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RESUMEN
El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy
diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura
de estos dos tipos de macromoléculas. El primer paso en la purificación del ADN por lo general consiste en
homogeneizar las células y aísla los núcleos de los cuales se extrae el ADN. El medio de extracción ordinario
contiene un detergente (SDS); a continuaciones le agrega solución de te para resuspender el ADN, luego los
ácidos nucleicos se precipitan añadiendo etanol .Para concluir el análisis de la extracción del ADN hay que
resaltar que e n este proceso ocurre una lisis celular lo cual significa que el ADN queda libre por consiguiente
hay que protegerlo de las enzimas porque estas podrían degradarlo .
INTRODUCCION
El ácido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células.
Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como
vehículo de su código genético.
Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a partir de tejidos
animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es producido por QIAGEN. Este usa tecnología avanzada de
membranas de silicato para purificar rápidamente DNA celular total sin usar extracciones orgánicas ni
precipitación con etanol.
El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los
cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve
para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El
detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.
El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y
proteínas.
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En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este
primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una
proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.
La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar
y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga
o conformación. Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo
positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a su cargas.
Los fragmentos de ADN lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente
proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo,
adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un
tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases. Entre los diferentes factores que afectan la
movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los
fragmentos está la concentración de agarosa.
La mayoría de los estudios de electroforesis son para comparar una secuencia conocida como el ADN
plásmido con una no conocida; El ADN plasmidico presenta tres líneas, circular abierta − lineal − circular
covalente cerrado.
MATERIALES
• Centrifuga
• Eppendorf 1.5 ml
• Tubos falcon de 12.5 ml
• Micropipetas y puntas desechables
• Pipetas de vidrio
• Colador
• Mortero y pistilo
• Hígado
• Cebada
• Cloruro de sodio
• Solución de etanol
• Isopropanol
• Detergente SDS
• Solución de lisis celular
• Agua destilada
• Vortex
• Hielo
• Vaso de precipitado
• Tubos eppendor
• Incubadora
• Agua destilada
• Agarosa
• RNAsa
• Buffer TAE
• Marcador de membrana.
• Cámara de electroforesis
• Bromuro de etidio
RPOCEDIMIENTO
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HIGADO
• Picar el hígado y Triturar el hígado con sal, solución de lisis y SDS hasta que la muestra quede
liquida.
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• Centrifugar por 20 minutos a 500 rpm.
• Almacenar a 4ºC.
• Dejar el tubo destapado para que se evapore el etanol, luego resuspender en solución de TE 200l.
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• Tomar 100l de la resuspensión y llevarlos a un eppendor.
CEBADA
• Macere las semillas de cebada, tamice el macerado eliminando residuos de las conchas de las semillas
y siga el procedimiento anterior.
• Preparar una solución al 0.8% de agarosa (4g de agarosa, 450ml de agua destilada y 50ml de buffer
TAE) con un volumen final de 500ml a una temperatura de 400ºC.
También se preparo la solución stop que contiene el fago hind III, y la solución del DNA plasmidico 12l.
RESULTADOS
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La solución del DNA obtenido se almacena a 4ºC para posteriores estudios.
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Al observar la electroforesis en gel de agarosa después de 2 horas, solo se desplazo la muestra numero uno y
el AND plasmidico.
ANALISIS DE RESULTADOS
Se debe tener en cuenta para posteriores extracciones de ADN que es importante utilizar todos los materiales
completamente esterilizados, porque puede alterar los análisis de la muestra.
Debido a que se mantuvo la muestra a una temperatura adecuada (4ºC), se evito que el ADN desnaturalizara.
Gracias al rápido proceso de maceración impedimos que las enzimas destruyeran el ADN.
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El procedimiento de extracción del ADN no se puede interrumpir ni prolongar pues el ADN con el tiempo se
va deteriorando.
El bromuro de etidio es el reactivo fundamental para la detección por tinción de fluorescencia y observación
bajo luz ultravioleta .
Al agregar inicialmente la solución de lisis no se logro una desintegración total de las células.
CUESTIONARIO
Con el NaCl conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
La acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos quedará
el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas, e inhibe cualquier actividad nucleasa presente en la
preparación.
• ¿Que otras técnicas son empleadas en biología molecular para la extracción del ADN?
− PCR
− Ultra centrifugación
− Espectrofotometría
BIBLIOGRAFIA
• Biología Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders., 1a edición.
Editorial
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• Trillas. México 1991: página 97, 98.
• http://pdf.rincondelvago.com/biologia−molecular_1.html