PRÁCTICA

FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES

CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO

Comprobar la presencia de carbohidratos y ácidos nucleicos en tubérculos y

levaduras, respectivamente, utilizando reacciones específicas en cada caso.

FUNDAMENTO TEÓRICO

1. Carbohidratos:
Los constituyentes de los seres vivos son las biomoléculas. A ellas pertenecen los
carbohidratos, los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Los carbohidratos son
las biomoléculas más abundantes del planeta Tierra, debido a que están presentes
en los tejidos de sostén de diversos organismos. La quitina del exoesqueleto de los
insectos y los crustáceos, junto con la celulosa de la pared celular de las plantas, son
ejemplos representativos.

Además de su papel estructural, los carbohidratos desempeñan otras funciones al

ser fuente rápida de energía (glucosa), participar en procesos que se realizan en la
superficie de la célula (reconocimiento inmune), ser precursores de otras
biomoléculas (bases nitrogenadas, aminoácidos) y participar en numerosas rutas
metabólicas.

Los organismos fotosintéticos (algas y plantas) mediante el proceso de la

fotosíntesis convierten el dióxido de carbono en glucosa, la cual se polimeriza
formando almidón y celulosa.

Los carbohidratos se clasifican en simples y complejos. Los primeros, conocidos

como monosacáridos, presentan una única unidad monomérica. Los monosacáridos
son aldehídos polihidroxilados (aldosas) o cetonas polihidroxiladas (cetosas). Según
el número de átomos de carbono que posean pueden ser triosas, tetrosas, pentosas,
hexosas, etc. Por su parte, los carbohidratos complejos presentan más de una unidad
monomérica. A ellos pertenecen los disacáridos (lactosa, maltosa, sacarosa, etc.) y
polisacáridos (glucógeno, almidón, mureina, quitina, etc.).
Según sus propiedades químicas, los carbohidratos pueden ser diferenciados
mediante reacciones químicas específicas. Algunas de estas reacciones, las cuales se
realizarán en la práctica, incluyen:

Prueba de Lugol:
Los polisacáridos como el almidón (compuesto de amilosa y amilopectina), el
glucógeno y los dextranos, forman compuestos coloreados característicos cuando se
combinan con el yodo molecular presente en el reactivo de Lugol. La formación de
complejos de absorción entre el yodo y las cadenas helicoidales de los polisacáridos,
compuestas de al menos 8 monosacáridos, explica el desarrollo de la coloración.

Los polisacáridos que establecen estructuras helicoidales a lo largo de toda su

molécula, como la amilosa, generan coloración azul intensa. Aquellos polisacáridos
ramificados como la amilopectina, producen coloración azul menos intensa. Por su
parte, los polisacáridos altamente ramificados con segmentos cortos de
ramificación, como el glucógeno, generan coloración parda o rojiza.

Reacción de Molisch:
Los carbohidratos, tanto simples como complejos, al ser tratados con α-naftol y
ácido sulfúrico concentrado, producen coloración violeta. Dicha reacción,
denominada en honor del botánico austríaco Hans Molisch, se basa en la
deshidratación de los carbohidratos por acción del ácido sulfúrico, produciendo
derivados furfurales que se condensan con el α-naftol, resultando en la coloración
violeta característica. Al ser una reacción cualitativa, no permite determinar la
cantidad de carbohidratos presentes en las muestras analizadas.

Reacción de Benedict:
Los azúcares reductores (aquellos que presentan el grupo OH libre en su carbono
anomérico) al tratarlos con soluciones cúpricas en medio alcalino suave (citrato de
sodio-carbonato de sodio) reducen el ión cúprico (Cu2+) de color azul a ión cuproso
(Cu+), el cual precipita como óxido de cobre (Cu2O) de color naranja-ladrillo. El
medio alcalino favorece la forma lineal del azúcar, permitiendo que su grupo
aldehído reaccione con el ion cúprico.

2. Ácidos Nucleicos:
Los ácidos nucleicos son biomoléculas poliméricas compuestas de nucleótidos. Las
funciones de los ácidos nucleicos incluyen el almacenamiento, transmisión y
utilización de la información genética, esencial para el funcionamiento de todos los
seres vivos. El ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), son
los dos grupos en los que se clasifican estas biomoléculas.
Un nucleótido individual consta de tres partes: una base nitrogenada derivada de la
pirimidina o de la purina, una pentosa y un grupo fosfato. Las pentosas presentes en
el ADN y ARN se denominan desoxirribosa y ribosa, respectivamente.

El grupo fosfato del carbono 5’ de la pentosa de un nucleótido puede reaccionar con

el grupo OH del carbono 3’ de la pentosa de otro nucleótido, estableciendo un enlace
fosfodiéster. El dinucleótido resultante tendrá un grupo fosfato libre en el carbono 5’
de uno de los extremos y un grupo OH libre en el carbono 3’ del otro extremo. El
dinucleótido en cuestión podrá extenderse mediante la adición de nuevos
nucleótidos al grupo OH libre del carbono de la pentosa. Por esta razón los ácidos
nucleicos polimerizan en dirección 5’ - 3’.

La estructura tridimensional que asume el ADN y el ARN se explica por el principio

de complementariedad entre pares de bases, a través de puentes de hidrógeno. En el
ADN la adenina siempre se complementará con la timina (A=T), mientras que la
guanina siempre se complementará con la citosina (GΞC). En el ARN los pares de
bases que se pueden complementar serán GΞC y A=U (uracilo). La
complementariedad de bases se presenta entre cadenas de polinucleótidos
distintas, como sucede en el ADN, o entre la misma cadena, como puede ocurrir en
el ARN.

Las dos cadenas complementarias y antiparalelas del ADN exhiben la misma

longitud y establecen estructuras semejantes a una escalera. Los grupos fosfato y los
azúcares se organizan hacia el exterior de la estructura, mientras que las bases
nitrogenadas se disponen hacia el interior de la misma. La estructura resultante gira
en forma de hélice dextrógira, razón por la que ésta se designa como doble hélice de
ADN.

La presencia de ácidos nucleicos puede verificarse por medio de algunas pruebas

sencillas, las cuales se realizarán en la práctica:

Medidas espectrofotométricas:
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos son capaces de absorber luz UV. Por
esta razón es posible cuantificar ADN y ARN en un espectrofotómetro de manera
precisa, rápida y no destructiva. Las bases nitrogenadas de los nucleótidos
presentan un máximo de absorción a 260 nm, mientras que las proteínas, debido a
la presencia de aminoácidos aromáticos, absorben a 280 nm. La relación de
absorbancias a 260 y 280 nm es una medida de la pureza del ADN e indica lo
siguiente:

A260/A280 1.8-2 ADN puro

A260/A280 < 1.8 Contaminación con proteínas o sustancias aromáticas
A260/A280 > 2 Contaminación con ARN

Efecto Hipercrómico:
La desnaturalización térmica del ADN puede evaluarse por medición de su
absorción a 260 nm, la cual aumenta debido a la separación de las dos cadenas de
polinucleótidos por ruptura de los puentes de hidrógeno, exponiendo las bases
nitrogenadas a la interacción con la radiación incidente. Este fenómeno se denomina
Efecto Hipercrómico. Cuando el sistema se enfría rápidamente, las cadenas
permanecen separadas. Por el contrario, cuando la temperatura desciende
lentamente, las cadenas se re-asocian estableciendo de nuevo la doble hélice.

Reacción de Fiske-Subbarow (prueba para fosfatos):

Los grupos fosfato de los ácidos nucleicos en presencia de ácido molíbdico generan
fosfomolibdatos, los cuales son reducidos por el ácido ascórbico, produciendo
complejos de óxido de molibdeno de color azul.

REACTIVOS: Diligenciar la ficha de seguridad de todos los reactivos

subrayados

● Acetato de potasio 5 M
● Acido ascórbico 1 mg/mL, recién preparado
● Ácido molíbdico 20 mM
● Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado
● Buffer de extracción: Tris 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8.0
● Dodecil sulfato de sodio (SDS) 20% (P/V)
● HCl concentrado (37%)
● Isopropanol
● Patrón de almidón 2% (P/V)
● Patrón de glucosa 2% (P/V)
● Reactivo de Lugol
● Reactivo de Molisch, recién preparado
● Reactivo de Benedict
● Solución de citrato de sodio 1.5 mM-NaCl 15 mM

PROCEDIMIENTO

1. Obtención de carbohidratos:

Pelar y licuar una papa mediana con 200 mL de agua destilada. Proceder
rápidamente para evitar reacciones de oscurecimiento. Filtrar el licuado a través de
2 capas de gasa o papel filtro para eliminar el residuo sólido del tejido. Decantar 10
mL del filtrado durante 15 minutos, empleando un tubo Falcon de 50 mL. Eliminar
el sobrenadante y resuspender el precipitado (almidón) en 5 mL de agua destilada.
Marcar como M1.
2. Obtención de ácidos nucleicos:

Pesar 0.5 g de levadura y macerar en un mortero previamente enfriado hasta

obtener un polvo homogéneo. Adicionar 8 mL de buffer de extracción frío y macerar
de nuevo. Trasvasar la suspensión a un tubo Falcon de 15 mL y adicionar 0.5 mL de
SDS 20% (P/V), mezclar con agitación vigorosa por 2 minutos e incubar a 65ºC por
10 minutos. Adicionar 3 mL de acetato de potasio 5 M , agitar e incubar en baño de
hielo por 10 minutos. Centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos. Medir 0.3 mL del
sobrenadante obtenido y adicionarlo a un tubo de ensayo que contiene 3 mL de
isopropanol. Incubar la mezcla en baño de hielo por 15 minutos y centrifugar a 4500
rpm por 10 minutos. Resuspender el precipitado en 6 mL de solución de citrato de
sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM y filtrar si observa partículas en suspensión. Marcar
como Solución A.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

1. Prueba de Lugol (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y almidón):

colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo y adicionar 1
gota del reactivo de Lugol. Observar las coloraciones generadas.

2. Prueba de Lugol ácida (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y

almidón): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo,
adicionar 10 gotas de HCl concentrado e incubar en baño maría durante 15
minutos. Enfriar y agregar 1 gota del reactivo de Lugol. Observar las
coloraciones generadas.

3. Prueba de Molisch (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y

almidón):
colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 2
gotas del reactivo de Molish, mezclar y agregar cuidadosamente 1 mL (20
gotas) de H2SO4 concentrado, manteniendo los tubos inclinados. No agitar.
Observar el color del anillo formado en la interfase.

4. Prueba de Benedict (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y

almidón):
colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 10
gotas del reactivo de Benedict e incubar en baño maría durante 2 minutos.
Observar las coloraciones generadas y continuar incubando por 10 minutos
adicionales. Observar de nuevo los resultados finales.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. Medidas espectrofotométricas (Muestra a analizar: Solución A): registrar

la absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Emplear la solución de citrato
de sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM como blanco.
 2. Efecto Hipercrómico (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 3 mL de la
muestra en un tubo de ensayo e incubar en el termostato a 80ºC durante 10
minutos. Registrar inmediatamente la absorbancia de la muestra a 260 nm.
Emplear la solución de citrato de sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM como blanco.
Comparar los resultados obtenidos con aquellos de la prueba 1 (Medidas
espectrofotométricas).

3. Prueba para fosfatos (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 1 mL de la

muestra en un tubo de ensayo y agregar 10 gotas de ácido molíbdico. Agitar
y dejar en reposo por 3 minutos. Adicionar 10 gotas de ácido ascórbico,
mezclar e incubar en baño maría por 5 minutos. Observar la coloración
generada.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar la Bitácora de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (Se debe responder en el formato de informe de Laboratorio)

1. Escriba las reacciones químicas de las diferentes pruebas realizadas.

2. ¿Qué se requiere para que un carbohidrato tenga poder reductor? Explique.

3. ¿Por qué la sacarosa da prueba negativa con el reactivo de Benedict?

4. ¿Qué características químicas presentan las proteínas asociadas al ADN?

5. Defina temperatura de fusión (Tm) para el ADN y explique cómo se determina.

6. ¿Qué función cumple el EDTA, el SDS, el acetato de potasio y el isopropanol en la

extracción del ADN?

REFERENCIAS

López Rico E, Anzola Velasco C. Guías de Laboratorio de Bioquímica para la

Carrera de Química. 2ª edición. Colección Notas de Clase. Universidad Nacional de
Colombia. 2013. Bogotá, Colombia. Práctica 3 (Página 55)

Roche. Lab FAQs. Find a Quick Solution. 4th Edition. Roche Diagnostics GmbH. 2011.
Mannheim, Germany. Capítulo 1 (Página 8)

Sadava D, Hillis DM, Heller HC, Berenbaum MY. Life. The Science of Biology. 10th
edition. Sinauer Associates, Inc. 2014. MA, USA. Capítulos 3 y 4
PRÁCTICA 7: FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES
CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Complete las siguientes tablas:

Prueba Muestras Observaciones Resultado (+ o -)

M1

Lugol Patrón de glucosa

Patrón de almidón

M1

Lugol
Patrón de glucosa
ácida

Patrón de almidón

M1

Molisch Patrón de glucosa

Patrón de almidón

M1

Benedict Patrón de glucosa

Patrón de almidón

Datos obtenidos para las medidas espectrofotométricas de ácidos nucleicos.

Absorbancia Absorbancia
Muestra A260/A280
260 nm 280 nm
Solución A

Datos obtenidos para el Efecto Hipercrómico.

Muestra Absorbancia 260 nm
Solución A antes de calentar
Solución A después de calentar