PRACTICA Nº 6

MEDICIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

OBJETIVOS:

 Efectuar una medida de las proteínas totales en suero de humanos.

 Interpretar los valores que se derivan de esta medición.
 Diferencias los distintos métodos de medición de proteínas totales.

MARCO TEORICO:

El examen de proteína total mide la cantidad total de dos clases de

proteínas encontradas en la porción líquida de la sangre: albúmina y
globulina.

Las proteínas son partes importantes de todas las células y tejidos.

La albúmina ayuda a impedir que se escape líquido fuera de los vasos
sanguíneos.
Las globulinas son una parte importante del sistema inmunitario.
Forma en que se realiza el examen
Se necesita una muestra de sangre. La mayoría de las veces, la sangre se
extrae de una vena localizada en la parte interior del codo o el dorso de la
mano.

Preparación para el examen

Muchos medicamentos pueden interferir con los resultados del examen de
sangre.

Razones por las que se realiza el examen

Este examen a menudo se hace para diagnosticar problemas nutricionales,
enfermedad renal o enfermedad hepática.

Si la proteína total es anormal, tendrá que hacerse más exámenes para

buscar la causa exacta del problema.

Resultados normales
El rango normal es de 6.0 a 8.3 gramos por decilitro (g/dL) o 60 a 83 g/L.
Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre
diferentes laboratorios. Hable con su proveedor acerca del significado de los
resultados específicos de su examen.
INTRODUCCIÓN:

La muestra que más se usa para determinar la proteína total es suero y no

plasma. No es necesario recolectarla cuando el paciente está en ayuno,
aunque en algunos de los métodos ocurren interferencias con la presencia
de lipemia. La hemolisis elevara falsamente el resultado de proteína total
debido a la liberación de proteínas de eritrocitos en el suero. Las muestras
de suero claras, bien cerradas, son estables durante una semana o más a
temperatura ambiente, por un mes a 2 a 4°C, y durante por lo menos dos
meses a -20°C.31 El intervalo de referencia para la proteína total sérica es
6.5 a 8.3 g/dl (65 a 83 g/L) para adultos ambulatorios. En posición de
recostado, la concentración de proteína total sérica es
6.0 a 7.8 g/dl (60 a 78 g/L). Este intervalo normal inferior es un resultado de
cambios en la distribución de agua en los compartimientos extracelulares.
La concentración de proteína total es baja al nacer, y las concentraciones de
adulto se alcanzan a la edad de 3 años. Hay una disminución ligera con la
edad. Las concentraciones de proteína total más bajas se observan en el
embarazo.

Kjeldhal. El método clásico para la cuantificación de proteína total es el

método de Kjeldahl. Debido a que es preciso y exacto, se emplea como un
estándar mediante el cual se comparan otros métodos.

Refractometria. La refractometria es útil cuando se requiere un método

rápido que requiere un pequeño volumen de suero. La velocidad de la luz
cambia cuando pasa el límite entre las dos capas transparentes (es decir,
aire y agua), lo cual causa que la luz se curve (refracte). Cuando se añade
un soluto al agua, el índice de refracción a 20°C de 1.330 para agua pura se
incrementa en una cantidad proporcional a la concentración de soluto en la
disolución. Esta proporcionalidad se cumple bastante bien en un incremento
de concentración de 2 a 3 (es decir, de 520 g/dl).

Biuret. El procedimiento de biuret es el método más utilizado y el que

recomienda el grupo de expertos de la International Federation o j Clinical
Chemistry para la determinación de proteína total. En esta reacción, los
iones cúpricos (Cu2+) forman complejos con los grupos que intervienen en
el enlace peptídico. En un medio alcalino y en presencia de por lo menos
dos enlaces peptídicos, se forma un quelato de color violeta. El reactivo
también contiene tartrato de potasio sódico para acomplejar los iones
cúpricos a fin de evitar su precipitación en la disolución alcalina, e ioduro de
potasio, que actúa como un antioxidante. La absorbancia del quelato
coloreado formado se mide a 540 nm. Cuando reaccionan los péptidos
pequeños, el color del quelato producido tiene tono diferente al que se
observa con los péptidos más grandes. El color varía de rosa a violeta
rojizo. Sin embargo, no hay diferencia discernible en la reacción dada por
las proteínas vistas de forma normal en el plasma. Por tanto, en un amplio
intervalo de concentraciones el color que se forma es proporcional al
número de enlaces peptídicos presentes y refleja la concentración de
proteína total. Sin embargo, en presencia de proteínas anormalmente
pequeñas, como las vistas en el mieloma múltiple, la concentración de la
 proteína se subestimaría debido al tono de color más ligero producido. Si se
debe analizar suero lipemico, existe una manera de superar este problema.

Además del grupo NHCO que se presenta en el enlace peptídico, los iones
cúpricos reaccionaran con cualquier compuesto que tiene dos o más de los
siguientes grupos: NHCEI2 y NHCS. El método se nombró porque una
sustancia llamada biuret (NbflCONHCONH) reacciona con iones cúpricos de
la misma manera. Debe haber un mínimo de dos de los grupos reactivos;
por tanto, los aminoácidos y los di péptidos no reaccionaran. Enlace de
colorante. Los métodos de enlace de colorante se basan en la capacidad de
la mayor parte de las proteínas del suero para unirse con colorantes,
aunque podría variar la afinidad con la que se enlazan. Los colorantes azul
de bromofenol, Ponceau S, negro de amido 10B, verde de lisamina y azul
brillante de Coomassie se han empleado para teñir bandas de proteína
después de la electroforesis. Además, se ha descrito un metodo de enlace
de colorante para la determinación de proteína total con el azul brillante de
Coomassie 250. El enlace de azul brillante de Coomassie 250 a proteína
ocasiona un cambio en la absorbancia máxima del colorante de 465 a 595
nm. El incremento de absorbancia a 595 nm se emplea para determinar la
concentración de proteína. Aunque el método es simple y rápido, las
respuestas de enlace de colorante desiguales de cada una de las proteínas
ha motivado una recomendación para tener precaución cuando se aplica
esta prueba a la mezcla compleja de proteína encontrada en el suero.

Absorción ultravioleta. Las proteínas séricas también han sido estimadas

mediante espectrofotometría ultravioleta. Las proteínas absorben luz a 280 y
a 210 nm. La absortividad (absorbancia de una disolución de 1% en una
trayectoria de luz de 1 cm) a 280 nm se relaciona con la absorbancia de la
tirosina, triptófano y aminoácidos de fenilalanina en la proteína. La albumina
humana tiene solo un residuo de triptófano en la molécula y una
absortividad de 5.31 comparada con el fibrinogeno, que tiene 55 residuos de
triptófano y una absortividad de 15.1.

La absorbancia de las proteínas a 210 nm es un resultado de la absorbancia

del enlace peptídico a esa longitud de onda. La longitud de onda a la cual
ocurre la absorbancia máxima depende en menor grado de la conformación
de la proteína. Estos métodos han sido empleados rara vez en laboratorios
clínicos para monitorear eluatos de separaciones de proteína de columnas.
Para usar estos métodos, las suposiciones deben ser que la composición de
la muestra de suero desconocido este cerca de la correspondiente a la
disolución de calibración.

MATERIALES:

 Kit de transaminasas.
 Espectrofotómetro
 Equipo de extracción de muestra sanguínea
 Baño maría
 Centrifuga
PROCEDIMIENTO:

El texto es solo una referencia deberá seguir los pasos del inserto de la
respectiva marca de kit que se use)

Resumen y Principio
La moléculas de proteínas contienen un largo número de péptidos unidos.
Cuando se tratan con iones de cobre (Cu+2) en solución alcalina, se forma
un complejo coloreado entre el Cobre y el Carbonil y grupos aminos de
estos péptidos. Una reacción igual ocurre con el
Biuret. (Los compuestos simples formados por el simple calentamiento de
urea). De donde fue adoptado el término de "Reacción de Biuret". El método
descrito está basado en los reportes de Weischselbaum y Gornal et al. El
color violeta desarrollado es proporcional al número de uniones peptídicas
de la proteína y relativamente independiente de la concentración de
Albumina y Globulina.

Reactivos
Reactivo de Proteinas Totales LiquiColor®,
Solución de Sulfato de Cobre pentahidratado 0.3 g/dL, en solución de
Hidroxido de Sodio 0.9 g/dL. También contiene Ioduro de Potasio y Tartrato
de Sodio y Potasio.
Estándar de Proteínas Totales (10 g/dL)
Solución acuosa de Albumina Bovina Fracción V, con azida de sodio como
preservativo. Precauciones: Para uso do diagnóstico in vitro. El estándar
contiene azida de sodio como preservativo, puede reaccionar con el cobre y
formar metales explosivos en las cañeria, eliminar con mucha agua
corriente.
Preparación del Reactivo: El reactivo y el estándar están listos para su
usarse. Estabilidad y Almacenamiento del Reactivo: El equipo de
Proteínas Totales es estable a 2-8°C hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta. El reactivo es estable a 2-30°C. Conservar el estándar a 2-
8°C.
Materiales Requeridos Pero No Incluidos
 Espectrofotómetro capaz de leer absorbancias a 550 nm
 Pipetas con divisiones exactas
 Tubos para prueba y cronómetro
 Celdillas
 Vortex
Recolección y Preparación de la Muestra
Separe cuidadosamente el suero del coagulo para evitar la hemólisis. No
usar plasma, el fibrinógeno puede incrementar los resultados.
Estabilidad de la Muestra: Las proteínas Totales en suero está reportada
estable por 1 semana a temperatura ambiente y por 30 días a 2-8°C.

Procedimiento Manual
Pipetea en celdillas perfectamente marcadas lo siguiente: Volúmenes (mL) y
mezcle bién.

Muestra (U) Estándar (S) Reactivo blanco (RB)

Reactivo 1.0 1.0 1.0
Muestra 0.01 --- ---
Estándar ---- 0.01 ---
NOTA: Para instrumentos que requieran más de 1.0 mL el reactivo y la
muestra pueden usarse al doble.

Dejar los tubos incubar por lo menos 5 minutos.

 ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO:

ABS PT a 540 nm
  CALCULO DE LOS RESULTADOS
 ABSORBANCIA: 0,294
 BLANCO: 0,02
 FACTOR: 25,65

RESULTADOS:

El rango normal es de 6.0 a 8.3 gramos por decilitro (g/dL) o 60 a 83 g/L.

Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre

diferentes laboratorios. Hable con su proveedor acerca del significado de los
resultados específicos de su examen.

El resultado del análisis nos indica que se encuentra en los valores

normales proteicos.

DISCUSION DE RESULTADOS
Hemos determinado las proteínas totales en la muestra analizada, lo cual
nos indica un valor normal. Sin embargo, como este podría ser un resultado
objetivo, es decir no podría decirnos con exactitud la patología, pero podría
darnos indicios de por donde se localiza el problema y asi hacer estudios
mas especializados.

CONCLUSIONES:

En conclusión, el conocimiento y la mecánica de esta práctica nos ayudan a

poder entender el análisis cuantitativa de diversos compuestos de nuestro
organismo, en este caso de proteínas totales, lo que nos ayuda a poder dar
un posible diagnóstico a diferentes patologías o deniveles en sangre.

CUESTIONARIO:

 Describa que indique valores normales, altos y bajos de proteínas totales:

En el plasma, las proteínas contribuyen a mantener el volumen del fluido

circulante, transportan sustancias relativamente insolubles y actúan en la
inactivación de compuestos tóxicos y en la defensa contra agentes invasores. La
determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios
ocasionados por diversos estados de enfermedad.

En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones

prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que, en otras
 como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentración de diversos
orígenes, (ej.: deshidratación) se observan hiperproteinemias.

 Describa otros métodos de medición de proteínas existen.

ENSAYO ABSOR MECANISMO LÍMITE DE VENTAJAS DESVENTAJAS

CIÓN DETECCIÓ
N
absorció 280 nm absorción de 0.1-100 pequeño incompatible
n UV tirosina y ug/ml volumen de con detergentes 
triptófano muestra, rápido, y agentes
económico desnaturalizante
s, alta
variabilidad
ácido 562 nm reducción de 20-2000 compatible con compatibilidad
bicinconí cobre (Cu2+ a ug/ml detergentes y con agentes
nico Cu1+), Reacción agentes reductores baja
del BCA con desnaturalizante o nula
Cu1+ s, baja
variabilidad
Bradford 470 nm formación de 20-2000 compatible con incompatible con
o azul complejo entre el ug/ml agentes detergentes
brillante colorante azul reductores,
de brillante de rápido
Coomass Coomassie y las
ie proteínas
Lowry 750 nm reducción de 10-1000 alta sensibilidad incompatible con
cobre por ug/ml y precisión detergentes y
proteínas, agentes
reducción de reductores,
Folin Ciocalteu procedimiento
por el complejo largo
de cobre con
proteína

 ¿Cuáles son los valores normales y los parámetros de las proteínas

totales?

Proteína total: 6.4 a 8.3 gramos por decilitro (g/dL) o 64 a 83 gramos por litro
(g/L)

 ¿Qué patologías pueden indicar niveles altos de proteínas?

 Los niveles superiores a los niveles normales pueden deberse a:

 Aumento en la producción de anticuerpos en algunas enfermedades infecciosas;

 Cáncer, principalmente en el mieloma múltiple y en la macroglobulinemia;
 Enfermedades autoinmunes, como artritis reumatoide y lupus eritematoso
sistémico,
 Enfermedades granulomatosas;
 Deshidratación, debido a que el plasma sanguíneo se concentra más;
 Hepatitis B, C y autoinmune;
 Amiloidosis, que consiste en la acumulación proteica anormal en diversos
órganos y tejidos celulares.

 ¿Qué patologías pueden indicar niveles bajos de proteínas?

Los niveles inferiores a los normales pueden deberse a:

 Alcoholismo crónico
 Enfermedades hepáticas, que perjudican la producción de albúmina y de
globulina en el hígado
 Enfermedades renales, debido a la pérdida de proteínas en la orina
 Exceso de hidratación
 Cirrosis
 Hipertiroidismo
 Deficiencia de calcio y vitamina D
 Insuficiencia cardíaca
 Síndrome de malabsorción

 BIBLIOGRAFÍA:

 Bishop Michael (2007) QUÍMICA CLÍNICA PRINCIPIOS

PROCEDIMIENTOS Y
CORRELACIONES. Editorial Mc Graw Hill. 4ª edición.
 D’Ocon Carmen (2005) FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS
BIOQUÍMICO.
Editorial Thomson – Paraninfo. España.
 Kaplan Pesce (1986) QUÍMICA CLÍNICA TEORÍA, ANÁLISIS
CORRELACIÓN. Ed
Médica Panamericana.
 Sherma Joseph (2003) HANDBOOK OF THIN – LAYER
CHROMATOGRAPHY. Ed
Marcel Dekker. New York.
 Jahnke Richard (2008) ENSAYOS DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
VOLUMEN II. Ed GPHF – Minilab. Alemania.