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Paula Fernndez
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado especfico o productos amplificados previamente)
Geles de agarosa.
* Baja precisin
* Baja sensibilidad
* Baja resolucin
* No automatizado
* Discriminacin slo por tamao
* Resultados cualitativos
Consiste en dos pasos:
Transcripcin reversa
RT-PCR PCR
mRNA
OBJETIVO:
Deteccin de la expresin de cDNA (simple cadena)
un gen por presencia de
mRNA
cDNA (doble cadena)
PCR
PCR en tiempo real
Xn
Xn = X0(1 + E)n
Resultados
Una diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificacin result en u
nmero final de copias significativamente menor.
log view
Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra
un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a
lo largo del plateau los datos no representaran la cantidad inicial del target.
En la prctica uno no observa los
amplicones sino una medida indirecta
de su abundancia.
9.9
terica de 7.7
fluorescencia 6.6
Fluorescencia
en funcin del
5.5
4.4
nmero de 3.3
ciclos? 2.2
1.1
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Ciclos
Cmo es
8.0
7.0
fluorescencia 5.0
real en
Fluorescencia
4.0
nmero de 2.0
ciclos? 1.0
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Ciclo
La mayora de las curvas de fluorescencia
presentan valores errticos para los
ciclos iniciales de la reaccin cuyo origen
es diverso.
Rn
Sample
Threshold Rn
Rn
Rn
No Template
Control
CT
0 10 20 30 40
Cycle number
Rn
dmeros
DISEO EN PLACA
Relative expression
Alta sensibilidad
Determinacin del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la
reaccin de PCR cuantitativa (LinReg PCR)
Normalizacin con genes de referencia
Limitantes:
Dependencia de genes analizados
Evala media aritmtica de los desvos estndard de a pares de genes
Supuesto de estabilidad de todos los genes 40
Bsqueda de genes de referencia
Modelo estadstico
Uso de geNorm
Functional Genomics Strategies applied to the study
of senescence in sunflower
Biomarkers (genes,
transcripts & metabolites)
of senescence process in
Moschen 2009
Normalizacin de PCR cuantitativa y
bsqueda de genes de referencia
Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mRNA (Kim y col. 2003)
(refutado por Solanas y col. 2001).
Sunflower Unigene Resource (SUR v.1.0)
VecScreen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html)
Trimseq EMBOSS
(http://emboss.sourceforge.net/)
Campo Invernculo
T111
F230
F209
T234
F550
F401
H411
H322
H387
H125
F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2
F192
F210
T253
F137
H136
H385
H302
H123
H124
H110
F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2
T322
F171
F175
T221
F549
F543
T289
H304
F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
EF624
EF502
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
expresados
C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2
T187
T107
F216
T340
F231
F443
H209
H111
H354
F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
EF432
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
Validacin por qPCR de genes diferencialmente
Perfil de expresin
80 genes candidatos
para cada uno de los
Estudios de expresin de genes candidatos
frente a estreses abiticos
6
6
5
5
4 FH
4 FH Rn SH
Rn
SH 3 CH
3
CH
?
2
2
1
1
34
35
36
37
38
39
40
32
33
21
22
23
24
25
26
27
31
28
29
30
0
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
-1
-1
Ciclo
Ciclo
Mtodos de deteccin por hidrlisis de ADN
(Sondas TaqMan)
Su utilidad radica en que poseen un fluorforo en su extremo 3' y una molcula en el 5'
que bloquea su emisin de fluorescencia (denominada en ingls quencher); esta
sonda marcada hibrida especficamente en la parte central del producto de PCR a
obtener.