Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Profesional de Biología

Informe de Practica n°7

Grupo n°10
PROGRAMA DE ESTUDIOS : Ciencias Biológicas
1ESCUELA PROFESIONAL : Ciencias Biológicas
ASIGNATURA : Bacteriología
SEMESTRE ACADÉMICO : 2021-I
CICLO DE ESTUDIOS: VII DOCENTE: Olga Francia Arana
Integrantes:
Bances Vergara Luis Manuel
Marlo Mio Espino
Guían Pierre Quintero
 Práctica N° 7: Aislamiento e identificación de los géneros Listeria y
Corynebacterium

Introducción

Las bacterias pertenecientes al género Listeria son bacilos gran positivos cortos, regulares,
no esporulados ni ramificados, que suelen observarse en disposición individual o formando
cadenas cortas. En cultivos viejos pueden aparecer formando filamentos de 6-20 mm de
longitud. Presentan de 1 a 5 flagelos peritricos que les confieren movilidad a 28ºC. Listeria
spp. son anaerobias facultativas, catalasa positiva y oxidasa negativa. Las reacciones de
Voges-Proskauer y rojo de metilo son positivas. Hidrolizan la esculina en pocas horas, pero
no la urea ni la gelatina; no producen indol ni SH2. Producen ácido de la D-glucosa y de
otros azúcares. Las especies de Corynebacterium conocidas como difteroides o bacterias
corineformes, son reconocidas por ser bacilos gram positivos, pleomórficos, inmóviles, no
esporulados, productoras de catalasa y formadoras de gránulos metacromáticos, algunas
aerobias exclusivas y en su mayoría anaerobias facultativas. Su identificación morfológica
se realiza mediante la tinción de Gram, en la cual se observan bacilos gram positivos
(algunos teñidos irregularmente), pleomórficos dado que algunos son rectos y otros
ligeramente curvados, con extremos cónicos o curvos. El presente informe de practica
incluye bacilos grampositivos patógenos que en la actualidad no son causantes comunes de
enfermedad humana. Su importancia médica radica en las lecciones que se aprendieron
cuando eran más comunes, y la amenaza continua que su existencia representa, la
diferenciación entre los géneros viene establecida por aspectos quimiotaxonómicos
(principales ácidos grasos celulares, ácidos micólicos, ácido diamino peptidoglicano y tipo
acil). Los ácidos micólicos, únicamente están presentes en la mayoría de las especies del
género Corynebacterium.

I.-Objetivos
 Aísla e identifica por lo menos una especie de Listeria y una especie de
Corynebacterium haciendo uso correcto de las técnicas de siembra, aislamiento e
identificación
II.-Materiales y Métodos
Aislamiento Género Listeria

Muestra Carne de pescado,

pollo, queso

Medio de cultivo:
agar Listeria

Agua peptonada al
0,1%,

Tubo o vial con agar

tripticasa soya

Jarra de Brewer Para cultivo en

anaerobiosis

Placas Petri estériles, Recipiente redondo, de

cristal o plástico.
Se emplea para cultivo y
aislamiento de
microorganismos.
 Asa bacteriológica Sirve para la siembra
por estrías e
inoculaciones en
general.

Aislamiento Género Corynebacterium

Muestra: secreción
nasofaríngea

1 placa petri con

medio Löffler (A.L.)

1 hisopo estéril,

Asa bacteriológica

1 tubo con agar suero-

telurito.

Identificación -Listeria monocytogenes

Agua oxigenada o Para la prueba de
peróxido de hidrógeno catalasa
(H2O2)

Una placa con agar Para ver hemólisis.

sangre

Batería de Gram Para realizar la tinción

Gram

Tubo con caldo manitol

Tubo con caldo hiputrato

Tubo con caldo xilosa

Tubo con caldo ramnosa

 Una placa con agar Para ver si hidroliza
almidón almidón

Identificación-Corynebacterium diphtheriae
Batería de Gram Para realizar la tinción
Gram

Agua oxigenada o Para la prueba de catalasa

peróxido de hidrógeno
(H2O2)

2 tubos con medio O - F

glucosa

1 tubo con caldo nitrato

1 tubo con caldo urea

 1 tubo con caldo arginina

1 tubo con medio

gelatina

1 tubo con caldo

glucosado para la prueba
de Voges - Proskawer

Tubos con caldo glucosa,

lactosa, sacarosa,
maltosa, manitol y xilosa

Metodología
Género Listeria
Enriquecimiento
 Preparar un homogenizado de la muestra con caldo de enriquecimiento de Listeria
utilizando 5 g de muestra con 45 ml de caldo.

 Incubar a 37 C° durante 24 horas

 Confirmar crecimiento con una tinción de
Gram
Aislamiento
 Sembrar una asada del cultivo líquido en la superficie del medio, agar Listeria
aplicando la técnica del estriado,

 Incubar la placa dentro de la jarra de Brewer en la estufa bacteriológica a 37 C° por

48 horas
 Evaluar el crecimiento: Observar colonias convexas, de borde entero, de 0,8 a 1,0
mm de diámetro, amarillas, brillantes.

 Hacer la tinción de Gram de las colonias características para observar morfología

bacilar y reacción tintorial
 Separar las colonias características a un tubo o vial con ATS para mantener la cepa
y proceder a su identificación.
Identificación
 Hacer una tinción de Gram de la colonia para observar los bacilos característicos

 Hacer la prueba de catalasa para confirmar la positividad

 Determinar la hemólisis en la placa de agar sangre

  Hacer las pruebas de fermentación de los carbohidratos: manitol, arabinosa, xilosa y
ramnosa y observar el viraje del indicador rojo de fenol a color amarillo si la prueba
es positiva

 Realizar las pruebas de reducción de los nitratos, de hidrólisis del hipurato y de

hidrólisis del almidón.

 Hacer las Pruebas de CAMP y de RM-V

Género Corynebacterium
Identificación:
 Hacer la Prueba de catalasa
  Sembrar en una placa con agar sangre para observar el tipo de hemólisis

 Hacer la Prueba de Oxidación - Fermentación (O -

F) de la glucosa

 Prueba de reducción del nitrato

 Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa,

manitol y xilosa y observar el viraje del indicador rojo de fenol
 Prueba de Voges - Proskawer (V - P)
 Prueba de ureasa
 Prueba de la gelatinasa.

Resultados
Tabla n°1
Genero Listeria
Pruebas bioquímicas Listeria monocytogenes
Prueba de Catalasa +
Hemólisis Beta Hemolisis
Fermentación de
carbohidratos
Manosa Positiva
Glucosa Positiva
Xilosa Negativa
Manitol Negativa
Rammosa Positiva
Lactosa Negativa
Sacarosa Negativa
Prueba de reducción de Negativa
nitratos
Hidrólisis hipurato Positiva
Hidrolisis de almidón Negativa
Test de CAMP Positiva
Prueba de Voges Positiva
Proskauer
Rojo de metilo Positiva
Nota. Resultados de las pruebas bioquímicas de Listeria monocytogenes

Tabla 2
Género Corynebacterium
Pruebas bioquímicas Corynebacterium
diphtheriae
Prueba de Catalasa Positiva
Hemolisis Negativa
Fermentación de
carbohidratos Negativa
Manosa
Glucosa Positiva
Xilosa Negativa
Manitol Negativa
Maltosa Positiva
Lactosa Negativa
Sacarosa Negativa
Prueba de (O - F) de la Negativa
glucosa
Prueba de reducción de Positiva
nitratos
 Prueba de Voges Positiva
Proskauer
Prueba de Ureasa Negativa
Prueba de Gelatinasa Negativa

Conclusiones
En esta práctica logramos aislar las 2 bacterias, pudiendo identificarlas realizando las
pruebas respectivas químicas a cada una de estas. Cada una siempre diferenciándose en
algunas pruebas de la otra. Las formas de colonias, color, tamaño, etc. Listeria pueden ser
aislada en el medioambiente y en diversos animales, patógenos y comensales.
Ambos tienen una evaluación de identificación de especies, en el caso de L.monocytogenes
es dependiente de la presencia de hemolisis y una reacción de CAMP positiva.

Referencias Bibliográficas

Hartemink, R., and F.M Rombouts. 1999. Comparison of media for the detection of
bifidobacteria, lactobacilli and total anaerobes from faecal samples. J. Microbiol
Spiegel, C.A. 1991. Bacterial vaginosis. Clin. Microbiol. Rev. 4
Crespo, M. D. P., Vélez, J. D., Castañeda, C., Hoyos, F., López, M. L., & Salazar, J. C.
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Colombia Medica, 30(2), 89–98.
Lecuit, M. (2007). Human listeriosis and animal models. Microbes and Infection, 9(10),
1216–1225. https:// doi.org/10.1016/j.micinf.2007.05.009
Downes, F.P., and K. Ito (eds.). 2001. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 4th edition. American Public Health Association (APHA)

Anexos
1. ¿Por qué se emplea medio Löffler para aislar Corynebacterium? Fundamente.
El medio de Loeffler se utiliza para el cultivo de Corynebacterium, debido al
contenido en suero, este medio se puede usar para la actividad proteolítica y la
 hidrólisis enzimática de proteínas. La superficie gris-blanca es un fondo excepcional
para la detección de la pigmentación del microorganismo.
La infusión de músculo corazón y el digerido peptídico de tejido animal
proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales para el
crecimiento de una variedad de microorganismos. La dextrosa es la fuente de
energía de carbono y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.
El suero bovino es una fuente adicional que proporciona factores de crecimiento
para los microorganismos y ayuda a determinar la actividad proteolítica.
Las colonias de Cornyebacterium aparecen de color crema con centros ligeramente
elevados. En la tinción con azul de metileno, las especies de Corynebacterium
forman gránulos metacromáticos. La proteólisis está indicada por la destrucción de
la integridad del medio coagulado.
2. ¿En qué otros medios podrían desarrollar Corynebacterium? ¿Fundamente?
Con respecto a los requerimientos nutricionales, todos ellos necesitan biotina para
su crecimiento y algunas cepas requieren además tiamina y ácido p-aminobenzoico
(PABA).
Agar suero de telurito es un medio selectivo y de diferenciación utilizado
principalmente para el aislamiento y la identificación de Corynebacterium
diphtheriae. Permite el crecimiento de todos los biovares de C. diphtheriae. El
extracto de carne y la peptona suministran nitrógeno y factores de crecimiento. El
cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico. El telurito potásico a la
concentración seleccionada inhibe las bacterias Gram negativas y diversas Gram
positivas y permite detectar la reducción de telurito, que se encuentra por lo general
(pero no exclusivamente) en las corinebacterias. La sangre de caballo lisada
proporciona nutrientes adicionales.
3.
3. ¿Corynebacterium produce hemolisinas solubles? Explique
No producen hemolisinas solubles, pero sobre medio sólido con sangre, puede ocurrir la
lisis de las células rojas que estén en contacto con la colonia.
En el caso de Corynebacterium diphtheriae, existen variedades y la variedad mitis produce
una hemólisis muy tenue.
1. Gravis: Colonias grandes, lisas y secas (rugosas). NO HEMOLITICAS
2. Mitis: Colonias medianas, elevadas y lisas. HEMOLITICA
3. Intermedius: Colonias pequeñas, elevadas y cortas. NO HEMOITICAS
4. Qué características hacen que Listeria sea considerada como un contaminante peligroso
de los quesos y otros alimentos?
La contaminación de los alimentos se produce debido a la capacidad que tiene L.
monocytogenes para adaptarse a una amplia variedad de nichos y condiciones. En este
sentido, la bacteria puede multiplicarse tanto a temperatura ambiente como en condiciones
de refrigeración, en pH extremo o incluso en concentraciones de alta salinidad, condiciones
comúnmente usadas para la conservación de alimentos frescos o procesados.
Productos crudos como leche y carne o productos procesados de origen animal, como los
derivados lácteos, se han encontrado contaminados con L. monocytogenes. Esta situación
se presenta debido a que los animales pueden portar la bacteria asintomáticamente y
contaminar los alimentos de origen animal durante el proceso de fabricación.
5. Cree Ud. ¿Que las pruebas utilizadas para la identificación de Listeria, son suficientes?
Explique
Sí, ya que nos permiten diferenciar de otros géneros. Otros investigadores realizan pruebas
complementarias como reducción de nitratos a nitritos (NIT), pirazinamidasa (PYZ),
pirrolidonil arilamidasa (PyrA), fosfatasa alcalina (PAL), βglucuronidasa (βGUR), β-
galactosidasa (βGAL), α-glucosidasa (αGLU), N-acetil-β glucosaminidasa (βNAG).
Por otro lado actualmente se está trabajando mucho con técnicas moleculares, donde a
través de la secuenciación de un fragmento de ADN se puede identificar el género
bacteriano y a través de genotipificación se determinan las variantes