UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO:
Estructura y función celular y tisular II
(2do. AÑO MEDICINA)

TEMA:
Práctica de laboratorio N° 5:
Cinética enzimática

DOCENTE COORDINADOR:
Dra. Julia Violeta Morín Garrido

DOCENTE RESPONSABLE:
Dr. Luis Antonio Rueda Avalos

ESTUDIANTE:
Román Navarro, Adriana del Pilar

GRUPO 12

Tercer ciclo
2023-1

2023
Piura – Perú
1. INTRODUCCIÓN
La cinética enzimática es una rama de la bioquímica que estudia el funcionamiento de las
enzimas, catalizadores biológicos que aceleran las reacciones químicas necesarias para la vida
de los seres vivos. El conocimiento de los procesos cinéticos que las enzimas realizan permite
entender y controlar mejor muchos fenómenos biológicos y fisiológicos, como la digestión de
alimentos o la síntesis de proteínas.
Uno de los conceptos más importantes de la cinética enzimática es la constante de Michaelis-
Menten, que describe la capacidad de una enzima para unirse a su sustrato y formar un complejo
enzima-sustrato que reacciona para producir productos. Estudiar la constante de Michaelis-
Menten permite, por ejemplo, conocer la concentración de sustrato necesaria para que la enzima
trabaje a su velocidad máxima o determinar cuánto se inhibe la actividad de la enzima ante un
exceso de sustrato.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Calcular la actividad enzimática y específica de la fosfatasa alcalina extraída de la mucosa
gástrica, que esta presenta cuando se le añade una determinada concentración de B-
glicerofosfato que será medida determinando la cantidad de fosfato que se libera por unidad de
tiempo
2.2. Objetivos específicos

Demostrar la actividad enzimática mediante la muestra preparada variando la cantidad

de sustrato y con el mismo concentrado de enzimas.
 Graficar la cinética de Michaelis Menten.
 Graficar la curva de Lineweaver Burke mediante los inversos de la variación de la
concentración de: sustrato y velocidad.
 Encontrar los resultados de manera gráfica y matemática de la cinética de Michaelis
Menten y la curva de Lineweaver Burke.
 Interpretar la actividad específica que se lleva a cabo.
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Cinética enzimática
La cinética enzimática es el estudio de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por
las enzimas y de los factores que influyen en su velocidad. Es un campo de gran importancia en
la biología y la bioquímica, ya que las enzimas son catalizadores clave en muchos procesos
biológicos, incluyendo la digestión de alimentos, la producción de energía y la replicación del
ADN. La constante de Michaelis-Menten es una de las herramientas más utilizadas en la
cinética enzimática, ya que permite determinar la rapidez con la que una enzima transforma su
sustrato y como se ve afectada por la concentración del sustrato. Este conocimiento puede ser
utilizado para comprender mejor cómo funcionan los procesos biológicos y para desarrollar
nuevos tratamientos médicos y procesos industriales más eficientes.
3.2. Cinética de Michaelis-Menten
La cinética de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas reacciones
enzimáticas y recibe su nombre en honor a Leonor Michaelis y Maude Menten. El modelo de
Michaelis-Menten es utilizado para analizar la cinética enzimática, y asume que la enzima y el
sustrato se unen para formar un complejo de enzima-sustrato, que luego se descompone en
productos. La velocidad máxima del proceso es limitada por la cantidad de enzima presente y la
 constante de Michaelis-Menten describe la afinidad de la enzima por su sustrato. Este modelo es
válido cuando la concentración de sustrato es mayor que la concentración de enzima. La
cinética de Michaelis-Menten es fundamental para la comprensión de los procesos bioquímicos
y tiene aplicaciones en la industria y la medicina.
3.3. Modelo de Lineweaver- Burk o diagramas de dobles recíprocos
El diagrama Lineweaver-Burk (o diagrama doble recíproco) es una herramienta que permite
calcular los parámetros Km y Vmax de una reacción enzimática a partir de datos
experimentales, mediante esta técnica podemos representar una función de Michaelis-Menten
como una línea recta y obtener los parámetros de forma sencilla.
Es una representación gráfica de la ecuación Lineweaver - Burk de la cinética enzimática,
descrita por primera vez por Hans Lineweaver y Dean Burk en 1934.
Es una forma lineal de la ecuación de Michaelis – Menten que se usa para determinar Km y
Vmax, la medición directa del valor numérico de Vmax y, por consiguiente, el cálculo de Km, a
menudo requiere concentraciones altas pocas prácticas de sustrato para alcanzar condiciones de
saturación. Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten evita esta dificultad y permite
extrapolar Vmax y Km desde de datos de velocidad inicial obtenidos a concentraciones de
sustrato menores que las que producen saturación.
4. MARCO PRÁCTICO
4.1. Materiales, equipos y reactivos
Materiales Equipos Reactivos
 Tubos de ensayo  Espectrofotómetro  Estándar de fósforo
 Gradilla  Agua destilada
 Pipeta automática  Molibdato
 Papel milimetrado  Solución reductora
 Glicerofosfato (75 umol/L)
 Buffer Veronal pH
 Enzima fosfatasa alcalina
 Tricloro acético al 10%

4.2. Procedimiento
Como se indica en el siguiente cuadro se prepara varias soluciones de fósforo de diferentes
concentraciones a partir de un Standard de 8 ug/ml, a los cuales se les agrega agua destilada,
molibdato y solución reductora, realizando las reacciones para la determinación del fósforo. Al
final todos los tubos deben tener el mismo volumen de 10mL.
Blanco (TUBO
TUBO 1 2 3 4 5
0)
Standard de Fósforo (P) 1mL (8ug de 2mL (16ug de 3mL (24ug de 4mL (32ug de 5mL (40ug de
0mL (0ug de P)
(8ug/ml) P) P) P) P) P)
H2O Destilada (ml) 5mL 4mL 3mL 2mL 1mL 0mL
Molibdato (ml) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
Solución Reductora (ml) 4mL 4mL 4mL 4mL 4mL 4mL
Volumen total 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL

4.3. Fundamento
El fósforo inorgánico reacciona con el molibdato de sodio formando un complejo amarillo de
fosfomolibdato de sodio. Este es reducido por el ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico, formándose
un complejo de color azul cuya intensidad medida a 660 nm es proporcional a la concentración
de fósforo presente. Para este caso usaremos el MÉTODO DE FISKE Y SUBOAROV
4.4. Metodología
1. Se rotulará 6 tubos de ensayo, correspondiente a Blanco, Tubo 1, Tubo 2, Tubo 3, Tubo
4, y Tubo 5
2. A cada uno de estos tubos rotulados, menos al tubo blanco, se les agrega una cantidad
proporcional de Estándar de fósforo (8ug/mL), correspondiendo: 1mL (8ug de fósforo)
al Tubo 1, 2mL (16ug de fósforo) al Tubo 2, 3mL (24ug de fósforo) al Tubo 3, 4mL
(32ug de fósforo) al tubo 4 y 5mL (40ug de fósforo) al tubo 5.
3. Se agregará agua destilada a cada tubo, menos al Tubo 5, correspondiendo: 5mL al tubo
Blanco, 4mL al Tubo 1, 3mL al Tubo 2, 2mL al tubo 3 y 1mL al Tubo 4. Llevando
todos los tubos a un mismo volumen de 5mL.
4. Agregar 1mL de Molibdato a todos los tubos. Este reaccionará con el fósforo
inorgánico formando un complejo amarillo de fosfomolibdato de sodio.
5. Agrega 4mL de Solución Reductora (ácido 1,2,4- aminonaftolsulfónico) a todos los
tubos. El fosfomolibdato de sodio es reducido por este reactivo, formándose un
complejo de color azul.
6. Mezclar y dejar en reposo 10 minutos.
7. Leer a 660 nm en el espectrofotómetro usando cubetas de 16 mm de diámetro contra el
blanco. Procure hacer las lecturas antes de los 20 minutos de haber mezclado.
8. Apuntar los resultados para graficar la curva de calibración.
9. Graficar en papel milimetrado absorbancia vs/concentración de fósforo expresada como
ug de fósforo/tubo.
4.5. Cálculos
Calcule la actividad específica en mg de proteínas de la preparación enzimática, si 2ml del
preparado enzimático contiene 0.0602 gr de proteínas.
Para poder obtener actividad específica, esta debe ser expresada en: mg proteína/ml
0.06 g de proteínas−−−−−2 ml
Y g de proteínas−−−−−1ml
Y =0.03 g de proteínas
En 1 ml de preparado enzimático obtendremos 30 mg de Proteínas
Estos micromoles de fósforo encontrado por minuto se encuentra en un extracto enzimático que
tiene 30 microgramos de fósforo, se tiene que hallar la concentración en micromoles de fósforo
por 1 mg de proteína. Para expresar la actividad enzimática en actividad especifica que significa
micromoles de fósforo por minuto por microgramo de proteína.

−4 milimoles P
13.787 ×10 −−−−−30 mg proteínas
mL∗min
milimoles P
X' −−−−−1 mg proteínas
mL∗min
milimol P
X ' =0.45957× 10− 4 . mg de proteína
mL∗min
 4.6. Interpretación
Durante el procedimiento de la curva de calibración, podemos observar que después de agregar
el molibdato a todos los tubos que contenían una concentración previa de estándar de fosforo y
agua destilada, este reacciona con el fosfato inorgánico, tornándose de un color amarillo, luego
con la sustancia reductora cada tubo cambia a color azul pero en diferentes intensidades. Esto
permite al espectrofotómetro determinar la absorbancia de cada tubo para posteriormente
dividirla con la concentración de fósforo para determinar el factor AB que nos indicaría en la
gráfica la concentración exacta de fósforo en todo su trayecto.
Se le agregó al tubo 4, la cantidad de 3.4mL (32 ug de fósforo) de estándar de fósforo. Además,
agua destilada 1 mL. El fósforo reacciona con el molibdato tornándose de color amarillo.
(fosfomolibdato de sodio)

 Para después agregar, 4 ml de solución reductora (ácido 1,2,4- aminonaftolsulfónico) a

todos los tubos, observando que el fosfomolibdato de sodio es reducido por este
reactivo, formándose así un complejo de color azul, el cual se intensificará de color
según sea la concentración de fosfomolibdato presente en el tubo
5. CONCLUSIONES

 Se determinó la cinética enzimática, con un procedimiento experimental realizado a la

fosfatasa alcalina en su reacción con el beta glicerofosfato para formar glicerol y fosfato
 Se ha logrado graficar correctamente la cinética de Michaelis Menten y de Lineweaver
Burke. Además de las relaciones entre cantidad de concentración de sustrato y
velocidad de reacción.
 Hemos aprendido a usar la velocidad máxima y el Km con sus respectivas unidades,
Vmax en micromoles, para poder hallar correctamente la actividad específica, después
comprendimos que a mayor purificación de la enzima entonces la velocidad necesita
mayor concentración de sustrato para poder realizar unas correctas gráficas
 Se comprendió la importancia de los factores que afectan la velocidad de la reacción ya
sea la temperatura, pH o concentración de sustratos, comprendiendo cómo estos
factores se dan con algunas sustancias del cuerpo humano.
6. CUESTIONARIO
1. ¿En qué se fundamenta la purificación de una enzima por Sephadex?
Su fundamento es parecido al de la cromatografía de filtración molecular, llamada también
cromatografía de exclusión molecular (también llamada filtración en gel o de tamiz molecular).
Esta es una de las técnicas más sencillas la cual se emplea en la separación de proteínas y ácidos
nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas, por el cual las
moléculas se separan en solución según su peso molecular y para el caso de las enzimas
sucederá igual.
Dichas columnas rellenas con algunos de los geles que pueden ser de varios tipos como:
dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida
(Bio-gel B), entre otros. Todos estos geles (fase estacionaria) se encuentran constituidos por
gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de
diámetro determinado.
En este caso el sephadex, nombre comercial de partículas de gel de dextrano, tiene una
capacidad separadora que reside en su matriz consta de un gran número de esferas porosas
microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros entrecruzados
unidas entre sí por enlaces químicos para formar una red tridimensional porosa. En
consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas enzimas
(las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente
pequeñas e iguales) podrán pasar libremente.
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio quedando
listo para su uso. En el interior de una columna de cromatografía se pueden distinguir varios
volúmenes.
a) El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado.
b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.
c) El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia entre los
dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.
Para la separación se utilizan las propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales
porosos. El proceso de separación depende del tamaño y el volumen hidrodinámico (volumen
que ocupa una molécula en solución), el cual define la capacidad de la molécula de penetrar o
no en los poros de la fase estacionaria.
1) Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que
componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha
pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt).
2) Las moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no
pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el
volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. Cuanto mayor es una
molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por
tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna
3) El resto de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad
para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas
fraccionadamente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo.
Concluyendo podemos señalar que las enzimas de mayor tamaño que los poros harán el camino
más corto, ya que nunca entran a la malla de la fase estacionaria. Cuanto menor es su tamaño,
mayor es la probabilidad de que entren a un poro y más largo el camino que seguirá dentro de la
malla de la fase estacionaria.
Por ello se puede afirmar que la purificación con esta sustancia se fundamenta en el tamaño
molecular de la enzima, consistiendo en la separación de moléculas de diferentes tamaños al
atravesar el gel colocado en una columna.
2. Si asumimos que la concentración de sustrato es saturante, ¿qué orden de reacción es el
que sigue el modelo expuesto? ¿Por qué?
Como ya sabemos, aumentando la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la
reacción o actividad enzimática, pero como nos dice que la concentración de sustrato es
saturante significa que cualquier aumento de sustrato no tendrá efecto alguno en la velocidad de
reacción, ya que las enzimas disponibles estarán saturadas y trabajando a su máxima capacidad.
Para entender el tipo de orden analizaremos en dos partes
1) Cuando [S] es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la
concentración de sustrato y por tanto, la reacción es de primer orden.
2) A altas [S], la enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no
depende de [S]. En otras palabras, lo que se quiere decir es que la concentración es tan
alta que el Km tiende a cero por eso es que si vemos la ecuación se podría omitir. En
este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).