UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Profesora: Luz Mery Buitrago A.
Práctica de laboratorio

EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ADN

INTRODUCCIÓN

COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se encuentran en las células
asociados con proteínas. Los complejos ácido nucleico –proteína se conocen con el nombre de núcleo-proteínas,
que pueden separarse en sus componentes (proteínas y ácidos nucleicos) al ser tratados con ácidos o con
concentraciones altas de sales. Las proteínas tienen carácter básico mientras que los ácidos nucleicos, como su
nombre lo indica son ácidos.

Por su composición química, se han clasificado en dos tipos: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico
(ARN). La hidrólisis controlada de ADN y de ARN produce nucleótidos, que pueden considerarse como unidades
básicas de los ácidos nucleicos; si se prosigue la hidrolisis, los nucleótidos dan nucleósidos (Fig. 1a) y finalmente
fosfatos, azúcares y bases purínicas y pirimidinícas (Fig. 1b).

Los nucleótidos que forman al ADN están constituidos por el azúcar 2′-desoxirribosa unido mediante enlace éster a
ácido fosfórico y mediante enlace N-glucosídico a una de las cuatro bases nitrogenadas (adenina, guanina, timina o
citosina).

Fig. 1 a) Estuctura del nucleótido y del nucleósido. Tomado de www.genomasur.com. b) Estructuras de las purinas y pirimidinas. Tomado de
Plummer, D. 1981.
Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster, entre las posiciones 3´ y 5´ de
los azúcares. El ADN está constituido por dos cadenas de polinucleótidos entrelazadas en forma de espiral y
estabilizadas mediante enlaces de hidrógeno entre determinados pares de bases. La mayoría de las moléculas del
ADN son hélices dobles; sin embargo, algunos virus contienen ADN de una sola cadena y el ADN mitocondrial es
una estructura cerrada en forma de bucle. Los nucleótidos del ADN forman una hélice constituida por dos hebras
antiparalelas que se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno (Fig. 2). Para empaquetarse, el ADN se une
a proteínas, denominadas histonas, formando nucleosomas; y cuando se quieren separar estos componentes, se
aplica tratamiento con ácidos o con concentraciones altas de sales.

Fig. 2 Estructura ADN. Imagen modificada de OpenStax, Biología. Fuente: www.es.khanacademy.org

La función del ADN es la de almacenar y transferir la información genética que conforma a un organismo y a su
descendencia. El genoma de un individuo comprende la totalidad de la información genética contenida en el ADN. El
ADN junto con los tres tipos de ARN (rARN, tARN y mARN) participa en la biosíntesis ordenada de los componentes
de la célula, codificando la expresión espacio temporal de las proteínas y respondiendo a los estímulos del medio
ambiente.

En la actualidad la Ingeniería Genética ha diseñado métodos para manipular los ácidos nucleicos aprovechando las
propiedades singulares, en particular, las del ADN. Existen asimismo, técnicas para su extracción a partir de
material vegetal y animal que permite visualizar las hebras de este ácido nucleico y reconocer su presencia con la
reacción de la difenilamina.

EXTRACCIÓN DE ADN

El procedimiento general de extracción de ácidos nucleicos consiste en cinco etapas principales: homogeneización
del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

Homogenización

La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la
interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético.

La homogeneización mecánica incluye el uso de: Nitrógeno líquido, pistilos que disgregan la muestra mediante
fricción con la pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material abrasivo
como vidrio pulverizado o resinas. En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en
solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las
uniones entre las células o que incluso pueden perforar la membrana celular. La disgregación química es
recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o sangre. En tejidos fibrosos es recomendable
cortar en fragmentos pequeños para favorecer su disgregación.

Lisis celular

La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra que se va a procesar. Mientras que en muestras como
sangre, células, ciertos tipos de tejidos o saliva puede alcanzarse una eficiente lisis celular en tiempos relativamente
cortos, en otros tipos de muestras como tejidos incluidos en parafina la lisis celular requiere un tratamiento previo
mucho más laborioso.

Durante la lisis celular se procede a la destrucción de las estructuras formadas por lípidos y proteínas permitiendo la
liberación de los ácidos nucleicos del núcleo celular. La lisis se lleva a cabo mediante una solución salina que suele
contener detergentes que desnaturalizan las proteínas y/o proteasas. Se utilizan también, soluciones básicas,
detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar
las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con
los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas. Los componentes celulares no solubles como el
material fibroso y proteínas que permanecen en solución se separan del ADN por centrifugación.

Separación de proteínas y lípidos

En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación.
Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las
proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por
centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y
el alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el
proceso de purificación.

Precipitación del ADN

Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y
soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla
reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo
insoluble. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es
desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por
evaporación.

IDENTIFICACIÓN DE ADN

La presencia del ADN se puede determinar empleando la reacción de la difenilamina, cuyo fundamento consiste en
que en solución acida el monosacárido desoxirribosa se vuelve altamente reactivo y reacciona con la difenilamina
para dar un complejo de color azul, reaccionando solo aquellos nucleótidos que contenga adenina o guanina.

Nota: Para la realización de esta prueba es necesario mantener el hígado en frío preferiblemente en hielo.

MATERIALES

 2 Morteros
 2 Tubos Falcon
 2 Pipetas Pasteur
 4 tubos de ensayo
 2 Pipetas graduadas (1 y 5 mL)
 1 Erlenmeyer
 2 Beacker (250 mL y 200 mL)
 1 Pipeteador
 1 Pinzas para tubo de ensayo
 1 vidrios de reloj
 1 Agitador
 1 gradilla

REACTIVOS

 100 mL solución de cloruro de sodio 0.1 Molar en EDTA 1x 10-4 Molar

 50 mL de solución de cloruro de sodio 0.14 Molar.
 230 mL de fenol al 90%
 150 mL de Éter
 150 mL de etanol
 50 mL de difenilamina (en frasco oscuro y en nevera)
 Hielo

EQUIPOS

 1 Centrífuga
 Agitador mecánico
 1 Baño serológico
 Plancha de calentamiento

GRUPOS DE TRABAJO

 20 g de Bazo de cerdo (preferiblemente) o hígado

 Bisturí
 Arena lavada
 Gasa * Individual

PROCEDIMIENTO:

1. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE ADN

Pesar 5 g de bazo de cerdo (o hígado), cortarlo en pedazos muy pequeños y transferirlos a un mortero que contenga
5 mL de cloruro de sodio 0,1 Molar y EDTA 1 x 10-4 Molar (el EDTA es un detergente que rompe las células) y arena
lavada. Macerar con el pistilo hasta obtener una pasta homogénea. Repartir el macerado en tubos de centrifuga
(cuidando de depositar igual cantidad de cada uno) y centrifugar durante 10 minutos.

Descartar el precipitado, tomar el sobrenadante y agregarle un volumen igual de fenol al 90% (el fenol tiene la
función de degradar las nucleoproteínas asociadas al ADN) y agitar la mezcla durante 20 minutos y centrifugar
durante 3 min.

Descartar el precipitado, tomar el sobrenadante y agregarle un volumen igual de fenol al 90%; agitar la mezcla
durante 10 minutos y centrifugar durante 3 min.

.
Separar el sobrenadante y añadirle un volumen igual de éter (con el fin de desengrasar), agitar durante 10 minutos;
centrifugue durante 3 min. y descarte el sobrenadante; tome el precipitado y agregue un volumen igual de etanol
(para precipitar el ADN). A medida que agrega el etanol agitar con una varilla de vidrio lavada en solución de cloruro
de sodio 0.14 Molar.

Reconocimiento de ADN

La presencia de ADN se puede determinar empleando la reacción de la difenilamina, cuyo fundamentos consiste en
que en solución ácida el monosacárido desoxirribosa se vuelve altamente reactiva y reacciona con la difenilamina
para dar un complejo de color azul, reaccionado solo aquellos nucleótidos que contenga adenina o guanina.

Realice lo indicado a continuación, de acuerdo a las instrucciones impartidas en el laboratorio: Añada a un

tubo 1 mL de ADN aislado y 3 mL de reactivo de difenilamina, caliente el tubo en baño de María de agua hirviendo
por 10 minutos: enfriar en hielo durante 5 minutos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Registre los resultados obtenidos para la prueba de aislamiento y caracterización de ADN.

BIBLIOGRAFÍA

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