TEMA 4:

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Purificación de biomoléculas.
El trabajo en bioquímica implica la purificación de biomoléculas.
• El primer paso es la elección del material de partida.
• A continuación suele ser necesario romper células y tejidos biológicos (homogeneizar
las muestras).
• Las muestras biológicas deben estar estabilizadas, necesitamos una disolución
tampón (pH y fuerza iónica controlados, evitar degradación de proteínas...).
• En estas condiciones se aplican técnicas de separación.

Técnicas de separación de proteínas.

o Basadas en su solubilidad
o Cromatografía
o Electroforesis
o Centrifugación

• Técnicas de separación de proteínas basadas en su solubilidad.

Son tres: precipitación por salado, por punto isoeléctrico y con disolventes orgánicos.

1. Precipitación por salado.

Vamos incrementando la concentración de sal. Medimos la solubilidad de las proteínas
para cada una de las distintas concentraciones de sal que vamos a ir teniendo.
Podemos observar que la fuerza iónica afecta a la solubilidad de las proteínas de
manera bifásica, hay un comportamiento bifásico.
¿Qué significa esto?
- A bajas concentraciones de sal (cuando la concentración iónica es baja, porque
al haber poca sal, hay pocos iones de la sal), a medida que aumenta la
concentración de sal, aumenta la solubilidad de las proteínas. Es lo que se
conoce como “salting in”.
- Hay un momento (una concentración específica de sal) en el que se alcanza la
solubilidad óptima.
- Una vez que se alcanza este punto y se sigue añadiendo sal (cuando la fuerza
iónica es alta), al aumentar la cantidad de sal, disminuye la solubilidad. Es lo que
se conoce como “salting out”.
Por esto mismo tiene comportamiento
bifásico (ocurre lo contrario en ambos
procesos, aunque en los dos estemos
haciendo lo mismo: añadir sal).
Veamos que ocurre con las proteínas en cada proceso:
• Salting in (solubilización por salado): cuando hay poca
concentración de sal, hay pocos iones de la sal, por lo que
las proteínas tienen poca carga, se ven atraídas y se
agregan y precipitan (al haber pocos iones salinos, las
proteínas tienen pocas cargas a las que unirse, y hay una
gran atracción entre ellas, se unen).
• En el punto óptimo: los iones de la sal se encuentran en la
misma proporción que las cargas de las proteínas, por lo que
los iones “anulan” las cargas de las proteínas, uniéndose a
ellas.
De esta forma, se forma una atmósfera iónica alrededor de las
proteínas, por los elementos de cargas opuestas, que se
atraen y se unen. Esta atmósfera iónica impide interacciones
macromoleculares directas, por lo que las proteínas se
mantienen en solución, no se unen.
• Salting out: un exceso de iones salinos “secuestra” el H2O de
solvatación y las proteínas se agregan y precipitan. Es decir,
cuando aumenta mucho la concentración de sal, los iones de
la sal compiten con las proteínas por el agua de solvatación;
como hay poca agua, las proteínas se quedan sin agua, y se
juntan y precipitan.

Precipitación fraccionada de proteínas:

Las proteínas están formadas por distintos residuos hidrofílicos, por lo que tienen
distinta composición. Lo cual hace que cada proteína precipite a una distinta
concentración de sal. De esta forma, este es un método perfecto para separar proteínas
y poder estudiarlas posteriormente. Es lo que se conoce como precipitación fraccionada
de proteínas.
§ A mayor número de residuos polares, hidrofílicos, en la superficie de la proteína
mayor concentración de sulfato amónico necesitará para precipitar.
 2. Precipitación por punto isoeléctrico.
La solubilidad de las proteínas también depende del pH.
Existe un mínimo de solubilidad de las proteínas cuando pH = pI.

- Cuando el pH del medio coincide con el punto isoeléctrico de la

proteína, la carga neta de ésta es 0 (se igualan las cargas positivas
y las negativas), por lo que las proteínas tienden a pegarse y
precipitar.
- A pH por encima del pto isoeléctrico la carga de la proteína es
negativa. Al tener todas las proteínas la misma carga, hay una repulsión
electroestática, lo que las mantiene en solución (sin precipitar).
- A pH por debajo del pto isoeléctrico la carga es positiva. Al tener todas las
proteínas cargas positivas, hay una repulsión, por lo que se mantienen en
solución (sin precipitar).

3. Precipitación con disolventes orgánicos.

Disminuyendo la constante dieléctrica del medio podemos precipitar proteínas.
Disolventes orgánicos miscibles (que pueden mezclarse homogéneamente) con el
agua, como acetona o etanol, provocan la precipitación de las proteínas debido a
su baja constante dieléctrica (D).

Esta técnica es conveniente utilizarla a bajas temperaturas (0-4oC) (a temperaturas de

25-37oC se pueden desnaturalizar las proteínas)

Podemos hacer que precipiten las proteínas añadiendo un disolvente orgánico.

Utilizamos esta técnica cuando queremos tener las proteínas concentradas, ya que hace
que precipiten TODAS las proteínas (por eso no sirve para separarlas, sino para
concentrarlas).
El disolvente orgánico tiene una constante dieléctrica muy baja, por lo que la fuerza de
atracción entre cargas opuestas es muy grande (como podemos ver en la ecuación:
cuanto más grande la D, menor es la F, porque se está dividiendo entre un número muy
grande), haciendo que precipiten (pues se unen por la atracción de cargas opuestas).
[Sin embargo, en el agua, al tener una constante dieléctrica muy alta, la atracción entre
cargas opuestas es muy pequeña, por lo que no precipitan].
 • Cromatografía.
Todas las técnicas cromatografías se basan en el distinto reparto de las moléculas a
separar entre dos fases: una fase móvil (el disolvente) y otra estacionaria (el soporte
utilizado: papel, columna…). Podemos clasificarlas:
Según el soporte utilizado:
• Cromatografía en papel
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía en columna…
Según el criterio de separación:
• Reparto: hidrofobicidad (aminoácidos, otras biomoléculas); se hace en papel.
• Intercambio iónico: carga (proteínas); se hace en columna.
• Filtración molecular: tamaño (proteínas).
• Afinidad (proteínas): afinidad que tienen las proteínas a unirse a un ligando
determinado.

Cromatografía de reparto en papel.

El soporte cromatográfico es un papel derivado de la celulosa. La celulosa
está hidratada y constituye la fase estacionaria (es polar). La fase móvil es
un disolvente orgánico (apolar) que asciende por capilaridad.
Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria
líquida en función de su solubilidad en ella.
Los más polares tienden a quedar retenidos en la fase acuosa estacionaria,
ascendiendo más lentamente por el papel. Los más hidrofóbicos se
disuelven en la fase orgánica apolar y ascienden más rápidamente por el
papel (al ser la fase móvil un disolvente orgánico, es apolar, por lo que los
componentes hidrofóbicos, apolares, ascienden mas rápido).

Cromatografía en columna.
Introduces la fase estacionaria: una matriz sólida porosa, la empaquetas en el interior
de la columna, a través de la cual se moverá la mezcla de proteínas (la cual pones arriba
de la columna). Haces pasar una disolución tamponada gota a gota, y va arrastrando a
los componentes de la muestra (la mezcla), y se irán separando (en función de su
intercambio iónico, filtración, afinidad…).
Cromatografía de intercambio iónico.
A la matriz se unen cargas.
Si la matriz está cargada positivamente, las proteínas de carga negativa se quedarán, el
resto (las de carga positiva y las de carga neta) bajarán.
Si la matriz está cargada negativamente las proteínas de carga positiva se quedarán, y el
resto (las de carga negativa y las de carga neta) bajarán.
Lo que nos interesa es que la matriz tenga carga opuesta a la de la proteína que quiero
separar, pues queremos que se quede retenida, el resto (de la otra carga y de carga
neta) salen a la vez.
Aunque con esta técnica no conseguimos
separar bien del todo, para ello debemos llevar
acabo el proceso de elución.

Elución:
Para luego conseguir separarla bien del todo, eluyes (eluir: extraer, mediante un líquido
apropiado, una sustancia del medio sólido que la ha absorbido) a las proteínas retenidas (las que
tienen la misma carga, opuesta a la de la matriz).
Debemos elegir el pH, debe ser un pH similar al de la proteína, para que la proteína se
quede retenida, y también la matriz que vamos a
utilizar.
Al eluir, las proteínas que antes saldrán son las que
tengan el punto isoeléctrico más cercano al pH que
hemos elegido.
La elución se puede hacer por competencia con H+
(variando el pH) o con otros iones (variando la
fuerza iónica).

Habrá tubitos en los que no haya proteínas.

Debemos teñir cada contenido de los tubitos para
identificar las proteínas.
Otra forma de identificarlas es haciendo incidir luz ultravioleta, ya que las proteínas son
capaces absorber la luz ultravioleta (porque contienen 3 aa aromáticos).
Lo que tengo que saber, ahora que sé dónde están las proteínas, es dónde está la
proteína que quiero purificar. Para ello usaré los ligandos, ya que cada proteína se une a
un ligando específico.
Al añadir el sustrato específico de la enzima, solo ella actuará, así puedo saber donde se
encuentra.
Cromatografía de exclusión o filtración molecular.
Podemos separar en base al tamaño que tengan las proteínas.
Se hace también en columna, y se usa una matriz sólida porosa, pero NO
tiene grupos cargados. La fase estacionaria (matriz) es un polímero
poroso. El tamaño de los poros determina la separación.
• Aquellas proteínas mayores que el tamaño del poro, no lo
pueden atravesar, por lo que rodea las microesferas (que son los
filtros) y salen antes (tiempo de retención pequeño), ya que no
tienen que ir atravesando todos los poros, porque no caben por
ellos.
• Las que sean más pequeñas sí que pueden pasar y salen después
(tiempo de retención grande).
El orden de erupción es de mayor a menor siempre (primero salen las de
mayor tamaño, y después las de menor, como ya hemos visto).
Después haremos lo mismo de antes: vemos dónde hay proteínas, y
luego identificamos nuestra proteína (la que realice su actividad).

Cromatografía de afinidad.
Esta es la más específica.
Se basa en la capacidad de las proteínas de unir ligandos (moléculas
pequeñas) específicos. Las uniones entre el ligando y la proteína son
interacciones débiles.
En las proteínas, los ligandos son sustratos o moléculas inhibidoras.
¿En qué consiste esta cromatografía?
- Se inmoviliza un ligando uniéndolo covalentemente a la matriz
inerte.
- Se pasa la muestra a separar por la columna, de forma que
sólo se une la proteína deseada (porque su ligando está
retenido).
Finalmente podemos eluir la proteína unida cambiando el pH o la
concentración de sales (fuerza iónica) o con una concentración
elevada del ligando libre (tendremos ligandos libres, que competirán con los retenidos
por las proteínas; las proteínas se acaban uniendo a los ligandos libres, porque hay más,
por lo que las proteínas, unidas ya al ligando libre, se caen, así las podemos identificar).

A pesar de que sea la cromatografía más específica, reduce el rendimiento.

 • Electroforesis.
Se aplica un campo eléctrico, y se consigue separar las partículas cargadas, porque
migrarán, en función de su carga, hacia un polo u otro.
Hay distintos tipos de electroforesis:
En función del soporte:
o Electroforesis en papel para aminoácidos.
Sirve para separar aa, en base a su distinta carga.
Los electrodos se encuentran sumergidos en la solución salina. el papel se encuentra
por encima de la solución, y los extremos de papel se sumergen, para que todo el papel
se empape.
Cargamos previamente la mezcla de aa en el centro. Inicias el campo eléctrico. Aquellos
aa cargados positivamente migran hacia el polo negativo y los negativos, hacia el polo
positivo. Tu eliges el pH correspondiente para conseguir la máxima separación de los aa.
- Aquellos aa que tengan el pto isoeléctrico igual al pH establecido, no se
desplazan.
- Aquellos que tengan el pto isoeléctrico menor que el pH, se desplazarán hacia el
polo positivo (porque tendrán carga negativa).
- Aquellos que tengan el pto isoeléctrico mayor que el pH, se desplazarán hacia el
polo negativo (porque tendrán carga positiva).

o Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Sirve para separar proteínas. El soporte es el gel de la poliacrilamida.
También se añade bisacrilamida, ya que esta hace que los poros sean más pequeños
(cuanto más eches, los poros son más pequeños y viceversa).
Añadimos un activador y la poliacrilamida adquiere la consistencia de gel. Se pone entre
dos cristales, para que adquiera forma de lámina (el gel). A continuación, añadiremos el
SDS para poder separar las proteínas.
 o Electroforesis en gel PAGE-SDS (continuación de la de gel de
poliacrilamida).
Las proteínas se separan según su tamaño.
Las proteínas que cargas arriba (las que vas echando en
los “cuenquitos”), se desplazan hacia abajo, es decir,
hacia el polo positivo. Esto ocurre porque se añade
SDS, que es un detergente aniónico, el cual
desnaturaliza a las proteínas (rompe las interacciones
débiles que mantienen la estructura terciaria).
Todas las proteínas de la mezcla tienen unido SDS, por
lo que todas tendrán carga negativa, por eso migran
hacia el polo positivo.

Las proteínas quedan separadas según el

tamaño: las más pequeñas atravesarán antes el
gel (porque pasan antes por los filtros) y
viceversa.
Según el tamaño de las proteínas, éstas se van
filtrando y por eso cada vez hay menos
proteínas en cada línea de bandas (como vemos
en la foto de la drcha).

El gel podemos teñirlo con colorantes…

Los carriles (las líneas de bandas) de los
extremos son marcadores de peso
molecular, que nos sirven de referencia
(son mezclas de proteínas de las que ya
sabemos su peso molecular, así podemos
tomarlo de referencia).
Cuanto más gruesa es la banda, mayor
cantidad de proteínas.
Tengo que ver cuánto se ha desplazado la
proteína para determinar su peso
molecular.
 Se utiliza un programa informático
para comprobar si se está purificando
bien una proteína para la que no hay
un protocolo.
Se puede usar la electroforesis en gel.
La técnica que finalmente nos permite
aislar la proteína definitivamente es la
cromatografía de afinidad, aunque
baja el rendimiento.
La electroforesis es una técnica
analítica.
No es del todo efectiva esta técnica,
por lo que posteriormente debemos
llevar a cabo el isoelectroenfoque.

o Isoelectroenfoque.
Nos permite separar las proteínas según su pI (pto isoeléctrico).
Preparamos el gel y colocamos la mezcla de proteínas cargadas, arriba del todo.
Las proteínas tienen un pH por encima del pI, por lo que tienen carga negativa, así que
se van desplazando hacia abajo (polo positivo).
En cuanto llegan al punto en el que pH=pI, ya no tienen carga negativa, se quedan
quietas, por eso cada proteína se queda parada en ese punto.
Luego se deben teñir para identificarlas.
 o Electroforesis bidimensional.
El problema es que hay proteínas distintas que
pueden tener el mismo pto isoeléctrico, por lo
que para que la técnica sea mucho más efectiva,
lo ideal es combinar isoelectroenfoque y gel en
lámina (que sí contiene SDS), lo que se conoce
como electroforesis bidimensional: se saca la
mezcla una vez terminada la isoelectroforesis, y
se dispone en un gel en lámina, y se separan
según el peso molecular.

Todas las proteínas que se encuentren en la

misma banda tienen mismo peso molecular y
distinto punto isoeléctrico, y las que se
encuentren en la misma fila/columna tienen
mismo punto isoeléctrico pero distinto peso
molecular.

Pero para poder detectar la proteína concreta que queremos estudiar, debemos llevar a
cabo la técnica de Western Blot:
Transferir las proteínas que están en el gel de forma electroforética (mediante campo
eléctrico). Colocas el papel en contacto con el gel, y al aplicar el campo eléctrico, las
proteínas se mueven hacia el papel (hacia el polo positivo, ya que están cargadas
negativamente). Las proteínas migran del gel al papel, y quedan retenidas en el papel.
Ahora después se incuba el papel con el anticuerpo específico que detectará a nuestra
proteína.
 • Centrifugación.
Permite separar partículas al someter la
mezcla a campos centrífugos elevados
(superiores a la aceleración de la gravedad).
Cuanto más grande es la partícula, mayor es
su velocidad de sedimentación.
Diferenciamos distintos tipos de
centrifugación:

o Centrifugación diferencial:
Se suele utilizar para separar orgánulos celulares, y se hace mediante la
centrifugación diferencial: centrifugaciones diferentes con cada vez mayor
velocidad y más tiempo.

o Fraccionamiento subcelular:
Las técnicas de centrifugación permiten
separar distintos orgánulos celulares, es lo
que se conoce como:
fraccionamiento subcelular.
Las partículas, a pesar de tener el mismo
tamaño, tienen distinta densidad, por lo
que se detienen cuando su densidad
coincide con el gradiente de densidad de
la sacarosa (la cual se introduce
previamente).

o Centrifugación en gradiente de densidad:

Es necesaria cuando en el precipitado

de la anterior centrifugación hay
partículas con distinta densidad, a
pesar de tener el mismo tamaño.
Extraemos el precipitado anterior y lo
sometemos a una centrifugación de
densidad.
Se hace un gradiente continuo de
sacarosa en el tubo.
Cargas la mezcla arriba y se la somete
a centrifugación, y empleamos
rotores.
Se detienen en el punto en el que su
densidad coincide con la de la
sacarosa, y así conseguimos
diferenciar las distintas partículas.