Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
MICROSATÉLITES
UTILIZADOS EN
IDENTIFICACIÓN HUMANA
PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE
Muestra obtenida de la ADN
escena del crimen o de BIOLOGÍA
una prueba de paternidad
Extraccion
Extraccion Cuantificacion
Cuantificacion Amplificación
AmplificaciónPCR
PCRde
de
de de
deADN marcadores STRs
deADN
ADN ADN marcadores STRs
TECNOLOGÍA
Comparación GENÉTICA
Comparación del
del Entrega
Entrega de
de resultados
resultados
genotipo de la muestra
genotipo de la muestra (cálculos estadísiticos)
(cálculos estadísiticos)
con
con otros
otros resultados
resultados
Análisis
Análisis de
de los
los resultados
resultados
(comparación
(comparación con datos
con datos
poblacionales)
poblacionales)
•Describir tipo de
muestra, su color, su
forma, su marca,
etiqueta y talla si
procede, tipo de
envoltorio que lo
contenía y estado de
conservación.
•Muestras dubitadas
•Muestras indubitadas
Extracción no orgánica
(agentes quelantes): agentes
quelantes: resina Chelex,
formada por copolímeros de
estirenodivinilbenceno que
contienen iones
iminodiacetato que actúan
como grupos quelantes.
CUANTIFICACION DEL ADN
Fluorometría
Fundamento: capacidad de
unión del ADN a ciertos tintes
fluorescentes como H33258
Se utiliza un Fluorímetro:
lámpara de mercurio y un
detector para medir
fluorescencia relativa a 460nm
Utiliza un espectrofotómetro,
medidas de absorbancia a 260 y
280nm
http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Anal
ysis.html
CUANTIFICACION DEL ADN
Minigel de agarosa
Midiendo la fluorescencia
inducida por ultravioleta que
se produce cuando se
intercalan moléculas de
bromuro de etidio entre el
ADN
Poco sensible
Sondas marcadas
•Solo cuantifica
ADN humano
•Altamente
sensible, detecta
cantidades del
orden de 20pg
•Cuantifica ADN de
cadena sencilla y
muestras de ADN
no purificadas
QuantiBlot
CUANTIFICACION DEL ADN
Cuantificación enzimática
Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP que depende
de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de
una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP
AMPLIFICACION DEL ADN
TÉCNICA DE PCR
5’ 3’
5’ 3’
ADN MOLDE
3’ 5’
3’ 5’
Cadenas
separadas
(denaturación)
Forward primer
5’ 3’ 5’ 3’
Copias (extensión
Adición
de de )
primers
primers 3’ 5’
3’ 5’
(alineamiento) Reverse primer
MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR
Thermal cycle
En
En32
32ciclos
cicloscon
conun
un100%
100%de deeficiencia
eficienciase
sepueden
puedenproducir
producirhasta
hasta
1.07 billones de copias de ADN molde
1.07 billones de copias de ADN molde
MULTIPLEX PCR
Util en análisis de
muestras degradadas y de
mezclas
Ventajas: disminuye
costos, tiempo,
contaminación del ADN
SEPARACION de PRODUCTOS PCR
Electroforesis capilar
Electroforesis en geles de poliacrilamida
EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX
AmpFlSTR® Profiler Plus™
ROX
(red)
Estandar interno GS500
9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR
ELECTROFORESIS
Electroforesis convencional
Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida
Fundamento
El ADN está cargado negativamente
y al someterlo a una diferencia de
potencial se moverá hacia el ánodo
a través del gel una distancia
proporcional a su tamaño,
alcanzando mayor distancia las
moléculas de menor peso.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ESCALERAS ALELICAS
ELECTROFORESIS CAPILAR
Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar,
el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia
emitida por los colorantes es colectada por el detector a
longitudes de onda particulares y registrados como señales
digitales en el computador.
TIPIFICACION DE STRs
TECNICAS DE HIBRIDACION
SECUENCIACION
http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/F/FluorDideoxySeq.gif
El instrumento de secuenciación automática genera un
cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos
cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden
de estos colores corresponde a el orden de las bases en el
ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente
desde el cromatograma.
BIOCHIPS