Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Básicas

Programa de Microbiología

GUIA DE TRABAJO N°3

EVALUACIÓN DE LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL ADN

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OBJETIVO GENERAL

✓ Cuantificar y determinar la pureza del ADN extraído de S. cerevisiae mediante espectrofotometría y

electroforesis en gel de agarosa, para el desarrollo posterior de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR).

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Es de vital importancia verificar tanto la presencia como la cantidad y calidad del ADN extraído, para lo cual
existen diversas metodologías, entre ellas, la técnica de electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un
polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por
enlaces glucosídicos α (1-3) y β (1-4), los cuales forman fibras helicoidales que al solidificar conforman una
malla tridimensional de canales que permiten separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño
(Kirkpatrick, 1990). Durante la electroforesis, una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitirán
el desplazamiento y la separación de las moléculas de ADN en función de su tamaño y topología. Las
moléculas de ADN debido a su carga neta negativa, se desplazarán hacia el ánodo, migrando con mayor
rapidez las moléculas de menor tamaño. Adicionalmente, para la visualización del material genético en el gel
de agarosa, es necesario el uso de agentes intercalantes como el bromuro de etidio (BrEt) o el Sybr Green,
los cuales se unen a la molécula de ADN y al ser expuestos a luz ultravioleta emiten fluorescencia (Cornejo,
et al. 2014).

El material genético también puede ser cuantificado mediante espectrofotometría. La ley de Lambert-Beert
indica que la concentración de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida por las
moléculas disueltas. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta a 260 nm, lo que permite
estimar su concentración mediante el uso de un Espectrofotómetro UV-Visible. Cuando la longitud de la
celda en que se disuelve el ADN es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO), por tanto, una
densidad óptica (1) equivale a: 50 ug/mL de ADN genómico o de doble cadena, 33 µg/mL de ADN cadena
sencilla, 20-30 µg/mL de oligonucleótidos entre 20 a 40 bases y a 40 µg/mL de RNA (Cornejo, et al. 2014).
Para estimar la pureza del ADN se consideran dos factores: la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280
nm (una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la
presencia de proteínas) y la proporción 260 nm/230 nm (los valores aceptados se encuentran en el rango de
2.0 a 2.2, si la relación es menor indican la presencia de contaminantes como carbohidratos). En caso de
contaminación, es necesaria la purificación del ADN (Cornejo, et al. 2014).
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MÉTODOS

A) Verificación de la extracción de ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v

MATERIALES REACTIVOS 16

1 Balanza TBE 1X
1 Beaker 250 mL Agarosa en polvo
1 Vidrio reloj Buffer de carga
1 Microespátula Sybr Green
1 Probeta de 50 mL Marcador de peso molecular
Microondas Muestra de ADN
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Cinta de enmascarar
1 Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas
Trans iluminador UV

PROTOCOLOS

1. Tomar 0.4 gramos de agarosa y disolver en 40 mL de TBE 1X.

2. Calentar hasta disolver completamente y servir en la cámara de electroforesis. Colocar el peine para el
diseño de los pozos y dejar solidificar.
3. Mezclar y servir:

A. 5 µL del ADN (muestra) +1 µL de Buffer de carga 6X+ 1 µL de Sybr Green.

B. 1uL de marcador de peso molecular +1 µL de buffer de carga + 1 µL de Sybr Green.
C. Control positivo: ADN (verificado anteriormente) +1 µL buffer de carga +1 µL de Sybr Green.
D. Control negativo: 1uL de buffer de carga + 1uL de Sybr Green.

4. Conectar la fuente de poder y correr el gel a 100-110 V durante 1 hora.

5. Desmontar el gel y visualizar bajo luz UV.

B) Evaluación de la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría

MATERIALES REACTIVOS
Espectrofotómetro UV-VIS Agua MiliQ
Celdas de cuarzo Muestra de ADN
Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas
Micropipeta de 100-1000 µL con puntas
Calculadora
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PROTOCOLOS
1. En una celda adicionar 2 mL de agua MiliQ doblemente estéril.
2. Seleccionar en el espectrofotómetro el botón de Blanco.
3. Reemplazar 2 µL de agua por 2 µL de muestra de ADN (dilución 1000 veces) 17
4. Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm
5. Calcular:

Cantidad de ADN =
A260nm*50 ug/mL= ug/mL

Ejemplo:
Se tiene una dilución de ADN de 1:100 (Factor de dilución 1001) cuya absorbancia a 260 nm fue de 0.050.
Por lo tanto (0.050*100)* 50 ug/mL = 250 ug/mL = 0.25 g/uL = 250 ng/uL.

1
El factor de dilución del ADN dependerá de la intensidad de la banda observada en el gel de agarosa

Calidad de ADN=
A260nm⁄
A280nm = 1.8

Nota: Un valor obtenido de aproximadamente 1.8 es considerado puro para ADN y de aproximadamente 2
para ARN. Si es menor hay contaminación con proteínas, fenoles u otras sustancias que absorben en una
longitud de onda cercana a 280 nm.

A260nm⁄
A230nm = 2.0- 2.2

Nota: Se considera que el ADN es puro si se obtiene un valor de entre 2.0- 2.2. Si la relación es menor indica
la presencia de contaminantes que absorben a una longitud de onda de 230 nm (Thermo Scientific, ND)

INFORME
1. Calcular la cantidad y calidad del ADN extraído
2. Discutir acerca de la calidad de ADN, ¿Se observa contaminación y de qué tipo?
3. ¿Como podría disminuirse la contaminación del ADN por proteínas y carbohidratos?
4. ¿Qué otros métodos de cuantificación de ADN existen?
5. ¿Qué es el NanoDrop y en qué consiste?