Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento Académico de Microbiología y
Parasitología

Informe de Practica n° 6: Aislamiento e identificación de Lactobacillus

delbruechii y L. plantarum

ASIGNATURA: BACTERIOLOGIA
GRUPO N°: 10
ESTUDIANTES:
Bances Vergara Luis Manuel
Mio Espino Marlo Alexis
Quintero Caicedo Gian Pierre
DOCENTE: Olga Francia Arana
 Introducción
Las bacterias lácticas permanecen conformadas por un extenso conjunto de bacterias no
esporuladas, Gram positivas y que metabolizan un extenso rango de azúcares para
generar primordialmente ácido láctico. Debido al enorme conjunto de bacterias lácticas
únicamente son de interés los géneros enormemente productores de ácido láctico. Para
la producción industrial de ácido láctico son de más grande trascendencia las bacterias
lácticas homofermentativas, esas que únicamente generan ácido láctico.
Lactobacillus es un género de bacterias Grampositivas, facultativas o microaerófilos,
baciliforme, no productora de esporas.
La producción de ácido láctico provoca que su ambiente sea ácido, lo que inhibe el
incremento de bacterias patógenas.
Ciertos lactobacilos tienen un metabolismo homofermentativo (es mencionar, generan
solo ácido láctico partir de azúcares) y son aerotolerantes pese a la falta de cadena
respiratoria; otras especies además generan alcohol (son heteros fermentativas).
El género Lactobacillus está comprendida por bacterias en forma bacilar de 0,5 mm
x1,2 mm x 1,0 mm10,0 nm, habitualmente se asocian en cadenas cortas, son anaerobias
facultativas o microaerófilas, catalasa y citocromo negativos

Objetivos
 Aísla las cepas de lactobacilos de productos lácteos.
 Identificar las especies Lactobacillus delbruechii y L. plantarum mediante las
pruebas bioquímicas.
 Aplica correctamente las técnicas de aislamiento e identificación.

Materiales para Aislamiento

Muestra Leche fresca, quesos yogurt

caldo MRS Para el enriquecimiento

de lactobacilos, el citrato
de amonio actúa como
agente inhibitorio del
crecimiento de bacterias
Gram negativas.
 agar Medio selectivo usado para
Rogosa el recuento de lactobacilos
en carne, productos
alimenticios y muestras
biológicas.

Placas Petri Se emplea para cultivo y

estériles aislamiento de
microorganismos.

Asa Sirve para la siembra por

bacteriológi estrías e inoculaciones en
ca general.
Agua Proporciona nutrientes
peptonada necesarios para el
al 0,1%, desarrollo microbiano y el
cloruro de sodio mantiene
el balance osmótico.

Jarra de Para cultivo en anaerobiosis

Brewer

Materiales para la Identificacion

Batería de Gram Para tinción de Gram
Lámina y solución para prueba de catalasa
de peróxido de
hidrógeno

Tubo con caldo Para prueba de tolerancia a sal

MRS con NaCl 2%

Tubo con caldo Para prueba de tolerancia a sal

MRS con NaCl 4%

Tubo con caldo Para ver hidrólisis de arginina

MRS con 0,3% de con producción de amoníaco
arginina

Tubo con caldo Para observar fermentación de

MRS con 1% de carbohidratos
glucosa,lactosa,saca
rosa,manitol,arabin
osa
 Tubo con caldo Hidrolizan la esculina en unos
MRS con 1% de subproductos que reaccionan
esculina con el citrato férrico que
contiene el medio

Metodología
Enriquecimiento de Lactobacillus
 Transferir 1 ml. de la muestra a un tubo con 10 ml. de caldo MRS (si es líquida)
o pesar un gramo y llevar a un tubo con 10 ml de caldo MRS

 Homogenizar la muestra
 Incubar el tubo a 37 C° por 48 horas con una atmósfera de 5 % de CO2

 Confirmar crecimiento con

una Tinción de Gram
 Aislamiento
 Sembrar una asada del tubo de enriquecimiento en placa con agar ROGOSA
aplicando la técnica del agotamiento y estría

 Incubar la placa (colocada dentro de la jarra

de Brewer) en la estufa bacteriológica a 37 C por 48 horas

 Evaluar el crecimiento: colonias brillantes, convexas o lenticulares de 1 a 2

mm de diámetro
 Efectuar la tinción de Gram de las colonias características para observar la
morfología bacilar y reacción tintorial
  Repicar colonia característica a un tubo o vial con agar ROGOSA para
mantener la cepa y proceder a su identificación.

Pruebas de Identificación
 Prueba de catalasa. Observar que la prueba es negativa
 Prueba de resistencia térmica a 65 C por 30 minutos. Observar si hay
crecimiento
 Prueba de crecimiento a 45 C. Observar crecimiento de las cepas
 Prueba de tolerancia a la sal a las concentraciones de 2% y 4% de NaCl. Si
tolera hay crecimiento
 Prueba de fermentación de azúcares: glucosa, maltosa, lactosa, manitol y
arabinosa. Observar viraje del indicador a color amarillo si fermenta los
carbohidratos.
 Prueba de hidrólisis de arginina con producción de amoníaco. Si la prueba es
positiva se observa color rojo intenso.

Resultados

Pruebas bioquímicas L. delbruechii L. plantarum

Prueba de Catalasa (-) (-)
Prueba de resistencia (-) (-)
térmica
Prueba de Crecimiento a (+) (+)
45ºC
Prueba de tolerancia a la No hay crecimiento No hay crecimiento
sal a las concentraciones
de 2% y 4% de NaCl.
Prueba de fermentación Homofermentativos Homofermentativos
de azúcares obligados facultativos
Prueba de hidrólisis de (-)
arginina con producción (-)
de amoníaco.
Conclusiones

 Se pudieron aplicar correctamente las técnicas de aislamiento y de identificación

de las especies Lactobacillus delbruechii y L. plantarum
 Se logro identificar las especies Lactobacillus delbruechii y L. plantarum
mediante el uso de las pruebas bioquímicas

Anexos
Aguilar, L., Herrera, M. (2018). Determinación de la temperatura óptima de sacarificación
y fermentación láctica con lactobacillus Delbrueckii ssp bulgaricus para la
obtención de ácido láctico a partir de almidón de bituca (Colocasia esculenta)
[tesis de postgrado, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo]. Repositorio
Institucional. http://repositorio.unprg.edu.pe/bitstream/handle/UNPRG/2437/BC-
TES-TMP-1308.pdf?sequence=1&isAllowed=y

García, A., Mónica, A., García, M. (2016). Aislamiento, caracterización y determinación

del potencial probiótico de bacterias lácticas de pollos [tesis de licenciatura,
Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires]. Repositorio
Institucional.
https://www.ridaa.unicen.edu.ar/xmlui/bitstream/handle/123456789/733/GARCIA
%20FRANCO%2C%20ANTONELA.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Moreno, L. (2012). Aislamiento y Selección de Lactobacillus sp con potencial probiótico a

partir de pan de abejas [tesis de postgrado, Universidad Nacional de Colombia].
Repositorio Institucional. https://core.ac.uk/download/pdf/11057799.pdf

Rondón, A., Samaniego, L., Bocourt, R., Rodriguez, S., Milián, G., Ranilla, M., Laurencio,
M., y Pérez, M. (2008). Aislamiento, identificación y caracterización parcial de las
propiedades probióticas de cepas de Lactobacillus sp. procedentes del tracto
gastrointestinal de pollos de ceba, Cienc. Tecnol. Aliment., 6(1), 56-63.
https://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/11358120809487628
Cuestionario

 ¿Qué otros medios de cultivo se utilizan para el aislamiento primario de

lactobacilos.
Fundamente.
Raka-Ray, Base de Agar: Este medio se encuentra entre los que mejores
resultados han dado en la detección de Lactobacilos en la cerveza durante su
proceso de fermentación. Su uso fue recomendado por la Convención Cervecera
Europea. Los metabolitos que producen los Lactobacilos pueden alterar
sensiblemente el sabor del producto final y de aquí la importancia de su
detección. Por otra parte, como son gérmenes con requisitos nutricionales
complejos y de cultivo en atmósferas muy restringidas, se han ensayado muchas
formulaciones y maneras de incubar, y de todas ellas la que mejor resultados ha
 dado es la que corresponde a este medio. Por la presencia de la Cicloheximida se
inhibe el crecimiento de las levaduras. Por la adición del Feniletanol se inhiben
los gérmenes Gram-negativos. Los azúcares constituyen la fuente energética del
medio y el resto de los componentes son el grueso de los elementos
nutricionales.
Rogosa SL, Agar: Con la triptona y el extracto de levadura se aportan los
nutrientes, con el sorbitán monooletato se suministran los ácidos grasos
necesarios para el desarrollo de los Lactobacilos, con los azúcares se le da
contenido energético, con el di-Amonio Hidrógeno Citrato y el Sodio Acetato se
consigue la inhibición de la mayor parte de los gérmenes contaminantes y con
un ajuste del pH a 5,4 se potencia este efecto inhibidor.
Medio agar Sabouraud Glucosa y Maltosa (Lactobacillus casei ATCC 9595) En
estos medios la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de
lactobacillus, el carbohidrato (glucosa o maltosa) es la fuente energética. La
maltosa, cumple con los requerimientos nutritivos. El medio Agar Maltosa
Sabouraud también permite la diferenciación de lactobacilos en poblaciones
mixtas, ya que potencia la producción de piocianina. El Agar de Glucosa
Sabouraud corresponde a las recomendaciones de la USP y de la Ph. Eur.
WL, Agar diferncial se inhibe el crecimiento de levaduras permitiendo la
numeración de todas las bacterias (Lactobacillus fermentun ATCC 9338) que
tiene en cuenta la fermentación. Este último efecto se consigue en el medio
Diferencial al añadir cicloheximida como antibiótico. Según el tipo de proceso
fermentativo se deberá ajustar el pH del medio a determinados valores. El pH
5,5 es óptimo para la industria cervecera; si se realiza la numeración de
levaduras en panificación ajustar el pH a 6,5.
 ¿Por qué se emplea para el aislamiento primario Agar ROGOSA?
Debido a la presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio se aportan
los componentes nutritivos y energéticos para el crecimiento de los
Lactobacilos. El di-Amonio Hidrógeno Citrato inhibe el crecimiento de la mayor
parte de gérmenes contaminantes. El di-Potasio Hidrógeno Fosfato se emplea
para estabilizar el pH del medio, mientras que el Tween constituye su fuente de
ácidos grasos. De esta manera este medio es ideal para el crecimiento masivo de
todas las cepas de Lactobacilos, incluso aquellas de crecimiento lento y difícil.
El crecimiento también puede mejorarse reduciendo el pH hasta 5,5
aproximadamente, sin embargo, se dificulta la gelificación del medio.

 ¿Qué características le permite diferencias L. delbrueckii de L. plantarum

A diferencia de L.plantarum, el L.delbruckii para la industria de ácidos lácticos se
requiere ciertas condiciones: PH 5.0-5.8,un agente neutralizante como el carbonato de
calcio o la soda(si el nivel de ácido es láctico alcanza 1-2% del peso total, las bacterias
pueden morirse),la temperatura de requerimiento es de 25-32oC,tiempo de fermentación
42h.El medio consiste en 15% de glucosa,0.4% de maltosa germinada,0.25% de fosfato
di amónico y 10% de carbonato de calcio, no se esteriliza. Morfológicamente es un tubo
Gram+ que puede aparecer largo y filamentoso. Carece de movilidad y no forma espora.
Acidófila debido a que requiere un PH relativamente bajo para su crecimiento óptimo