Determinación de actividad Proteolítica

Marco teórico
Las proteasas son enzimas que hidrolizan o catalizan proteínas y péptidos largos
en moléculas más pequeñas o aminoácidos; difieren entre sí por sus propiedades
fisicoquímicas, especificidad de sustrato, pH, temperatura, sitio activo y mecanismo
catalítico. Existen diferentes fuentes de las cuales se obtienen proteasas tales como
animales o vegetales, pero los microorganismos tienen mayor uso debido a su fácil
manipulación y bajos costos.
De acuerdo al sitio de acción, las proteasas se clasifican en dos grandes grupos,
endoproteasas que atacan los enlaces peptídicos en la parte central de la cadena
peptídica, las exoproteasas actúan en el nitrógeno (N) y carbono (C) terminal de las
cadenas peptídicas dentro de las que se encuentran las amino y carboxiproteasas.
Las proteasas se encuentran dentro de las enzimas con mayores estudios y dentro
del mercado de enzimas representan cerca del 60% de la demanda, con ventas
mundiales alrededor de 300 y 600 millones de dólares anuales
Estas enzimas son de gran importancia en varios campos de la industria, como el
manejo de agua residuales, textiles, detergentes, procesamiento de comida (Kumar
& Takagi, 1999).

Medición cuantitativa de actividad proteolítica

Para la caracterización de actividad enzimáticas es necesario evaluar su actividad

en diferentes condiciones como pH, temperatura, presencia de cofactores entre
otros. En el área de la bioquímica existen diversas metodologías que permiten
cuantificar estas actividades. Muchas de estas pruebas se basan en la hidrolisis de
azocaiseina y albumina

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto
para su identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los
péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del
enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo
del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente
alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color
violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.
Al verse un cambio de color en el complejo que se forma entre el colorante y la
cantidad de azopeptidos liberados se puede hacer una medición de absorbancia,
para de esta manera correlacionar la cantidad de péptidos liberados con la actividad
enzimática.
Reactivos:

Sustratos: Caseína soluble al 1.5%(p/v).

Enzima: Proteinasa K obtenida de Tritirachium álbum [1μg/μL].
Acido Tricloroacetico (TCA) (Sigma) al 5%(p/v).
Colorante Folin & Ciocalteu (1 volumen de colorante por 16 volúmenes de agua
destilada).
Hidróxido de sodio (NaOH) 500mM.

Materiales
Puntas 100 – 1000 ul
Puntas 10 – 100 ul
Puntas 0,5 – 10 ul
Juego de Micropipetas
Ependors de 1,5 ml
Bloque de Calentamiento
Incubadora

Procedimiento

1. En tubos de microcentrífuga de 1.5mL agregar 200μL de caseína al

1.5%(p/v) al tubo marcado como Rx (Reacción)
2. Agregar 20μL de la enzima Proteinasa K del tubo marcado como Enzima
3. Incube esa solución a 45ºC por 30 minutos en el bloque de calentamiento
previamente calentado a 45ºC
4. Detener la reacción enzimática adicionando 200μL de TCA al 5%(p/v), del
tubo marcado como TSA.
5. Incubar los tubos a 4ºC por 10 minutos.
6. Centrifugar los tubos a 13000rpm por 5 minutos a 4ºC.
7. Recuperar 150μL y disponer en un tubo nuevo marcado como M (muestra)
8. Adicionar 300μL de NaOH 500mM al tubo Marcado como muestra.
9. Agitar por campaneo y agregar 90μL del colorante Folin & Ciocalteu por tub
10. Tomar 120 ul del tubo y poner en pozo de placa Eliza hacerlo por triplicado.
11. Equilibrar 15 minutos a temperatura ambiente.
12. Determinar la absorbancia de las muestras a 630nm mediante
espectrofotometría.

Análisis de los resultados

1. Establecieron los μmoles de tirosina liberadas empleando la curva estándar

de tirosina que se muestra en la figura 1.
 Figura 1. Curva estándar de Tirosina

2. Finalmente calcule la actividad enzimática definiendo lo siguiente:

una unidad de enzima (U) se define como la cantidad de enzima requerida
para liberar 1 μmol de tirosina por minuto por mililitro, bajo las condiciones
del ensayo dada por la siguiente formula:

*Nota: Tenga en cuenta que el volumen del extracto crudo es el

volumen empleado en la reacción enzimática.

Preguntas

1. ¿Cuáles fueron los valores de actividad enzimática que se obtuvieron?

2. Explique detalladamente los cálculos empleados para hallar la actividad
enzimática
3. ¿Qué diferencias encuentra en las activadas calculadas en base a la
temperatura, pH y cofactores?
4. Analicé los resultados obtenidos de actividad enzimática con la obtenida de
los otros grupos.

Bibliografía

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