UNAM

FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA I

TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Y
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
INTEGRANTES:
Aguillon Monter Natalia
Caballero Rosas Santiago
Correa Hernandez Denise
Stegemann Orozco Adrián

FECHA DE ENTREGA: 30/03/2023

GRUPO: 5040

PROFESOR: Viviana Escobar Sánchez

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS PROTEICO: UN CUADRO COMPARATIVO

TÉCNICA PROPIEDADES DESCRIPCIÓN FIGURA REPRESENTATIVA

FUNDAMENTALES
Solubilidad de la proteína a Llamada precipitación por insolubilización por
un valor dado de salado o “salting out”. Se llevaba a cabo con
concentración salina. altas concentraciones de sales a la solución en
Constante que depende la que se encuentra la proteína para producir
fuertemente del pH y la una precipitación.
temperatura. La adición de las sales eliminará el agua de la
PRECIPITACIÓN El pH y la temperatura proteína hidratada dejando regiones
CON SALES varía con el tipo de sal y de hidrofóbicas en libertad de combinarse
proteína. intermolecularmente (Galatz, 1990).

La precipitación Para llevar a cabo esta técnica, se toma una

isoeléctrica es una técnica
de purificación de proteínas
que se basa en su punto
PRECIPITACIÓN isoeléctrico, el pH al cual la
ISOELÉCTRICA proteína tiene una carga
neta cero.
solución de proteínas a la que se modifica
gradualmente el pH del medio, logrando que la
proteína se precipite en su punto isoeléctrico.
__Esto es posible dado que la carga neta total
de la molécula es nula, provocando que la
repulsión electrostática entre las moléculas sea
mínima, y prevaleciendo las interacciones
hidrofóbicas proteína-proteína.
 Solución acuosa: Para Es una filtración molecular. Método para
estabilizar moléculas objeto d separar sustancias disueltas, cuyas masas
investigación es necesario moleculares difieren significativamente. Se
utilizar soluciones de fuerza basa en la diferencia en la velocidad de
iónica y pH definidos. difusión de tales sustancias a través de la
Temperatura: entre más alta membrana que separa las soluciones
sea la temperatura, mayor ser concentradas y diluidas
DIÁLISIS la velocidad de diálisis. A Una disolución macromolecular se introduce en
temperaturas elevadas, la el saco de diálisis, que se sumerge en un
viscosidad del solvente es volumen relativamente grande de disolvente
menor y la velocidad de nuevo. Las moléculas pequeñas pasan a través
difusión aumenta. de la membrana al fluido externo hasta que se
alcanza el equilibrio, las macromoléculas
permanecerán en el interior del saco de diálisis.

La cromatografía de Consiste en pasar una mezcla de proteínas a

intercambio iónico se basa través de una columna de resina cargada con
en la interacción reversible grupos funcionales que actúan como
entre las moléculas intercambiadores de iones. Las proteínas con
CROMATOGRAFÍA cargadas y los carga opuesta a la de la resina se unen más
DE INTERCAMBIO intercambiadores que fuertemente y, por lo tanto, se retienen en la
IÓNICO contienen grupos columna por más tiempo. Luego se puede eluir
funcionales cargados con la la proteína de interés lavando la columna con
misma carga que las un gradiente de sal o ajustando el pH.
moléculas a separar.
 La cromatografía de En esta técnica, una mezcla de proteínas se
exclusión molecular se pasa a través de una columna de resina porosa,
basa en la separación de que actúa como tamiz molecular. Las proteínas
moléculas según su tamaño de mayor tamaño no pueden penetrar en la
CROMATOGRAFÍA y forma. Las moléculas se resina y se eluyen primero, mientras que las
DE EXCLUSIÓN separan por medio de una proteínas de menor tamaño penetran en la
MOLECULAR matriz porosa que permite resina y se retienen por más tiempo. Luego se
el flujo de las moléculas puede eluir la proteína de interés lavando la
más pequeñas, mientras que columna con un tampón adecuado.
las moléculas más grandes
quedan excluidas y se
eluyen más rápidamente.

Se basa en interacciones Separa una mezcla compleja de un solo grupo

biológicas muy precisas de componentes. Estas interacciones
entre dos componentes, típicamente reversibles se utilizan para la
tales como interacciones purificación, en la que las moléculas conocidas
CROMATOGRAFÍA enzima-sustrato, como molécula se colocan sobre una matriz
DE AFINIDAD anticuerpos y antígenos, o sólida para formar una fase estacionaria
receptor y ligando. mientras los componentes se encuentran en la
fase móvil.
 La ultracentrifugación se Se utiliza una centrífuga de alta velocidad para
basa en la aplicación de una separar moléculas en solución en función de su
fuerza centrífuga muy alta coeficiente de sedimentación, que depende de
para separar partículas en la densidad y el tamaño molecular de la
solución según su tamaño y molécula. En la ultracentrifugación analítica, se
ULTRA densidad. La fuerza utiliza una centrífuga analítica para determinar
CENTRIFUGACIÓN centrífuga provoca la la masa molecular de una proteína en solución.
sedimentación de las En la ultracentrifugación preparativa, se utiliza
partículas, con las una centrífuga preparativa para separar
partículas más grandes y componentes en una mezcla en función de su
densas sedimentando más coeficiente de sedimentación.
rápido que las partículas
más pequeñas y ligeras.

Las proteínas presentan una Las proteínas se separan de una manera que
carga eléctrica neta si se preserva su conformación nativa (estructura
encuentran en un medio terciaria), las interacciones entre las
que tenga un pH subunidades (estructura cuaternaria e
diferente al de su punto interacciones proteína-proteínas) y la actividad
isoeléctrico y por eso tienen biológica. En este método, las proteínas se
ELECTROFORESIS la propiedad de desplazarse preparan y se hacen correr bajo condiciones no
NATIVA cuando se someten a un reductoras y no desnaturalizantes.
campo eléctrico.
La velocidad de migración
es proporcional a la
relación entre las cargas de
la proteína y su
masa.
 La velocidad a la que
migran las proteínas unidas
al SDS a través del gel
depende principalmente de
ELECTROFORESIS su tamaño, permitiendo
DESNATURALIZA estimar el peso molecular al
NTE compararlo con patrones
proteicos.
El isoelectroenfoque se
basa en la migración de
proteínas en un gradiente
ISOELECTRO de pH generado por la
ENFOQUE aplicación de un campo
eléctrico. Durante
proceso, las proteínas
migran a la posición donde
tienen su punto isoeléctrico.
La electroforesis en geles de poliacrilamida en
presencia de SDS ('SDS-polyacrilamide gel
electrophoresis').La electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato
sódico (SDS) permite la separación de
proteínas en función de su masa molecular. Se
incorpora el detergente SDS en un tampón de
migración. El SDS imparte una carga negativa
neta a las proteínas, enmascarando su carga
intrínseca. A medida que las proteínas se
separan en presencia de SDS y de reactivos
desnaturalizantes, se vuelven menos globulares
y más lineales.
En esta técnica, una muestra de proteínas se
carga en una tira de gel que contiene un
gradiente de pH, y se aplica un campo eléctrico
para mover las proteínas hacia el pH
correspondiente a su pI, donde no migran más
el y se separan en bandas. La técnica puede ser
seguida por una electroforesis en gel para
separar las proteínas aún más.
ELECTROFORESIS Técnica que puede Esta electroforesis comienza con electroforesis
DE DOS determinar muchas en la primera dimensión y luego separa las
biomoléculas de una moléculas en forma recta de la primera para
DIMENSIONES mezcla. Esta técnica crear un electroferograma en la segunda
consiste en dos métodos de dimensión. En la electroforesis de la primera
separación diferentes que dimensión, las moléculas se separan
han sido juntados entre sí: linealmente según su punto isoeléctrico. En la
la concentración segunda dimensión, las moléculas se separan
isoeléctrica y sodio dodecil luego a 90 grados del primer electroferograma
sulfato poliacrilamida gel según la masa molecular.
electroforesis. Esto
físicamente separa
compuestos a través de dos
ejes de un gel por sus
puntos isoeléctricos y sus
pesos moleculares.
 INMUNO La técnica utiliza tres
DETECCIÓN etapas para lograr esto:
separación por tamaño,
TIPO transferencia a un soporte
WESTERN BOLT sólido y, finalmente,
visualización mediante la
marcación de proteínas con
el uso de anticuerpos
primarios o secundarios
apropiados.
Mediante electroforesis en
gel se separan las proteínas
atendiendo al criterio que
se desee: peso molecular,
estructura, hidrofobicidad,
etc.
permite la detección de una sola proteína dentro
de una muestra biológica. La especificidad del
Western Blot se logra mediante el uso de un
anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo
único de la proteína de interés.
Se puede usar para indicar si la muestra expresa
la proteína de interés o para realizar
comparaciones cuantitativas de los niveles de
proteína entre diferentes muestras o grupos de
tratamiento.

INMUNO El ELISA se basa en la En la técnica de ELISA, se recubre una placa

DETECCIÓN unión específica entre un con la proteína de interés o un anticuerpo
antígeno y un anticuerpo. específico, se agrega la muestra y se incuba.
TIPO Los antígenos en una Después de varios lavados, se agrega un
ELISA muestra se unen a anticuerpo secundario con una enzima
(Enzyme-Linked anticuerpos específicos acoplada, otro lavado y se agrega un sustrato
Immunosorbent inmovilizados en una que produce una señal proporcional a la
Assay) superficie sólida. cantidad de proteína de interés presente en la
muestra.
 SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS ( determinación de la estructura primaria):

IDENTIFICACIÓN El cloruro de dansilo es La determinación de N-terminal de una cadena

DE N TERMINAL útil, ya que reacciona con peptídica es útil para ayudar al ordenamiento de
grupos amino y por lo tanto fragmentos en una cadena. Para el análisis de
CON CLORURO DE pueden enlazarse con este se busca hacer reaccionar el péptido con el
DANSILO aminas en las cadenas reactivo de cloruro de dansilo para
laterales. posteriormente hidrolizar la proteína y
finalmente determinar el aminoácido por
cromatografía y comparar con los estándares.

IDENTIFICACIÓN La hidrazina rompe enlaces Para esta determinación es necesaria la

DE C TERMINAL peptídicos y forma
derivados de hidrazina con
POR HIDRAZINA todos los aa excepto el
C-terminal, por lo que, el
terminal queda libre y los
demás como hidracidas
fragmentación de proteínas en péptidos, la
ordenación de estos fragmentos para
posteriormente secuenciar el ADN y finalmente
hacer la proteómica y ver la espectrofotometría
de masas.
IDENTIFICACIÓN Las exopeptidasas que
DE EXTREMOS actúan en el extremo
carboxilo se denominan
POR carboxipeptidasa las cuales
EXOPEPTIDASAS( liberan un único
carboxipeptidasas y aminoácido o un dipéptido
aminopeptidasas) en los extremos
C-terminales de la cadena
polipeptídica. Las enzimas
que hacen esta actividad en
el extremo amino son
llamadas aminopeptidasas y
pueden liberar aminoácidos
simples o tripéptidos.
Las aminopeptidasas eliminan la metionina
N-terminal de las proteínas secretadas y de
aquellas que pueden ser expresadas
heterólogamente. Las aminopeptidasas son
producidas por una amplia variedad de especies
microbianas, incluyendo bacterias y hongos.
Las carboxipeptidasas se clasifican en tres
grupos, basándose en la naturaleza de los
residuos de aminoácidos en su sitio activo.

DEGRADACIÓN Se marca el aa N-terminal Este método ayuda a la secuenciación de

DE EDMAN con fenilisotiocianato en un aminoácidos en un péptido. El residuo
medio alcalino. Se hidroliza amino-terminal se marca y escinde del péptido
el enlace peptídico entre los sin alterar los enlaces peptídicos entre otros
residuos 1 y 2, residuos de aminoácidos.
posteriormente se identifica
el derivado del residuo
N-terminal por HPLC, se
puede repetir el proceso
para determinar el 2º
aminoácido y puede
secuenciarse el polipéptido
desde el extremo N-
terminal
PROTEOLISIS Se lleva a cabo en el La proteólisis es la degradación de proteínas
SECUENCIA proteosoma, que actúa en el mediante enzimas específicas, llamadas
citosol, este es una proteasas.
ESPECÍFICA CON estructura cilíndrica
TRIPSINA, formada por proteasas y Este proceso de degradación se lleva a cabo
QUIMIOTRIPSINA dos extremos de complejos durante la digestión.
Y BROMURO DE proteicos que alimentan la
CIANÓGENO cámara interna del cilindro
al reconocer las proteínas.
(CNBr)

SECUENCIA POR Está basada en la obtención Un espectro de masas es una información

ESPECTROSCOPIA de iones a partir de bidimensional que representa un parámetro
moléculas orgánicas en fase relacionado con la abundancia de los diferentes
DE MASAS (EM) gaseosa; una vez obtenidos tipos de iones en función de la relación
estos iones, se separan de masa/carga de cada uno de ellos.
acuerdo a su masa y su
carga, y finalmente se
detectan por medio de un
dispositivo especial para
esto.
FUENTES DE CONSULTA:
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