Técnicas básicas de

hibridación

MBIO2102
Departamento de Ciencias Biológicas
 Técnicas de blotting

Southern Blot Northern Blot Western

Blot

……y dot blot y colony blot

Hibridación de ácidos nucleicos
dsDNA ssDNA dsDNA

• ¿En qué se fundamenta la hibridación?

Hibridación de ácidos nucleicos
• Todas las moléculas de DNA
de doble hebra (dsDNA) se
pueden denaturar con altas
temperaturas (60ºC) o con
NaOH formando dos hebras
de DNA (ssDNA)
• Cada hebra de ssDNA
puede encontrar su
complementaria y unirse
nuevamente
• ¿Cuáles son las técnicas de
hibridación de AN (más
comunes)?
Hibridación: procedimiento
• Electroforesis (opcional)
• Transferencia a fase solida
• Denaturación de los AN
• Fijación
• Pre-hibridación (bloqueo)
• Hibridación
• Revelado
 Southern blot
• Southern blot:
– Proceso de hibridación para el DNA
– Sirve para identificar (presencia; ausencia) una
región en el genoma
• El material genético de partida es
usualmente DNA genómico (ej, de
individuos enfermos o sanos en una familia)

• https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgC
tk3c
Southern Blot: deteccion de una secuencia de
DNA en una muestra compleja (ej: genoma)

Cómo se verá el gel después

de correr estos fragmentos?
Cortando DNA genómico con
enzima de restricción: barrido
(smear) de DNA

No cortado
No cortado

Cortado

Cortado
¿Por qué no bandas especificas?
MW
Cortando DNA genómico con
enzima de restricción: barrido
(smear) de DNA

No cortado
No cortado

Cortado

Cortado
MW
Southern Blot: deteccion de una secuencia de
DNA en una muestra compleja (ej: genoma)
 Qué es una sonda?
Sonda específica

Detecta DNA de interés No detecta otro DNA

• La sonda de hibridación es un fragmento de DNA (o de RNA) de 100 a

1000 bases de longitud
• Es secuencia conocida complementaria a la región del AN que quiero
hibridar
• La sonda debe estar marcada, para que emita señal y así detectar la
hibridación
Super resumido…..
Southern blot: transferencia a la
membrana de nylon

Nylon cargado positivamente

Transferencia en solución
alcalina- por qué?
¿Será que pueden suceder hibridaciones parciales?
Concepto de astringencia

• El aumento de las temperaturas y la disminución de la

concentración de sales mejoran la astringencia
 Parámetros de la hibridación
• Concepto de astringencia: hace la hibridación más
específica
• Al mejorar la astringencia se optimizan las condiciones
de hibridación entre la sonda y el DNA blanco para
evitar los falsos positivos
• Temperatura elevada y baja concentración salina
favorecen la astringencia de la hibridación
– Ojo: como hemos visto, también depende del
contenido de GC!
 ¿Cómo asegurar
especificidad?

Mejorando la Astringencia:
- Aumentando temperatura
- Disminuyendo concentración de sales

Bonin et al., 1997. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. Vol. 94, pp. 2085–
2090.

• ¿Cuál hibridación tuvo baja astringencia?

 Southern blot: aplicaciones
• Estudio de genes: detectar la presencia de
una región particular de DNA en un muestra
• Mapeo y estudios de desarrollo
• Diagnóstico y técnicas forenses (DNA
fingerprinting)
• Identificación de genes transferidos
(transgénicos)
• Análisis de patrones genéticos en el DNA de
un individuo
 Aplicaciones: detección de SNPs
• SNP: Single Nucleotide
polymorphism
• En este caso se llama
Restriction Fragment
Length Polymorphism
(RFLP)
 Aplicaciones: detección de SNPs por RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
1. A
1. Se digiere el DNA 2. Se digiere, se transfiere
genómico. Parte de interés: y se hibridiza
 Aplicaciones: detección de SNPs por RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism

Distinción entre alelos polimórficos para

un sitio de restricción

DNA
genómico
Monomórfico / Polimórfico

Heterocigoto
Homocigoto para el alelo
2
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.484 Homocigoto para el alelo
 Aplicaciones: detección de SNPs por RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Ejemplo: Detección de SNP en la beta globina
GTGGAG es un SNP

Hay heterocigotos? Hay homocigotos? Dominante y recesivo? Puedo ver esto?

 Northern blot

• Igual, pero: RNA total (no RE!!) en

el gel y luego en la membrana
• DNA como sonda
• Detecto si esa muestra está
expresando ese RNA en ese
momento o condición
• http://www.youtube.com/watch?v=
KfHZFyADnNg
RNA total
 Northern blot: aplicaciones
• Análisis de la expresión de
los genes EGF (epidermal
growth factor) y TGF-alpha
(transforming growth
factor) en células normales
y con cáncer de páncreas.
• ¿Para qué ver los
niveles de expresión
de 7S?

Streit et al., 2008. Nature Protocols 4, 37 - 43

https://www.mun.ca/biology/scarr/RFLP_sickle-cell_test.html
 Northern blot: aplicaciones
• Proporciona información de la presencia de
un transcrito de RNA complementario a la
sonda
• Sirve para examinar patrones de expresión
génica
• Es posible caracterizar y cuantificar la
actividad transcripcional de un gen
determinado
• ….. Uno a la vez! 
Hibridación: procedimiento
• Electroforesis (opcional)
• Transferencia a fase solida
• Denaturación de los AN
• Fijación
• Pre-hibridación (bloqueo)
• Hibridación
• Revelado
• ¿Por qué decimos que la
electroforesis es opcional?
• Técnica de Dot blot
Colony blot: un blot de
colonias
Colony blot

Transferencia
 Colony blot

Marcaje e hibridación
Resumen colony blot

 Transferencia

 Lisis de los

fagos

 Hibridación
Colony blot
 Sonda de hibridación
*Puede ser marcada de otra manera

• Fragmento normalmente de DNA (100-1000 bases)

• Se usa para detectar la presencia de una secuencia de interés en la muestra
• Se busca complementariedad entre la secuencia y la sonda
• La sonda debe hibridizar con AN de hebra simple (ssDNA)
• La ‘correcta’ hibridación se da por la complementariedad entre la sonda y
secuencia blanco
 Sonda de hibridación
• Secuencia complementaria al DNA blanco
• ¿Cómo generar una sonda?
• Síntesis de sondas
– Nick Translation
– Random Priming
• ¿Cómo hacer que una sonda emita una señal?
• Es un fragmento de AN nucléico marcado
– Radioisótopos
– Métodos no radioactivos (Biotina o digoxigenina)
Random priming
• Primers al azar
 Marcaje radioactivo
• dATP marcado

La DNA polimerasa lo incorpora en una

hebra nueva: esta es mi sonda

Lo detecto con una película de rayos X o con una máquina que detecte radioactividad
Marcajes no radioativos más usados: Biotina
o Digoxigenina
 FISH: Fluorescence in situ hybridization
• Otra técnica de hibridización
• Sirve para detectar una secuencia en un
cromosoma
• Mismo principio: hibridación- Uso una sonda
fluorescente pero mi target son los cromosomas
condensados

Creative Bioarray. [2018]. Fluorescent In Situ Hybridization. [Video]. Recuperado de https://www.youtube.com/watch?v=b81DcJC1jAs

FISH: Fluorescence in situ hybridization
• Mismo principio
pero se hibrida una
sonda marcada con
los cromosomas en
metafase
 FISH: Fluorescence in situ hybridization

1
4

3 Detección por microscopía fluorescente

La sonda siempre es fluorescente

HenrisksWorld. [2018]. FISH_ Fluorescent In Situ Hybridization. [Video]. Recuperado de https://www.youtube.com/watch?v=LiRJoTi44TA

FISH: Fluorescence in situ hybridization
Aplicaciones

Número de cromosomas

HenrisksWorld. [2018]. FISH_ Fluorescent In Situ Hybridization. [Video]. Recuperado de https://www.youtube.com/watch?v=LiRJoTi44TA

Preguntas?