Tm1 y ♀ Tm2. Después, analizaría en la F1 la correspondencia entre metilación (por ej. por secuenciación bisulfítica que, además, me revelará la presencia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado). (La otra alternativa es una doble digestión con ER sensible/insensibles a metilación + EcoRI seguido de Southern). En base a cual alelo aparezca metilado determinaré si el imprinting es paterno o materno. La confirmación del imprinting se puede hacer realizando un cruzamiento “prueba” con el parental que no metila sus gametas. Debería ver un 50% de la progenie con metilación para cada alelo. e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia de las 2 metiladas (Tm1m/Tm1), 25% Tm2 homocigotas ídem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con metilación en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas con metilación en Tm2 (Tm2m/Tm1).

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