HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS

BIOTECNOLOGA MDICA Ing. Cinthia Crdova Barrios

Introduccin
BIOLOGA MOLECULAR

INGENIERA GENTICA

PATOLOGA MOLECULAR

Bases moleculares

Mtodos de ensayo

Aplicaciones

Introduccin
La hibridacin se basa en el proceso de renaturalizacin

Hbridos DNA-DNA, RNARNA y DNA-RNA

Renaturalizacin de dos cadenas sencillas de DNA (bases complementarias )

DNA dplex desnaturalizado

Desnaturalizacn:

DESNATURALIZACIN Rotura de los puentes de hidrgeno entre pares de bases. Interacciones hidrfobicas entre bases apiladas.

Genera la prdida de la conformacin tridimensional o duplohelicoidal, determinando la separacin de las hebras y una conformacin al azar o de ovillo. *RNA

Agentes Desnaturalizantes Desnaturalizantes

Temperatura

cidos y bases Agentes qumicos

Agentes Desnaturalizantes

Temperatura
Es el ms representativo. Se debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hlice.

cidos y bases
Valores de pH alejados de la neutralidad (apareaminento) Condiciones cidas: Ruptura de la estructura primaria (enlaces y separacin de bases.) Condiciones alcalinas: desnaturalizacin.*

Agentes qumicos
Molculas polares con grupos amino y carbonilo. Frecuentes: urea, formamida, formaldehdo. Compiten en la formacin de enlaces puente de hidrgeno. *

La desnaturalizacin es reversible o irreversible (recuperacin)

Efecto de la temperatura

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA

Influencia en las propiedades

Viscosidad

Absorcin ultravioleta
Rotacin ptica.

Densidad de flotacin.
Permiten diferenciar el DNA de doble hebra y el de hebra sencilla.

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA VISCOSIDAD (Rigidez y forma*)

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIN (dobles enlaces*)

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIN ULTRAVIOLETA

Curvas de desnaturalizacin
Representa Carcter sigmoidal

Caracterstic a propia

Interaccin cooperativa

Curvas de desnaturalizacin
Curvas de fusin Temperatura de fusin, Tm

Tm y el contenido de bases

Estabilidad estructural.

Curvas de desnaturalizacin
Evolucin Dogma central

Curvas de desnaturalizacin y renaturalizacin

Hibridacin de cidos nucleicos Introduccin

La renaturalizacin depende de la complementariedad de secuencia de las hebras. Lo ms probable es su reasociacin formando los dplex originales. Formacin de molculas dplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (especie o cido nucleico). Hibridacin
La estabilidad del hbrido depende de la proporcin de bases complementarias y mayor longitud de las secuencias apareadas. La hibridacin puede tener un carcter artificial (homo y hetero), pero complementario.

La hibridacin relaciona el grado de herencia evolutiva o conexin (homologa, pe)

Hibridacin de cidos nucleicos Principio bsico:

Especificidad de la interaccin entre base complementarias

Secuencia diana

En uno de los fragmentos, obtenidos por enzimas de restriccin, de la muestra de DNA.

Fragmento corto de DNA, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia diana, marcado de forma que permita su deteccin.

Sonda

Hibridacin de cidos nucleicos Principio bsico:

Hibridacin de cidos nucleicos Factores que influyen:

Factores
Concentracin de cido nucleico. Nmero de copias de la secuencia diana.
Concentracin y tamao de la sonda. Temperatura.

Tiempo de hibridacin. Caractersticas del medio de reaccin.

Hibridacin de cidos nucleicos Rigor de la hibridacin:

DEFINICIN
Grado de especificidad en el apareamiento conseguido en los hbridos

CONTROL

DEPENDE

Esencial

Temperatura y tiempo de renaturalizacin

Capacidad de reconocimiento mutuo de dos secuencias

No alto, que impida la unin estable de la sonda a su diana

Composicin de bases

Apareamiento completo entre sonda y diana.

No bajo, que permita la hibridacin inespecfica de la sonda. Falso positivo

Ambiente qumico: Presencia de cationes y desnaturalizantes.

Hibridacin de cidos nucleicos Rigor de la hibridacin:

Hibridacin de cidos nucleicos Mtodos de ensayos

DNA CON SECUENCIA DIANA SONDA MARCADA

HIBRIDACIN

MTODOS DE HIBRIDACIN

En fase lquida En soporte slido In situ

Hibridacin en fase lquida

Mtodo inicialmente empleado Muestra de DNA o RNA en disolucin con la sonda. Cintica rpida Tcnica cuantitativa..

Hibridacin en fase lquida

Hibridacin en soporte slido

Ensayo ms simple. Permite procesar varias muestras simultneamente. Cintica lenta. Fcil control de la hibridacin.

Hibridacin en soporte slido

Identificar en colonias bacterianas el gen en forma de plsmido recombinante

Hibridacin en soporte slido: DOT-BLOT Y SLOT-BLOT

Ensayo ms simple y comn Emplea muestras de cido nucleico sin purificar. Muestra se aplica gota a gota. Dot blot. Muestra en manchas alargadas sobre un papel filtro. Slot blot

Hibridacin en soporte slido: DOT-BLOT Y SLOT-BLOT

Hibridacin en soporte slido: SOUTHERN BLOT

Tcnica simple y fcil. Detecta fragmentos de DNA (ER) separados por electroforesis. Transferencia a un soporte slido o filtro. Deteccin

HIBRIDACIN EN SOPORTE SLIDO: SOUTHERN

Deteccin

Hibridacin Transferencia

Desnaturalizacin

Separacin electrofortica

Hibridacin en soporte slido: SOUTHERN BLOT

Hibridacin en soporte slido: SOUTHERN BLOT

Hibridacin en soporte slido: NORTHERN BLOT

Tcnica simple y fcil. Detecta fragmentos de RNA separados por electroforesis. Transferencia a un soporte slido o filtro. Deteccin

Hibridacin in situ

In situ cromosmica

Se realiza sobre cortes de tejido (fijados con formalina, parafina o congelados)clulas intactas, ncleos aislados. Deteccin: autorradiografa o microscopa de fluorescencia. Detecta virus patgenos. Diagnsticos de clulas cancerosas. Expresin gentica

Se realiza en preparaciones fijadas en porta de cromosomas metafsicos. La secuencia de DNA se trata con enzimas proteolticas y se desnaturaliza el DNA. Hibridacin con la sonda. Deteccin con sondas marcadas con fluorescencia (FISH). Diagnstico de cromosomopatas, genes tumorales, virologa, trasplantes, cariotipo molecular (pintado de cromosomas)

Tisular

Transferencia WESTERN BLOT

No existe hibridacin Detecta protenas separadas por electroforesis en SDS-PAGE Transferencia a un soporte slido o filtro. Deteccin: anticuerpo marcado o protena ligante.

Transferencia WESTERN BLOT