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Electroforesis de Adn e. Coli

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Published by: Miguel Angel Rodas Herrera on Dec 08, 2009
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Universidad Autónoma de Chiapas Facultad de Ciencias Químicas Campus IV

LABORATORIO DE GENETICA APLICADA

PRACTICA NO. 4 “CORRIMIENTO ELECTROFORÉTICO DE DNA DE E. COLI”

CATEDRATICO: DR. KARINA TRUJILLO MURILLO

TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE NOVIEMBRE DEL 2009

INTRODUCCION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel, La agarosa que es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN.

DNA plasmidico

Dibujo esquemático de un plásmido en una bacteria: en rojo, el ADN del cromosoma; en azul, los plásmidos.

Los plásmidos, vectores o también llamados plasmidios, son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en

algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras, aparecen en el citoplasma de las bacterias. Su tamaño varía desde 1 a 250 pb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Determinan ciertos rasgos, que no son vitales, pero que de alguna manera determinan la capacidad del organismo para adaptarse. Estas moléculas de ADN portan solamente unos pocos genes que en cierto modo están ligados al cromosoma bacteriano, de forma que se replican en números fijos, junto con los cromosomas. Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas. Poseen información genética importante para las bacterias. Por ejemplo, los genes que codifican para las proteínas que las hacen resistentes a los antibióticos están, frecuentemente, en los plásmidos. Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma. Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal como así también por que es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes, los basados en fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que le confieren una ventaja selectiva lo cual les da la habilidad de hacer a la bacteria, resistente a los antibióticos. Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotes.

RESULTADOS

• • • • •

Se utilizó un marcador de peso molecular de 500 pb Se utilizó muestras de DNA de la bacteria E. coli Se preparó un gel de agarosa al 0.8% (preparado con anterioridad) Se utilizó un buffer de carga o jugo azul (naranja g, azul de bromofenol, xilencianol y glicerol ) ya preparado por el catedrático Ya que corrieron las muestras se expusieron a luz UV y este fue el resultado C 1 A R R I 11 L 12 E S

500 pb Marcador De Peso Molecular

Carril 11: en este carril fue donde depositamos la muestra de la primer practica de extracción de DNA de E. coli, en la cual no hubo mucho crecimiento bacteriano y lo cual se vio reflejado en el corrimiento porque no se noto en el gel de agarosa. Carril 12: en este carril fue donde depositamos la muestra de la segunda practica de extracción de DNA de E. coli, en la cual si hubo crecimiento bacteriano y lo cual se vio reflejado en el corrimiento porque si se noto en el gel de agarosa. En todos los carriles hubo corrimiento del DNA de E. coli extraído en la segunda practica. Solo en el último equipo hubo corrimiento del DNA de E. coli de las dos extracciones. En el primer equipo el corrimiento (que es el carril 1) fue mas notable por el motivo que el crecimiento bacteriano fue mayor.

DISCUSION
• El marcador de peso molecular estuvo constituido por 1 µL del marcador y 1 µL del buffer de carga, su rango era de 500 Pb

Las muestras de DNA de la bacteria E. coli estaban constituidas por 1 µL muestra y 1 µL de buffer de carga

El buffer de carga o jugo azul estaba constituido por: naranja g, azul de bromofenol, xilencianol y glicerol, este buffer nos indica donde va nuestra muestra mientras corre en la cámara de electroforesis.

Se introdujo el gel en la cámara de electroforesis y se sumergieron a un volumen aproximado de 5 mm sobre el con TBE 1x

En cada pocito se agrego 2 µL de la muestra con mucho cuidado para que no se saliera fuera de ella o se rompiera el gel con las puntillas de las micropipetas.

Esta plástico de color negro se utiliza como Recurso para poder ver en que pocito se

. muestras y los Marcadores de

Colocaran las PM.

Ya que se terminaron de agregar todas las muestras en sus respectivos pozos, se procedió a cerrar la cámara de electroforesis cuidando de que los electrodos fueran bien colocadas, ya que recordemos que el DNA tiene carga eléctrica negativa y correrá hacia el ánodo.

CATODO ANODO

Ya que se cerró correctamente la cámara se procede a prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado. Esto es muy importante pues recordemos que esta técnica es mediante una carga eléctrica controlada

Después de que corrió la muestra hasta donde queremos (se ve gracias al buffer de carga), apagamos el equipo y procedemos a destapar la cámara electroforética. Sacamos los geles

Y los colocamos en el revelador, en este caso bromuro de etidio y dejamos los geles aproximadamente 5 minutos. Precaución: El bromuro de etidio es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la solución o tener contacto directo con esta

Po último examinamos el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.

CONCLUSION

✔ Pudimos realizar el corrimiento electroforético de ácidos nucleicos extraídos y purificados de la bacteria E. coli

✔ Aprendimos de nuevo a preparar la cámara electroforética y como colocar los electrodos pues ya que la molécula de DNA tiene carga negativa.

✔ Pudimos meter el gel de agarosa en bromuro de etidio

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